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針對上述問題，華南理工大學付曉玲教授團隊，采用擠壓方法制備了含有活性線粒體的3μm去核MSCs衍生微囊泡Mito@euMVs。通過去除MSCs細胞核后進行擠壓制備工程化微囊泡（euMVs），顯著提升了線粒體包裹效率并形成了Mito@euMVs復合體，既保障了線粒體的活性，又避免了核基因外源轉移的風險。該研究系統(tǒng)評估了該載體對線粒體的包封保護能力、細胞遞送效能以及在高糖環(huán)境下的抗衰老作用，并創(chuàng)新性地設計了可溶性聚乙烯醇（PVA）微針貼片，實現(xiàn)了經(jīng)皮高效給藥。最終在糖尿病壓瘡大鼠模型中驗證了Mito@euMVs通過微針遞送的體內(nèi)治療效果，為線粒體替代療法提供了一種兼具安全性和靶向性的新型遞送策略。該文章于2025年5月23日以《Inhibition and Rescue ofHyperglycemia-Induced Cellular Senescence by Mitochondrial Transfer from Enucleated Mesenchymal Stem Cell-Derived Microvesicles for Chronic Wound Healing》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI: 10.1002/advs.202501612）。

研究示意圖

（1）去核骨髓間充質(zhì)干細胞衍生的3微米微泡包裹活性線粒體

流式細胞術顯示MSC去核率超過90%（圖1A），且去核MSCs保留完整質(zhì)膜和活性線粒體（圖1B）。通過脂質(zhì)體擠出技術，利用0.4 μm、1.0 μm和3.0 μm孔徑的PC膜制備euMV，其中3.0 μm euMV（Mito@euMV）線粒體包裹效率最高，流式細胞術分析顯示其線粒體含量為75.9%，顯著高于其他尺寸（圖1D）。熒光成像和HIS-SIM證實Mito@euMV保留完整膜結構并成功包封線粒體（圖1E）。流式細胞儀檢測顯示，70.7%的Mito@euMV粒度在1.0 - 4.0 μm之間（圖1F），其Zeta電位為-29.43 mV，表明穩(wěn)定性良好（圖1G）。透射電子顯微鏡（TEM）進一步確認Mito@euMV中存在線粒體（圖1H），且TMRM熒光染料檢測顯示線粒體膜電位維持72小時以上，表明線粒體保持活性（圖1I）。

圖1（A）流式細胞術評估的MSC去核率。（B）去核MSC的熒光圖像。（C）不同直徑（0.4 μm、1.0 μm、3.0 μm）去核MSC衍生euMV的熒光圖像。（D）流式細胞術分析不同直徑euMV中含線粒體的比例。（E）HIS-SIM熒光圖像顯示Mito@euMVs。（F）流式細胞術測定Mito@euMVs的粒徑分布。（G）動態(tài)光散射技術測量Mito@euMVs的Zeta電位。（H）Mito@euMVs的透射電子顯微鏡圖像。（I）流式細胞術評估Mito@euMVs中線粒體的活性

（2）Mito@euMVs抑制和挽救高血糖誘導的成纖維細胞和HUVECs衰老表型

在高糖（35 mM）培養(yǎng)基中培養(yǎng)的成纖維細胞和HUVEC表現(xiàn)出細胞衰老特征（圖2A）。經(jīng)Mito@euMV處理5天后，成纖維細胞（圖2B，C）和HUVEC（圖2F，G）中衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）陽性細胞比例顯著降低，而裸線粒體處理效果不明顯（圖2B，C）。在高濃度下，裸線粒體可降低HUVEC中SA-β-Gal陽性細胞比例，但效果不如Mito@euMV（圖2F，G）。酶聯(lián)免疫吸附法檢測顯示，Mito@euMV處理后，衰老成纖維細胞（圖2H）和HUVEC（圖2D）中SASP因子IL-6和TNF-α水平顯著降低。此外，Mito@euMV顯著下調(diào)成纖維細胞中衰老相關基因p53、p16、p21和ZBP1的表達（圖2E），同時上調(diào)促進傷口愈合的關鍵因子TGF-β。在HUVEC中，Mito@euMV顯著下調(diào)衰老相關基因p16和p21的表達，上調(diào)與功能相關的VEGF、bFGF和eNOS基因表達（圖2I），表明其改善了HUVEC功能。

