惠民福利国产精品午夜一级毛片精品_高清无码操逼免费观看的毛片_惠民福利国产又色又爽又黄的在线观看_91精品久久久久中文字幕_99免费视频在线_欧洲熟妇AV一级_日本不卡在线视频二区三区_嗯…啊摸湿奶头免费视频_国产精品免费观看无遮挡_少妇宾馆粉嫩10p

      針對上述問題，山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院張志岳教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種ROS響應(yīng)型藥物納米載體（PHD/G-NPs），由聚合物-藥物綴合物自組裝而成，能夠包裹GSI。該載體在T-ALL細(xì)胞內(nèi)化后，通過ROS敏感橋的降解，快速釋放GSI和DHA。GSI抑制Notch1信號通路，抑制細(xì)胞增殖，而DHA則通過鐵死亡進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞毒性。此外，鐵死亡過程中釋放的損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）與αPD-1聯(lián)合使用，可激活免疫反應(yīng)，增強(qiáng)抗腫瘤效果。為了降低GSI的副作用，研究人員進(jìn)一步用CD38抗體修飾納米載體，提高了治療效果和安全性(圖1)。相關(guān)研究在2025年5月31日以《A ROS-Responsive Dual-Targeting Drug Nanocarrier Serving as a GSI Synergist and Ferroptosis Sensitizer for T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI: 10.1002/advs.202505087）上。

圖1 研究示意圖

（1）DHA增強(qiáng)GSI對T-ALL細(xì)胞的細(xì)胞毒性

在T-ALL細(xì)胞系中，單獨(dú)使用GSI對細(xì)胞增殖的抑制效果不顯著（圖2A），這可能是由于其水溶性低。通過DCFH-DA監(jiān)測GSI處理的Molt4和Jurkat細(xì)胞內(nèi)ROS水平，發(fā)現(xiàn)ROS水平隨時間逐漸升高（圖2B、C）。在GSI處理后，聯(lián)合使用DHA顯著增強(qiáng)了對T-ALL細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在最大測試濃度下，GSI單獨(dú)處理時Molt4和Jurkat細(xì)胞的抑制率分別為17.9%和33.9%，而DHA單獨(dú)處理時Molt4的抑制率為41.8%，其在Jurkat中的半抑制濃度（IC50）為28.78 μm。然而，GSI與DHA聯(lián)合使用時，GSI的IC50在Molt4和Jurkat中分別降低至14.2 μm和19.83 μm（圖2D、E），表明DHA顯著增強(qiáng)了GSI的細(xì)胞毒性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，T-ALL細(xì)胞先用GSI預(yù)處理，再聯(lián)合DHA處理時，細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低，IC50值分別降至10.07 μm（Molt4）和12.36 μm（Jurkat）。這表明GSI預(yù)處理比同時給藥更有效地增強(qiáng)T-ALL細(xì)胞對DHA的敏感性。推測GSI通過抑制Notch1激活誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞短暫生長停滯，部分ROS水平高的半靜止細(xì)胞在GSI處理后存活，其ROS水平升高，從而增強(qiáng)DHA的細(xì)胞毒性（圖2F）。

圖2 DHA增強(qiáng)GSI對T-ALL細(xì)胞的細(xì)胞毒性。(a) 不同濃度GSI處理T-ALL細(xì)胞的增殖活性；(b) GSI（20 μm）處理T-ALL細(xì)胞不同時間點(diǎn)的ROS水平流式細(xì)胞術(shù)分析；(c) (b)中ROS檢測的平均熒光強(qiáng)度（MFI）定量；(d, e) Molt4（d）和Jurkat（e）細(xì)胞經(jīng)不同處理后的細(xì)胞活性（CCK8法）：單獨(dú)GSI處理24小時、單獨(dú)DHA處理24小時、GSI+DHA聯(lián)合處理24小時、先GSI預(yù)處理24小時再與DHA共處理24小時；(f) DHA與GSI協(xié)同作用機(jī)制示意圖

