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安徽中醫(yī)藥大學郭建團隊針對牙周炎的臨床治療局限性，開發(fā)了一種負載銀納米顆粒（AgNPs）和槲皮素/咖啡酸苯乙酯脂質復合物（CQ-ML）的智能水凝膠（A/CQ-ML@Gel）。該水凝膠整合了抗菌（AgNPs/殼聚糖）、抗炎（槲皮素調控PINK1/Parkin介導的線粒體自噬以清除ROS）和促骨再生（CAPE增強牙周膜干細胞成骨分化）功能，通過程序化釋藥和響應性凝膠特性，為牙周炎的綜合治療提供了新的策略和思路。該文章于2025年3月17日以《Chitosan-P407-PNIPAM hydrogel loaded with AgNPs/lipid complex for antibacterial, inflammation regulation and alveolar bone regeneration in periodontitis treatment》為題發(fā)表于《International Journal of Biological Macromolecules》（DOI：10.1016/j.ijbiomac.2025.142080)。

A/CQ-ML@Gel對牙周炎進行三模式治療的示意圖

（1）CQ-ML和AgNP的制備和表征

CQ-ML的粒徑為144.5 ± 0.40 nm，zeta電位為-45.4 ± 0.36 mV，與CAPE-L相近，表明其外層由脂質膜包裹（圖1A）。透射電鏡結果顯示，Qu-MEs呈透明球形，粒徑約30 nm（圖1B），CQ-ML為“小包大”結構，與文獻報道一致。熒光共振能量轉移（FRET）實驗表明，DiO/DiI-ML的FRET比率顯著高于DiI + DiO混合物（P < 0.0001），表明外層脂質膜與內部微乳間距<10 nm（圖1C）。CQ-ML對槲皮素和咖啡酸苯乙酯的包封率分別為93.47 ± 0.06%和90.98 ± 0.94%。AgNPs粒徑為45.48 ± 0.208 nm（制備方法未提及）。A/CQ-ML@Gel在37 ℃下表現(xiàn)出快速且穩(wěn)定的溫度敏感性液-固相轉變（圖1D）。掃描電鏡（SEM）顯示A/CQ-ML@Gel和CS-P407-PNIPAM內部結構為不規(guī)則網(wǎng)狀，孔徑約200 μm，可實現(xiàn)藥物持續(xù)釋放（圖1E）。流變學測試表明，CS-P407-PNIPAM在37 ℃時粘度最高（圖1F），高粘度有利于藥物在牙周袋內滯留和緩慢釋放。A/CQ-ML@Gel保持與CS-P407-PNIPAM相似的剪切稀化性質（圖1G），注射時流動性好。儲能模量和損耗模量隨溫度升高而增加，G′始終高于G″，表明A/CQ-ML@Gel可抵抗牙周袋外力（圖1H、圖1I）。CQ-ML呈程序性釋放特征，Qu先釋放，CAPE后釋放，而在A/CQ-ML@Gel中釋放順序相反（圖1J）。A/CQ-ML@Gel具有pH敏感性降解性能，在pH 3.6時溶解度>90%，在pH 7.4時溶解度僅為8.03 ± 1.44%（圖1K）。

圖1 CQ-ML和A/CQ-ML@Gel的表征。（a）Qu-ME、CAPE-L和CQ-ML的粒度分布；（b）Qu-ME、CAPE-L和CQ-ML的TEM圖像；（c）DiI + DiO和DiI/DiO-ML的FRET效應；（d）25℃和37℃下A/CQ-ML@Gel的外觀；（e）CS-P407、CS-P407-PNIPAM和A/CQ-ML@Gel的SEM圖像；（f）37℃下PNIPAM、CS-P407、CS-P407-PNIPAM的粘度（剪切速率為0.1至100 1/s）；（g）剪切速率為0.1~100 1/s時，A/CQ-ML@Gel的粘度隨剪切速率的變化；（h）37℃下CS-P407-PNIPAM和CS-P407的儲存模量和損耗模量（G′和G″）隨溫度變化；（i）37℃下A/CQ-ML@Gel的儲存模量和損耗模量（G′和G″）隨溫度變化；（j）Qu和CAPE從CQ-ML或A/CQ-ML@Gel中的體外釋放曲線；（k）A/CQ-ML@Gel在pH 7.4和pH 3.6條件下的質量殘留率。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，n=8

（2）A/CQ-ML@凝膠的體外抗菌作用

A/CQ-ML@Gel對牙周炎關鍵病原體P.g具有體外抗菌作用。掃描電鏡觀察顯示，對照組P.g表面光滑、形態(tài)規(guī)則，而AgNP組P.g膜出現(xiàn)明顯缺陷和形態(tài)變化（圖2A）。CS-P407-PNIPAM組也觀察到類似的細菌膜破壞，歸因于殼聚糖的抗菌特性。A/CQ-ML@Gel組中P.g膜缺陷和形態(tài)破壞最為顯著，表明其整合了AgNP和殼聚糖的抗菌作用（圖2B）。吸光度檢測結果表明，AgNPs、CS-P407-PNIPAM和A/CQ-ML@Gel組的懸液吸光度值均顯著低于對照組，說明A/CQ-ML@Gel中的AgNPs和CS-P407-PNIPAM組分可抑制P.g增殖?；?死染色結果表明，Qu-MEs、CAPE-L和CQ-ML對大腸桿菌無明顯抑菌作用，但A/CQ-ML@Gel處理的P.g大部分死亡（圖2C）。

