惠民福利国产精品午夜一级毛片精品_高清无码操逼免费观看的毛片_惠民福利国产又色又爽又黄的在线观看_91精品久久久久中文字幕_99免费视频在线_欧洲熟妇AV一级_日本不卡在线视频二区三区_嗯…啊摸湿奶头免费视频_国产精品免费观看无遮挡_少妇宾馆粉嫩10p

針對上述問題，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院Fu Jingke、趙杰團隊在雄性RA小鼠模型中，將天然微生物鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis，SP）作為滑膜炎癥和破骨細胞分化的調節(jié)劑。SP可減少滑膜巨噬細胞中過量的活性氧，下調促炎性細胞因子，并使促炎性M1樣巨噬細胞重編程為抗炎性M2樣表型，抑制滑膜炎并重塑氧化還原平衡（圖1A）。SP還能有效抑制破骨細胞的活化，阻斷骨侵蝕的進展。將SP包裹于巨噬細胞膜形成仿生納米系統(tǒng)（SP@M），使其具有免疫逃逸與滑膜定位能力。機制上，SP@M可增強LC3介導的自噬，促進KEAP1的降解與NRF2的激活，上調SOD2、HO-1等抗氧化蛋白，阻斷ROS引發(fā)的級聯(lián)炎癥反應，從而抑制巨噬細胞炎性激活，減輕骨破壞，為RA的系統(tǒng)性干預提供有效策略。該文章于2025年5月13日以《Engineered Spirulina platensis for treating rheumatoid arthritis and restoring bone homeostasis 》為題發(fā)表于《Nature Communications》（DOI: 10.1038/s41467-025-59579-4）。 

（1）SP通過巨噬細胞的炎癥調節(jié)恢復滑膜內穩(wěn)態(tài)

鈍頂螺旋藻（SP）是具有天然螺旋形態(tài)的原核光合微生物，長度100 - 500μm（圖1B、C）。SP中葉綠素的自發(fā)熒光使其具有強烈紅色熒光（圖1D），表明其在生物成像中有潛在應用。SP的UV - vis吸收光譜在440和680 nm附近有明顯吸收，源于其細胞內豐富的葉綠素（圖1E），620 nm附近的寬吸收帶則為SP中特異性藻藍蛋白所致。

圖1 基于螺旋藻（SP）的治療劑對類風濕性關節(jié)炎（RA）骨穩(wěn)態(tài)重塑的機制。（A）巨噬細胞膜工程化SP（SP@M）靶向遞送示意圖，SP@M通過減輕滑膜炎癥和獨立抑制破骨細胞活化重塑RA骨穩(wěn)態(tài)，SP經(jīng)LC3介導的自噬和泛素介導的蛋白酶體降解加速KEAP1蛋白降解，KEAP1失活后NRF2核轉位增加，減輕CIA小鼠模型滑膜炎癥和改善RA；（B）SP細胞明視野顯微鏡圖像；（C）SP細胞掃描電鏡圖像；（D）SP細胞熒光圖像；（E）SP細胞紫外-可見吸收光譜

LPS 刺激導致 RAW264.7 細胞內 ROS 過度產(chǎn)生并出現(xiàn)明顯綠色熒光，而 SP 處理后細胞熒光強度顯著降低且呈劑量依賴性（圖 2A，B）。RT-qPCR 分析表明，LPS 刺激使 RAW264.7 細胞中促炎細胞因子 mRNA 表達顯著上調，SP 治療則使其呈劑量依賴性下調，證實 SP 具有抗炎作用（圖 2C）。SP 處理還呈劑量依賴性降低 M1 樣巨噬細胞比例，增加 M2 樣巨噬細胞比例，抑制促炎 M1 樣巨噬細胞極化，促進抗炎 M2 樣巨噬細胞分化（圖 2D-F）。此外，RT-qPCR 分析顯示，SP 處理組中 M2 樣巨噬細胞標志物 CD206、IL-10、Arg-1 的 mRNA 表達顯著上調（圖 2G）。綜上，SP 可調節(jié)氧化應激，促進巨噬細胞向抗炎表型重編程，有助于緩解 RA 特定環(huán)境下的炎癥，維持滑膜穩(wěn)態(tài)。