圖2（A）誘導衰老細胞及處理示意圖。成纖維細胞或HUVEC暴露于35 mM高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基5天誘導衰老。（B）高糖誘導衰老成纖維細胞中SA-β-Gal的表達，有/無Mito@euMVs或裸線粒體處理的明場圖像。（C）SA-β-Gal陽性成纖維細胞比例。（D）通過ELISA檢測Mito@euMVs處理的衰老成纖維細胞條件培養(yǎng)基中SASP因子IL-6和TNF-α的濃度。（E）通過qPCR分析成纖維細胞中衰老相關基因（p53、p16、p21、ZBP1）及促修復基因（TGF-β）的表達。（F）高糖誘導衰老HUVEC中SA-β-Gal的表達，有/無Mito@euMVs或裸線粒體處理的明場圖像。（G）SA-β-Gal陽性HUVEC比例。（H）通過ELISA檢測Mito@euMVs處理的衰老HUVEC條件培養(yǎng)基中SASP因子IL-6和TNF-α的濃度。（I）通過qPCR分析HUVEC中衰老相關基因（p16、p21）及血管生成基因（VEGF、bFGF、eNOS）的表達

（3）Mito@euMVs通過轉移線粒體抑制和挽救高血糖誘導的細胞衰老

HIS-SIM顯示，經(jīng)Mito@euMV處理24小時后，衰老成纖維細胞（圖3A）和HUVEC（圖3H）中Mito@euMV包裹的線粒體（紅色）被成功轉移至受體細胞，并部分整合到受體細胞的線粒體網(wǎng)絡中，且有少量與自噬體（MDC，綠色）共定位。這表明轉移的線粒體保持活性并可能在細胞內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用。Mito@euMV處理后，衰老成纖維細胞（圖3B，C）和HUVEC（圖3I，J）的線粒體膜電位顯著增加，接近非衰老細胞水平。此外，Mito@euMV顯著減輕了衰老成纖維細胞（圖3D，E）和HUVEC（圖3K，L）中異常增加的ROS產(chǎn)生?；瘜W發(fā)光法檢測結果顯示，衰老成纖維細胞和HUVEC的ATP產(chǎn)生顯著減少，而Mito@euMV處理后ATP產(chǎn)生增加（圖3F，M），且衰老細胞中顯著升高的ADP/ATP比率在Mito@euMV處理后顯著降低（圖3G，N）。這些結果表明Mito@euMV顯著改善了衰老成纖維細胞和HUVEC的線粒體功能。進一步實驗中，魚藤酮抑制線粒體功能（圖3O）可顯著逆轉Mito@euMV的作用，魚藤酮處理組中SA-β-Gal陽性細胞比例與衰老對照組相似（圖3P-S），表明Mito@euMV對細胞衰老的抑制和拯救主要歸因于euMV內(nèi)包裹的線粒體。

圖3（A）HIS-SIM熒光圖像顯示MSC線粒體通過Mito@euMVs轉移到成纖維細胞。（B）TMRM染色顯示成纖維細胞線粒體膜電位的熒光圖像。（C）流式細胞術評估成纖維細胞中TMRM熒光強度。（D）DCFH-DA探針檢測成纖維細胞內(nèi)ROS的熒光圖像。（E）流式細胞術評估成纖維細胞中DCFH-DA熒光強度。（F）化學發(fā)光法測量成纖維細胞中ATP產(chǎn)生。（G）化學發(fā)光法測量成纖維細胞中ADP/ATP比率。（H）HIS-SIM熒光圖像顯示MSC線粒體通過Mito@euMVs轉移到HUVEC。（I）TMRM染色顯示HUVEC線粒體膜電位的熒光圖像。（J）流式細胞術評估HUVEC中TMRM熒光強度。（K）DCFH-DA探針檢測HUVEC內(nèi)ROS水平。（L）流式細胞術評估HUVEC中DCFH-DA熒光強度。（M）化學發(fā)光法測量HUVEC中ATP產(chǎn)生。（N）化學發(fā)光法測量HUVEC中ADP/ATP比率。（O）魚藤酮存在下Mito@euMVs誘導和處理衰老細胞示意圖。（P）魚藤酮存在下，Mito@euMVs處理的高糖誘導衰老成纖維細胞中SA-β-Gal表達的明場圖像。（Q）SA-β-Gal陽性成纖維細胞比例。（R）魚藤酮存在下，Mito@euMVs處理的高糖誘導衰老HUVEC中SA-β-Gal表達的明場圖像。（S）SA-β-Gal陽性HUVEC比例

（4）溶解PVA微針貼片促進Mito @ euMV的經(jīng)皮給藥

負載Mito@euMV的溶解性PVA-MN貼片按（圖4A）所示過程制備，對應的PDMS模具如（圖4B）所示。每個針尖為正四棱錐形，高600 μm，底邊長300 μm，貼片由10×10個針尖組成。脫模后的PVA-MN貼片與設計一致（圖4C）。壓縮實驗（圖4D）顯示，20%和25%的PVA-MN比15%的PVA-MN具有更好的機械強度。使用豬皮驗證MN的皮膚滲透能力，結果表明20%和25% PVA-MN的頭端幾乎100%穿透豬皮（圖4E）。由于25% PVA-MN未表現(xiàn)出顯著優(yōu)于20% PVA-MN的機械性能，因此選擇20% PVA-MN貼片用于后續(xù)實驗。在體外實驗中，20% PVA-MN在120秒內(nèi)快速溶解，確保了Mito@euMV的有效遞送（圖4F）。MN中DiD標記的Mito@euMV均勻分布在每個針尖中（圖4G），且MitoTracker-Green的熒光表明Mito@euMV內(nèi)的線粒體在4℃下保持結構完整性至少3天，在-80℃下保持7天（圖4G）。