圖2 A/CQ-ML@Gel的體外抗菌作用。（a）掃描電鏡觀察P.g形態(tài)特征，白色箭頭示細菌膜缺陷；（b）不同實驗組治療后P.g的吸光度值，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=8，*P<0.0001；（c）不同實驗組治療后P.g的活/死染色

（3）巨噬細胞攝取和巨噬細胞表型重塑

使用C6熒光標記物標記納米顆粒以評估細胞攝取。C6、C6-ME、C6-L和C6-ML與RAW264.7細胞共孵育2小時后，熒光顯微鏡觀察顯示，C6-ML和C6-L處理的細胞綠色熒光顯著，C6-ML的細胞攝取與脂質體相似（圖3A）。流式細胞術定量結果表明，巨噬細胞對C6-ML的攝取顯著高于其他組（圖3B）。Qu和CAPE在25 μM濃度下無明顯細胞毒性，且CQ-ML對RAW264.7細胞無顯著細胞毒性（圖3C）。通過流式細胞術檢測CD86（M1型標記物）和CD206（M2型標記物），以評估巨噬細胞表型。LPS誘導的RAW264.7細胞模型中，Qu-MEs處理的巨噬細胞CD206/CD86比值高于CAPE-L處理的巨噬細胞，表明Qu-MEs對M2表型的調節(jié)作用更強（圖3D）。

圖3 巨噬細胞攝取和表型極化研究。（a）C6、C6-ME、C6-L和C6-ML組細胞內綠色熒光；（b）流式細胞術定量經C6、C6-ME、C6-L和C6-ML處理的巨噬細胞熒光，數(shù)據(jù)為平均值±標準差，n=3，**P<0.01，*P<0.0001；（c）不同濃度Qu或CAPE的細胞活力，以及CAPE+Qu、CAPE-L+Qu-ME、CQ-ML處理的RAW264.7細胞（CAPE：25 μM，Qu：4 μM）的細胞活力，數(shù)據(jù)為平均值±SD，**P<0.01，*P<0.001，*P<0.0001；（d）流式細胞儀檢測不同處理巨噬細胞散點圖

（4）CQ-ML調節(jié)PINK 1/Parkin-ROS級聯(lián)反應抑制炎癥

CQ-ML對巨噬細胞炎癥因子的抑制作用可能與PINK1/Parkin-ROS信號通路有關。實驗結果顯示，與含槲皮素的制劑相比，CAPE-L處理組PINK1和Parkin表達水平較低，而CQ-ML處理顯著增加PINK1和Parkin表達，啟動線粒體自噬（圖4A-D）。免疫熒光和流式細胞術檢測表明，LPS誘導的RAW264.7細胞中，CQ-ML表現(xiàn)出最強的ROS生成抑制能力，這歸因于槲皮素促進線粒體自噬及脂質復合物的高細胞攝取率（圖4E-G）。這些結果表明，CQ-ML通過調控PINK1/Parkin-ROS級聯(lián)，發(fā)揮以槲皮素為主導的線粒體自噬作用，從而抑制炎癥。

圖4 CQ-ML調節(jié)巨噬細胞中PINK1/Parkin-ROS級聯(lián)反應。（a）免疫熒光檢測各組線粒體形態(tài)及PINK1和Parkin共定位；（b）ImageJ繪制各組PINK1和Parkin的3D表面圖；（c，d）ImageJ定量PINK1和Parkin相對熒光強度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=8，*P<0.05，**P<0.01，*P<0.0001；（e）各組巨噬細胞中DCFH-DA熒光表達；（f）ImageJ定量各組相對DCFH-DA熒光強度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=8，*P<0.05，*P<0.0001；（g）流式細胞術定量各組處理的巨噬細胞中DCFH-DA熒光強度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=8，*P<0.0001

（5）CQ-ML促進牙周膜干細胞的成骨分化（體外研究）

 CQ-ML對牙周膜干細胞（PDLSCs）成骨分化能力的調控作用研究結果顯示，槲皮素（Qu）和咖啡酸苯乙酯（CAPE）濃度低于25 μM時對PDLSCs無明顯細胞毒性（圖5A），CAPE+Qu、CAPE-L+Qu-MEs和CQ-ML處理組（CAPE：25 μM，Qu：4 μM）也未觀察到顯著毒性。堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅染色結果顯示，正常對照組經成骨誘導培養(yǎng)基刺激后ALP陽性染色區(qū)域和礦化結節(jié)形成明顯，而LPS處理的模型組較弱。CQ-ML和CAPE-L處理組均顯示出顯著的ALP陽性染色區(qū)域和礦化結節(jié)形成（圖5B-C）。定量分析表明，CQ-ML和CAPE-L處理組的ALP濃度分別是模型組的1.70倍和1.48倍（圖5D-E）。