圖2 SP通過減輕巨噬細胞的氧化應激和炎癥調節(jié)來恢復滑膜穩(wěn)態(tài)。（A）不同濃度SP和脂多糖刺激巨噬細胞24 h后，分析巨噬細胞內DCFH-DA的熒光光譜；（B）圖A中DCFH-DA相對熒光強度的定量；（C）實時熒光定量PCR分析LPS和不同濃度SP刺激24 h后巨噬細胞中TNF-α、iNOS、IL-1、IL-6和IL-12的表達；（D）流式細胞術檢測LPS和不同濃度SP刺激24 h后巨噬細胞CD 86表達變化；（E）流式細胞術檢測白細胞介素-4（20 ng/mL）和不同濃度SP刺激巨噬細胞24 h后CD 206和CD 11b的表達；（F）圖D和E中CD 86或CD 206標記陽性細胞的定量；（G）RT-qPCR分析IL-4和不同濃度SP刺激巨噬細胞24 h后CD 206、IL-10和Arg-1的表達

（2）SP通過抑制破骨細胞活化阻斷骨侵蝕的進展

如圖3A、圖3B所示，RANKL誘導的Bcl 4具有明顯骨誘導特征，包括更多TRAP染色陽性細胞和F-肌動蛋白染色成熟破骨細胞形成。而SP處理后，TRAP陽性細胞數(shù)量和面積以及破骨細胞平均面積均顯著減少，呈劑量依賴性，表明SP抑制破骨細胞分化。圖3C顯示SP處理下調RANKL誘導的BcR中NFATc 1、c-Fos和CTSK基因表達。圖3D、E表明SP處理后，這些蛋白在0、1、3、5天水平均受抑制。圖3F、G顯示SP阻斷NF-κB信號通路中P65及MAPK信號通路中ERK和P38的磷酸化。圖3H、I顯示SP抑制P65和P38蛋白磷酸化及在RANKL誘導的BclB中P38和P65蛋白易位。總之，SP有效阻止破骨細胞分化，恢復骨平衡，減輕RA骨侵蝕。

圖3 SP通過抑制破骨細胞活化阻斷骨侵蝕進展。（a）用M-CSF和RANKL刺激BMM，再用不同劑量SP處理5d，進行TRAP染色和F-actin熒光染色；（b）定量圖a中TRAP染色破骨細胞數(shù)量、面積及F-actin帶面積；（c）用M-CSF和RANKL刺激BMM后，SP處理5d的Nfatc1、C-fos和Ctsk的RT-qPCR分析；（d）用M-CSF和RANKL刺激后，SP處理BMM的NFATc1、c-Fos和Ctsk的WB分析；（e）圖d中NFATc1、c-Fos和Ctsk灰度值的半定量；（f）用M-CSF和RANKL刺激后，SP處理BMM的磷酸化-P38、P38、p-ERK、ERK、IκBα、p-P65和P65的WB分析；（g）圖f中p-P38/P38、p-ERK/ERK、IκBα和p-P65/P65灰度值的半定量；（h）用M-CSF和RANKL刺激后，SP處理BMM的p-P38和p-P65免疫熒光分析；（i）圖h中p-P38和p-P65的IOD/DAPI定量

（3）SP通過NRF 2/KEAP 1信號通路重建體外骨穩(wěn)態(tài)

如圖4A、B所示，SP在巨噬細胞中上調SOD2、HO-1、NRF2、GPX1和GPX4表達，劑量依賴性下調KEAP1。圖4C、D顯示，SP抑制KEAP1，同時增加RANKL刺激破骨細胞中上述蛋白表達。圖4E表明，研究者用CHX、MG132和Chlq探索巨噬細胞中潛在機制。圖4F、G顯示，SP促進KEAP1蛋白降解，且該過程可被MG132阻礙，表明KEAP1降解依賴蛋白酶體途徑。圖4H顯示，KEAP1多泛素化水平隨SP劑量增加，證實SP增強KEAP1泛素化修飾。圖4I、J顯示，Chlq可阻斷SP介導的KEAP1降解，表明自噬途徑也參與其中。圖4K、L顯示，SP降低KEAP1平均熒光強度，劑量依賴性增加KEAP1與阿糖胞苷共定位。圖4M、N顯示，SP增強LC3平均熒光強度，促進LC3與KEAP1共定位。這些結果表明SP促進自噬體對KEAP1的吞噬。