圖4（A）制備載有Mito@euMVs的溶解PVA微針（MN）貼劑的工作流程示意圖。（B）用于微針貼片的PDMS模具的光學圖像。（C）PVA-MN貼片的光學圖像。（D）15%、20%、25% PVA-MN貼片的壓縮位移機械性能。（E）15%、20%、25% PVA-MN貼片對豬耳皮膚的滲透能力。（F）20% PVA-MNs插入15% GelMA水凝膠后120秒內(nèi)快速溶解的光學顯微鏡圖像。（G）4℃和-80℃下Mito@euMVs在PVA微針中的穩(wěn)定性和線粒體整體結構完整性的熒光圖像

（5）Mito@euMVs促進糖尿病傷口愈合

使用糖尿病壓瘡大鼠模型評估了Mito@euMV的治療效果（圖5A、B）。在治療后0、7、14和21天對傷口進行評估并計算傷口面積變化。結果顯示，負載Mito@euMVs的PVA-MNs組（PVA-MN@euMVs）的傷口面積減少最明顯且最迅速（圖5C-E），治療21天后傷口完全閉合。而PVA-MN組和對照組之間的愈合率無顯著差異，表明Mito@euMV的釋放是關鍵因素，而非MN本身。此外，與PVA-MN@euMV相比，皮內(nèi)注射Mito@euMVs（ID@euMVs）對傷口修復的效果較差，這突顯了PVA-MN貼片在促進Mito@euMV精準遞送至受傷組織中的重要作用，從而實現(xiàn)有效傷口愈合。

圖5（A）糖尿病大鼠誘導褥瘡傷口的示意圖。（B）傷口創(chuàng)建及處理、樣本采集流程圖。（C）接受不同治療的大鼠糖尿病褥瘡愈合代表性圖像（n=6）。（D）第3、7、14、21天不同干預治療的傷口面積比較分析。（E）治療后第3、7、14、21天傷口面積評估

H&E染色顯示PVA-MN@euMV組皮膚附屬物再生最完全，包括毛囊和汗腺（圖6A）。各組再生組織的表皮厚度測量結果顯示，ID@euMV和PVA-MN@euMV組的新表皮厚度顯著大于其他兩組（圖6B、C）。第21天的Masson三色染色表明，所有組均有新膠原沉積，但ID@euMV和PVA-MN@euMV組的膠原沉積更密集（圖6D、E）。使用新生血管形成標記物CD31評估血管形成，IHC結果顯示ID@euMV和PVA-MN@euMV誘導了最強的新血管形成，血管密度最高（圖6F、G）。這些結果表明，ID@euMV和PVA-MN@euMV，尤其是PVA-MN@euMV，通過促進傷口閉合和組織再生，加速了糖尿病慢性壓瘡傷口的修復。

圖6（A）第21天愈合的糖尿病壓瘡的H&E染色圖像，受傷區(qū)域由白色虛線劃定。（B）第21天H&E染色圖像顯示傷口邊緣，左側為傷口區(qū)域，右側為完整皮膚。（C）第21天各組新形成表皮厚度分析。（D）第21天傷口Masson染色代表性圖像。（E）各組相對膠原沉積分析。（F）第14天傷口中CD31免疫組織化學染色代表性圖像，黃色箭頭指示新生血管。（G）各組傷口CD31陽性區(qū)域分析

（6）Mito@euMVs拯救傷口部位的細胞衰老

在傷口部位組織切片中檢測到的細胞衰老標志物SA-β-Gal水平顯示，經(jīng)PVA-MN@euMV或ID@euMV處理的傷口中SA-β-Gal陽性區(qū)域比例低于PVA-MN或未處理傷口（圖7A、B），表明Mito@euMV有效抑制了糖尿病傷口組織的衰老狀態(tài)。多重免疫熒光（mIHC）染色結果顯示，接受ID@euMV和PVA-MN@euMV處理的傷口中p53+細胞比例顯著低于PVA-MN和對照組（圖7C），而細胞增殖標志物Ki67+細胞比例各組間無顯著差異（圖7G）。巨噬細胞亞群分析顯示，ID@euMV和PVA-MN@euMV組中CD68+iNOS+（M1型）細胞比例顯著降低，而CD68+Arg1+（M2型）細胞比例顯著增加（圖7C、I、J）。此外，ID@euMV和PVA-MN@euMV處理的傷口中巨噬細胞（CD68+細胞）浸潤減少（圖7E、H），表明Mito@euMV有助于減輕傷口部位炎癥，促進愈合。