圖5 CQ-ML促進PDLSCs體外成骨分化。（a）不同濃度Qu或CAPE的細胞活力，以及CAPE+Qu、CAPE-L+Qu-ME、CQ-ML處理的PDLSCs細胞活力，數(shù)據(jù)為平均值±SD，*P<0.001，*P<0.0001；（b）各制劑處理的PDLSCs的ALP和茜素紅染色；（c，d）各制劑處理的PDLSCs中ALP或茜素紅的相對面積，數(shù)據(jù)為平均值±SD，通過ImageJ定量，*P<0.05，**P<0.01，*P<0.001，*P<0.0001；（e）各制劑處理的PDLSCs上清液中ALP濃度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=8，**P<0.01，*P<0.001

（6）A/CQ-ML@Gel在體治療牙周炎的效果及生物安全性評估

通過絲線結扎聯(lián)合LPS注射法建立SD大鼠牙周炎模型（圖6A）。4周治療后，A/CQ-ML@Gel組牙齦出血消失，牙齦組織再生（圖6B-C），牙周袋深度（PD）顯著降低，效果與陽性對照藥派麗奧相當（圖6D-E）。H&E染色顯示模型組牙齦乳頭破壞、牙周韌帶結構紊亂，而治療組組織再生良好（圖6F）。Masson染色證實A/CQ-ML@Gel組膠原表達最高（圖6G）。

圖6 A/CQ-ML@Gel對牙周炎的體內治療作用。（a）牙周炎模型建立及給藥示意圖；（b-e）各組治療后2周、4周GI或PD值，數(shù)據(jù)為平均值±標準差，n=6，*P<0.05，**P<0.01，*P<0.001，*P<0.0001；（f）各組牙周組織H&E染色，（g）Masson染色，AB為牙槽骨，PDL為牙周膜

（7）A/CQ-ML@Gel通過調控PINK1/Parkin通路抑制牙周炎癥體內研究

A/CQ-ML@Gel的體內抗炎作用機制得到驗證。免疫熒光檢測顯示（圖7A-D），模型組因長期氧化應激導致PINK1/Parkin表達降低，而A/CQ-ML@Gel治療4周后顯著提升PINK1/Parkin表達，效果優(yōu)于單獨使用Qu-MEs@Gel或CAPE-L@Gel。免疫組化結果顯示（圖7E-G），促炎因子IL-6顯著減少，抗炎因子IL-10增加2.3倍。這證實了A/CQ-ML@Gel通過ROS-PINK1/Parkin通路促進巨噬細胞向M2型極化。在pDA-mBP@DAT和LIPUS刺激下，膜內成骨和軟骨內成骨均參與了骨修復過程（圖7G）。

圖7 A/CQ-ML@Gel促進PINK1/Parkin表達用于體內抗炎。（a，b）治療后牙周組織中PINK1和Parkin的表達；（c-d）PINK1和Parkin在各制劑處理的牙周組織中的相對強度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，使用ImageJ軟件定量，*P<0.001，*P<0.0001；（e）治療后牙周組織中IL-6和IL-10的免疫組化染色；（f-g）使用ImageJ定量各組牙周組織中IL-6和IL-10的相對強度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=3，**P<0.01，*P<0.0001。AB為牙槽骨，PDL為牙周膜

（8）A/CQ-ML@Gel促進牙槽骨再生

A/CQ-ML@Gel在體內促進牙槽骨再生的作用得到研究。Micro-CT結果顯示（圖8A），模型組上頜第一和第二磨牙的黃色間隙大于正常組，表明牙槽骨破壞明顯。A/CQ-ML@Gel和CAPE-L@Gel施用后黃色間隙變小，表明顯著的牙槽骨再生，而Qu-MEs@Gel的修復作用較弱。進一步研究牙周組織中成骨標志物OP.G和OPN的表達（圖8B），模型組OP.G、OPN表達減少，而A/CQ-ML@Gel可逆轉上述變化（圖8C-D）。RANKL-RANK信號誘導破骨細胞活化，加速牙槽骨破壞，而骨橋蛋白的高表達表明骨髓源性基質細胞沿成骨途徑分化，與無膠原骨水泥層的形成相關，有利于骨生長。

圖8 A/CQ-ML@Gel促進牙槽骨再生的體內實驗研究。（a）治療后各組大鼠上頜骨顯微CT圖像；（b）免疫組化染色觀察不同制劑對大鼠牙周組織中OP.G和OPN的影響；（c-d）使用ImageJ定量各制劑處理的大鼠牙周組織中OP.G和OPN的相對強度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=3，*P<0.001，*P<0.0001。AB為牙槽骨，PDL為牙周韌帶