圖4 體外SP通過NRF2/KEAP1信號通路重塑骨穩(wěn)態(tài)。（A）不同劑量SP刺激巨噬細胞的SOD2、HO-1、NRF2、GPX1、GPX4和KEAP1的WB分析；（B）圖A中SOD2、HO-1、NRF2和KEAP1灰度值的半定量；（C）用M-CSF、RANKL和SP刺激24 h的BMM的SOD2、HO-1、NRF2、GPX1、GPX4和KEAP1的WB分析；（D）圖C中SOD2、HO-1、NRF2和KEAP1灰度值的半定量；（E）KEAP1蛋白降解試驗示意圖；（F）不同劑量SP、CHX和MG132刺激巨噬細胞8 h后HO-1、NRF2、KEAP1和GPX4的WB分析；（G）圖F中NRF2和KEAP1灰度值的半量化；（H）用MG132（10μM）和不同劑量SP處理的293T細胞，HA-KEAP1和Myc-泛素質粒與HA標記珠子進行KEAP1的HUbiquitylation分析；（I）不同劑量SP、CHX和Chlq刺激8 h的巨噬細胞中HO-1、NRF2、KEAP1和GPX4的WB分析；（J）圖I中NRF2和KEAP1灰度值的半定量；（K）不同劑量SP刺激24 h后巨噬細胞KEAP1和泛素的免疫熒光分析；（L）定量圖K中KEAP1的平均熒光強度和融合顏色；（M）不同劑量SP刺激巨噬細胞24 h后KEAP1和LC3的免疫熒光分析；（N）定量圖M中KEAP1、LC3的平均熒光強度和合并顏色

（4）SP @M的制備及其對CIA小鼠踝關節(jié)炎的靶向治療

通過低滲裂解、均質擠出、梯度離心和低溫超聲處理從RAW 264.7細胞中分離得到MCM（圖5A）。SP經(jīng)攪拌處理后片段化，長度為5 – 100 μm，其自發(fā)熒光和活力保持良好（圖5B、C）。將片段化SP過濾后，與MCMs共擠出，制得SP@M。透射電鏡觀察顯示，SP@M表面部分被巨噬細胞膜修飾（圖5D、E）。考馬斯亮藍染色分析表明，MCMs蛋白成功易位到SP@M上（圖5F）。SDS - PAGE分析顯示，SP@M中保留了MCMs的重要蛋白條帶，如TNFR2（50kDa）、CCR2α（35kDa）和CD36（36kDa）（圖5G）。在CIA小鼠模型中，SP@M組在0.5小時內爪中即檢測到熒光信號，且24小時后信號仍強烈，而SP組爪部熒光信號較弱（圖5H、I）。

圖5 MCMs - 工程化SP（SP@M）的制備、表征及其對CIA小鼠炎癥踝關節(jié)的靶向遞送。（A）SP@M準備過程的示意圖；（B、C）SP@M的明場和熒光顯微鏡圖像；（D、E）SP（D）和SP@M（E）的透射電鏡圖像；（F）用SDS - PAGE和考馬斯亮藍染色分析SP、MCMs和SP@M的蛋白質組成；（G）SP、MCMs和SP@M組TNFR2、CCR2α和CD36的WB分析；（H）靜脈內給予Cy5標記SP或Cy5標記SP@M后CIA小鼠的體內熒光成像；（I）爪部活體熒光信號的時間依賴性定量數(shù)據(jù)，以及24 h時四肢等組織熒光信號的定量數(shù)據(jù)