（2）ROS響應(yīng)性NP的成功制備

基于pDMA-pEPEMA-pHD聚合物的ROS響應(yīng)性，通過納米沉淀法制備了ROS響應(yīng)型納米顆粒（PHD/G-NPs），如圖3A所示。利用動態(tài)光散射（DLS）測得PHD/G-NPs的平均粒徑為134.7 ± 2.1 nm，分布均勻（PDI：0.25 ± 0.014），zeta電位為?3.16 ± 0.52（圖3B、D、E）。透射電子顯微鏡（TEM）觀察結(jié)果顯示，納米顆粒呈球形且分散良好，證實(shí)納米顆粒成功制備（圖3C）。為評估ROS響應(yīng)性，將納米顆粒置于含1 mM H?O?的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中孵育，結(jié)果顯示納米顆粒結(jié)構(gòu)被破壞，zeta電位發(fā)生變化，表明其對ROS具有響應(yīng)性（圖3E、F）。此外，采用動態(tài)膜透析法研究DHA的體外釋放行為，結(jié)果顯示在含1 mM H?O?的PBS中，DHA的累積釋放率達(dá)到82.16 ± 3.43%，而在不含H?O?的PBS中僅為46.94 ± 1.9%（圖3G），證實(shí)了納米顆粒的ROS觸發(fā)釋放特性（圖3H）。

圖3 PHD/G-NPs和CD38-PHD/G-NPs的制備與表征。(a) PHD/G-NPs制備示意圖；(b) PHD/G-NPs的粒徑分布（DLS檢測）；(c) PHD/G-NPs的代表性TEM圖像；(d) PHD/G-NPs的粒徑、PDI和zeta電位值；(e) PHD/G-NPs在pH 7.4 PBS（含或不含1 mM H?O?）中孵育后的zeta電位變化；(f) PHD/G-NPs在pH 7.4 PBS（含或不含1 mM H?O?）中孵育后的TEM圖像；(g) PHD/G-NPs在pH 7.4 PBS（含或不含1 mM H?O?）中孵育后DHA的體外釋放曲線；(h) PHD/G-NPs的ROS響應(yīng)性DHA釋放示意圖

（3）PHD/G-NPs體外抗白血病作用

在10 μm濃度下處理6小時后，納米顆粒對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響顯示，GSI-NPs的ROS水平顯著高于BLANK-NPs，與游離GSI相當(dāng)；PHD-NPs的ROS水平高于BLANK-NPs，與DHA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激增強(qiáng)機(jī)制一致；PHD/G-NPs組的ROS水平最高，表明DHA與GSI的協(xié)同作用顯著提升了ROS水平（圖4A）。體外抗白血病活性評估結(jié)果顯示，GSI-NPs對兩種T-ALL細(xì)胞系的細(xì)胞毒性顯著高于游離GSI，而PHD/G-NPs的抑制效果最強(qiáng)，其IC50值在Molt4細(xì)胞中為5.6 μm，在Jurkat細(xì)胞中為8.6 μm（圖4B）。20 μm濃度的PHD/G-NPs處理后，兩種T-ALL細(xì)胞系的細(xì)胞存活率最低（圖4C–E）。此外，PHD/G-NPs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要表現(xiàn)為壞死而非早期凋亡（圖4F、G），提示DHA的細(xì)胞毒性可能主要通過非凋亡機(jī)制發(fā)揮作用。

圖4 PHD/G-NPs 在體外誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用。(A) 通過流式細(xì)胞分析對 ROS 檢測的 MFI 進(jìn)行量化。(B) 通過 CCK8 分析測量用不同納米粒子處理的 Molt4（左）和 Jurkat（右）細(xì)胞的細(xì)胞活力。*，與 GSI-NP 組相比。#，與 PHD-NP 組相比。(C) 用不同配方 (20 μ m ) 處理后對 T-ALL 細(xì)胞系進(jìn)行代表性細(xì)胞死亡分析。(D,E) 統(tǒng)計(jì)直方圖顯示 (C) 中 Molt4 (D) 和 Jurkat (E) 細(xì)胞的活細(xì)胞百分比。(F,G) 統(tǒng)計(jì)直方圖顯示 (C) 中 Molt4 (F) 和 Jurkat (G) 細(xì)胞中壞死和早期凋亡的百分比