圖7（AB）第21天SA-β-Gal染色代表性圖像及每單位面積SA-β-Gal陽性面積比例定量。（C）受傷組織中不同細胞表型代表性圖像。（D）多重免疫熒光圖像顯示Arg1、iNOS、CD68、Ki67和p53染色。（E）各組傷口及邊緣區(qū)域巨噬細胞浸潤代表性圖像。（F）各組傷口中p53+細胞定量分析。（G）各組傷口中Ki67+細胞定量分析。（H）各組傷口及邊緣區(qū)域巨噬細胞浸潤定量分析。（I）各組傷口中CD68+iNOS+細胞定量分析。（J）各組傷口中CD68+Arg1+細胞定量分析

（7）Mito@euMVs改善傷口組織中的線粒體功能

免疫熒光染色結果表明，成纖維細胞和HUVEC在體內(nèi)能夠有效攝取Mito@euMVs（圖8）。負載Mito@euMVs的PVA-MN貼片顯著改善了糖尿病傷口組織的線粒體功能（圖8B、C），表現(xiàn)為ATP5A表達增加（圖8B）和活性氧（ROS）水平降低（圖8D，E）。雖然PVA-MN貼片本身也能降低ROS，但其效果不如負載Mito@euMVs的貼片顯著，表明Mito@euMVs通過改善線粒體功能和緩解炎癥，在糖尿病傷口愈合中發(fā)揮了關鍵作用。

圖8（A）第1天成纖維細胞和內(nèi)皮細胞在體內(nèi)攝取Mito@euMVs的代表性免疫熒光圖像。（B）ATP5A染色代表性免疫熒光圖像。（C）第7天每單位面積ATP5A平均熒光強度定量。（D）DHE染色代表性圖像。（E）第7天每單位面積DHE平均熒光強度定量

（8）Mito@euMVs改變糖尿病傷口的蛋白質(zhì)組

無標記定量蛋白質(zhì)組學分析顯示，接受不同治療（PVA-MN@euMV、ID@euMV、PVA-MN和未治療）的傷口組織具有不同的蛋白質(zhì)表達譜，主成分分析（PCA）表明各組樣本可聚類（圖9A）。與對照組相比，差異表達蛋白質(zhì)（DEP）的火山圖顯示顯著變化（圖9B）。PVA-MN@euMV治療的傷口中，與線粒體ATP產(chǎn)生（如Cyb5r3和Slc44a2）和線粒體融合（如Tfrc和Tmbim6）相關的蛋白質(zhì)顯著上調(diào)，而與線粒體分裂（Fis1）和凋亡（Dlat、Bid）相關的蛋白質(zhì)顯著下調(diào)，表明細胞線粒體功能改善。PVA-MN@euMV和ID@euMV組中，與代謝、胰高血糖素信號、細胞衰老、p53信號、細胞凋亡、PI3K-Akt信號和PPAR信號相關的途徑受DEP上調(diào)影響顯著?；虮倔w（GO）富集分析顯示，與對照組相比，ID@euMV和PVA-MN@euMV組中與線粒體和能量代謝（圖9C、F）、抗氧化應激（圖9D、G）相關的GO術語顯著上調(diào)，而與細胞衰老相關的GO術語傾向于下調(diào)（圖9E、H）。PVA-MN@euMV組中與線粒體、能量代謝和抗氧化應激相關的上調(diào)DEP數(shù)量顯著多于ID@euMV組，差異更顯著（圖9I-K）。這些結果與體內(nèi)組織化學染色結果一致（圖7、8），表明Mito@euMV通過增強線粒體功能、能量代謝和抗氧化能力，同時抑制細胞衰老，加速了傷口愈合。

圖9（A）4組蛋白質(zhì)表達水平的主成分分析（PCA）顯示PC1和PC2完全分離。（B）火山圖顯示差異表達蛋白（DEP），灰色為不顯著基因，紅色為上調(diào)基因，藍色為下調(diào)基因。（C-E）GO弦圖顯示ID@euMVs與對照組間DEPs與線粒體富集途徑的關系，涉及能量代謝（C）、抗氧化應激（D）和細胞衰老（E）。（F-H）GO弦圖顯示PVA-MN@euMVs與對照組間DEPs與線粒體富集途徑的關系，涉及能量代謝（F）、抗氧化應激（G）和細胞衰老（H）。（I-K）熱圖展示參與線粒體和能量代謝（I）、抗氧化應激（J）和細胞衰老（K）的DEP