（5）SP@M可實現(xiàn)體內滑膜穩(wěn)態(tài)、骨恢復和軟骨保護

在CIA小鼠模型中研究了SP和SP@M的體內治療效率（圖6A）。CIA小鼠爪部出現(xiàn)嚴重腫脹和紅斑（圖6B）。隨著時間推移，生理鹽水組爪腫脹厚度增加（圖6B、C），而MCMs和SP對爪腫脹無明顯改善。SP@M顯著改善爪腫脹，效果優(yōu)于MTX。通過顯微計算機斷層掃描分析骨侵蝕率（圖6D），SP@M顯著抑制骨侵蝕，優(yōu)于MTX組，且侵蝕指數(shù)定量分析顯示SP@M處理骨侵蝕恢復效果最好（圖6E）。SP@M處理后距骨骨水平的骨體積/總體積（BV/TV）顯著更高，表明其改善RA誘導的骨降解效果更好。SP@M和MTX治療可減輕小鼠下肢疼痛，增加疼痛反射的閾值和潛伏期（圖6F）。組織病理學分析顯示，生理鹽水組踝關節(jié)組織有廣泛炎性細胞浸潤、滑膜增生、骨侵蝕和軟骨破壞（圖6G、H），而SP@M治療顯著減少滑膜炎，減輕滑膜中SM浸潤，恢復骨表面侵蝕、距骨破壞和關節(jié)軟骨變性，且SP@M組炎性區(qū)域中破骨細胞數(shù)量顯著減少（圖6G、I）。免疫組織化學分析顯示，生理鹽水組TNF-α表達顯著升高，而SP@M治療后TNF-α標記的陽性細胞顯著減少（圖6J、K）。

圖6 SP@M能夠在體內實現(xiàn)滑膜穩(wěn)態(tài)、骨恢復和軟骨保護。（A）CIA小鼠模型和相關治療策略的方案；（B）圖A所示小鼠右下肢的大體照片；（C）圖A中所示小鼠的平均爪厚度和臨床評分的定量；（D）圖A所示小鼠右踝關節(jié)和聚焦距骨的三維微計算機斷層掃描分析；（E）圖C所示小鼠距骨的侵蝕指數(shù)和骨體積/總體積（BV/TV）的定量；（F）圖A所示的小鼠在機械和熱疼痛相關反應實驗中閾值的定量；（G）圖A中所示小鼠踝關節(jié)聚焦區(qū)域的HE染色、TRAP染色和SO/FG染色；（H）圖G所示小鼠石蠟切片“SMASH”評分的定量；（I）定量圖G所示小鼠石蠟切片中TRAP陽性破骨細胞的數(shù)目；（J）圖A所示小鼠踝關節(jié)病灶區(qū)域TNF-α的免疫組織化學染色；（K）圖J所示小鼠踝關節(jié)中TNF-α的相對積分光密度（IOD）值的定量

KEGG分析（圖7B）和GSEA（圖7C）顯示氧化磷酸化富集，證實SP@M處理后的氧化還原調節(jié)。KEGG分析（圖7B）還顯示破骨細胞分化信號通路參與，與SP@M抑制單核破骨細胞分化一致。GO分析顯示“免疫系統(tǒng)過程”“炎癥反應”和“MAP激酶活性的負調節(jié)”參與生物學過程（圖7A）。SP@M治療后，氧化應激、炎癥反應和破骨細胞分化得到調節(jié)，恢復骨免疫穩(wěn)態(tài)，緩解RA。與生理鹽水組相比，SP@M可抑制上調的KEAP1信號強度，恢復降低的NRF2信號強度（圖7D、E）。免疫熒光分析顯示，SP@M調節(jié)泛素與KEAP1的共定位，且SP@M處理后LC3與KEAP1的相互作用增加（圖7F），與體外結果一致。

圖7 SP@M通過NRF2/KEAP1信號通路在體內恢復CIA小鼠模型的骨免疫穩(wěn)態(tài)。（A）生理鹽水組和SP@M組的生物學過程基因本體（GO）分析；（B）生理鹽水組和SP@M組的Kyoto基因和基因組百科全書（KEGG）分析；（C）生理鹽水組和SP@M組氧化磷酸化信號通路的基因集富集分析（GSEA）；（D）免疫熒光法檢測RA小鼠踝關節(jié)石蠟切片病灶區(qū)KEAP1和NRF2的表達；（E）KEAP1和NRF2的積分光密度（IOD）/DAPI定量，如圖D所示；（F）免疫熒光法檢測RA小鼠踝關節(jié)石蠟切片病灶區(qū)KEAP1、泛素、LC3的表達；（G）SP@M通過調節(jié)巨噬細胞和破骨細胞來抑制滑膜炎癥和破骨細胞分化，從而在體內拮抗RA小鼠關節(jié)炎性反應，保護骨組織，恢復關節(jié)軟骨