（4）PHD/G-NPs誘導(dǎo)促進(jìn)性鐵死亡的機(jī)制

為闡明PHD/G-NPs誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制，對經(jīng)PBS、GSI、GSI-NPs或PHD/G-NPs處理的Molt4細(xì)胞進(jìn)行了RNA-Seq分析。結(jié)果顯示，與PBS對照組相比，GSI、GSI-NPs和PHD/G-NPs組中Notch信號通路的正向調(diào)控基因（KAT2A、NOTCH1等）表達(dá)下調(diào)，而負(fù)向調(diào)控基因（DVL3、NUMB等）表達(dá)上調(diào)（圖5A），表明GSI有效抑制了Notch1激活。KEGG通路富集分析顯示，GSI-NPs組中PI3K-AKT信號通路被激活，而GSI-NPs和PHD/G-NPs組中MAPK信號通路富集，且PHD/G-NPs組中特異性富集鐵死亡相關(guān)基因（圖5B）。這表明DHA通過促進(jìn)鐵死亡增強(qiáng)GSI的細(xì)胞毒性，而GSI通過激活MAPK信號通路（鐵死亡的已知調(diào)控因子）增強(qiáng)細(xì)胞對DHA誘導(dǎo)的鐵死亡的敏感性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，用MAPK抑制劑（SB202190）處理PHD/G-NPs組的T-ALL細(xì)胞，透射電鏡觀察到典型的鐵死亡超微結(jié)構(gòu)特征，如線粒體體積縮小、膜密度增加和嵴消失，這些變化在PHD/G-NPs處理的細(xì)胞中更為顯著，而MAPK抑制劑則使線粒體形態(tài)恢復(fù)至接近正常狀態(tài)（圖5C）。此外，PHD/G-NPs顯著增加了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平（BODIPY-C11染色，圖5D）和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）水平（圖5E），而MAPK抑制劑則顯著降低了這兩者的水平。鐵離子（Fe2?）水平的免疫熒光分析結(jié)果也與上述發(fā)現(xiàn)一致（圖5F）。這些結(jié)果證實(shí)，GSI通過激活MAPK信號通路增強(qiáng)DHA誘導(dǎo)的鐵死亡，從而彌補(bǔ)其自身細(xì)胞毒性不足。

圖5 PHD/G-NPs誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞的細(xì)胞毒性機(jī)制。(a) 不同處理組（PBS、GSI、GSI-NPs、PHD/G-NPs）處理Molt4細(xì)胞后的Notch信號通路相關(guān)基因表達(dá)熱圖；(b) GSI、GSI-NPs和PHD/G-NPs處理組與對照組相比的差異基因KEGG通路富集分析結(jié)果；(c) 經(jīng)PHD/G-NPs處理及MAPK抑制劑（SB202190）預(yù)處理后的T-ALL細(xì)胞的透射電鏡圖像，顯示線粒體形態(tài)變化；(d) PHD/G-NPs處理及MAPK抑制劑預(yù)處理后的T-ALL細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平檢測（BODIPY-C11染色）；(e) PHD/G-NPs處理及MAPK抑制劑預(yù)處理后的T-ALL細(xì)胞內(nèi)MDA水平檢測； (f) PHD/G-NPs處理及MAPK抑制劑預(yù)處理后的T-ALL細(xì)胞內(nèi)Fe2?水平免疫熒光分析

（5）PHD/G-NPs體內(nèi)抗白血病作用

在Notch1誘導(dǎo)的T-ALL小鼠模型中，通過尾靜脈注射給藥（GSI 30 mg/kg，GSI與DHA摩爾比為1:1），評估了納米顆粒的抗白血病活性（圖6A）。結(jié)果顯示，游離GSI和DHA聯(lián)合治療顯著減小了脾臟的體積和重量，而PHD/G-NPs在抑制脾腫大方面效果優(yōu)于單獨(dú)的GSI-NPs或PHD-NPs（圖6B、C）。此外，PHD/G-NPs處理后，脾臟和骨髓中GFP?白血病細(xì)胞的比例顯著降低（圖6D、E），表明PHD/G-NPs具有最高的抗白血病活性。對主要器官進(jìn)行H&E染色的組織形態(tài)學(xué)分析顯示，與對照組相比，心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟均未觀察到明顯異常或病理變化（圖6F），表明PHD/G-NPs具有良好的體內(nèi)安全性。通過H&E和PAS染色分析T-ALL小鼠的回腸組織，發(fā)現(xiàn)GSI組分誘導(dǎo)了明顯的腸道分泌化生，表現(xiàn)為杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖6G）。所有接受GSI、GSI+DHA、GSI-NPs和PHD/G-NPs處理的小鼠均表現(xiàn)出杯狀細(xì)胞數(shù)量升高，提示PHD/G-NPs需要靶向遞送機(jī)制以選擇性地作用于T-ALL細(xì)胞，減少非靶向效應(yīng)。在Notch1誘導(dǎo)的T-ALL小鼠模型中，通過骨髓活檢的免疫組化分析MDA和GPX4（鐵死亡標(biāo)志物），結(jié)果顯示PHD-NPs和PHD/G-NPs處理的小鼠表現(xiàn)出顯著的鐵死亡活性，其中PHD/G-NPs組的鐵死亡水平最高（圖6H）。這些結(jié)果表明，PHD/G-NPs具有強(qiáng)大的抗白血病活性和鐵死亡誘導(dǎo)能力，且在體內(nèi)具有可接受的安全性，但無法預(yù)防GSI相關(guān)的腸道上皮損傷。

圖6 PHD/G-NPs的體內(nèi)抗白血病活性及安全性評估。(a) Notch1誘導(dǎo)的T-ALL小鼠模型給藥方案示意圖；(b) 不同處理組小鼠脾臟體積比較；(c) 不同處理組小鼠脾臟重量比較；(d) 不同處理組小鼠脾臟中GFP?白血病細(xì)胞比例；(e) 不同處理組小鼠骨髓中GFP?白血病細(xì)胞比例；(f) 主要器官（心、肝、脾、肺、腎）的H&E染色結(jié)果；(g) 不同處理組小鼠回腸組織的H&E和PAS染色結(jié)果；(h) 不同處理組小鼠骨髓中MDA和GPX4的免疫組化分析

（6）PHD/G-NPs與αPD-1聯(lián)合在體內(nèi)協(xié)同激活抗腫瘤免疫反應(yīng)

文獻(xiàn)曾報道PD-1表達(dá)與T-ALL的惡性進(jìn)展呈正相關(guān)，且PD-1阻斷可顯著清除T-ALL干細(xì)胞并抑制腫瘤進(jìn)展。鐵死亡過程中釋放的損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）可重塑腫瘤微環(huán)境，而PHD/G-NPs已被證實(shí)能有效誘導(dǎo)鐵死亡。因此，假設(shè)將PHD/G-NPs與PD-1抗體（αPD-1）聯(lián)合使用可協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤效果。為此，建立了Notch1誘導(dǎo)的T-ALL小鼠模型，評估不同處理的抗白血病和免疫激活效果。小鼠通過尾靜脈注射給予PBS、αPD-1、PHD/G-NPs或PHD/G-NPs+αPD-1聯(lián)合治療，共5次（圖7A）。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療顯著減小了脾臟體積，降低了脾臟和骨髓中GFP?白血病細(xì)胞的比例，效果優(yōu)于PBS、αPD-1和PHD/G-NPs單獨(dú)治療組（圖7B–E）。

進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓和脾臟中T細(xì)胞的激活情況。PHD/G-NPs+αPD-1組中，骨髓和脾臟中GFP?細(xì)胞的CD8? T細(xì)胞比例顯著高于其他各組（圖7F、G、I、M），而CD4? T細(xì)胞水平在各組間無顯著差異（圖7H、L）。此外，PHD/G-NPs+αPD-1治療顯著增強(qiáng)了體內(nèi)樹突狀細(xì)胞（DC）的成熟，表現(xiàn)為GFP?細(xì)胞中成熟DC的比例高于其他組（圖7J、N；）。同時，PHD/G-NPs+αPD-1處理還增加了骨髓和脾臟中自然殺傷（NK）細(xì)胞的積累（圖7K、O）。

圖7 PHD/G-NPs聯(lián)合αPD-1在體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。(A) Notch1誘導(dǎo)的T-ALL小鼠中不同治療的實(shí)驗(yàn)方案：1，PBS（CON）；2，αPD-1；3，PHD/G-NP；4，PHD/G-NP聯(lián)合αPD-1。(B，C) 四組脾臟大小照片（B）和脾臟重量對應(yīng)的統(tǒng)計(jì)直方圖（C）。(D) 流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟中GFP+ T-ALL細(xì)胞百分比。E) 流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓樣本中GFP+細(xì)胞百分比。(F，G) 流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟（F）和骨髓（G）中GFP-細(xì)胞中CD3+CD8+ T細(xì)胞百分比。 (H–K) 統(tǒng)計(jì)直方圖顯示脾臟中 GFP- 細(xì)胞中 CD3+CD4+ T 細(xì)胞 (H)、CD3+CD8+ T 細(xì)胞 (I)、CD86+CD80+ DC (J) 和 NK1.1+ NK 細(xì)胞 (K) 的百分比。L-O) 統(tǒng)計(jì)直方圖顯示骨髓中 GFP- 細(xì)胞中 CD3+CD4+ T 細(xì)胞 (L)、CD3+CD8+ T 細(xì)胞 (M)、CD86+CD80+ DC (N) 和 NK1.1+ NK 細(xì)胞 (O) 的百分比

（7）CD38-PHD/G-NPs在T-ALL CDX模型中的綜合作用

為減輕GSI引起的嚴(yán)重胃腸道副作用，通過將CD38抗體與PHD/G-NPs結(jié)合進(jìn)行修飾（圖8A）。透射電鏡（TEM）觀察顯示，修飾后的CD38-PHD/G-NPs呈球形且分散良好（圖8B）。動態(tài)光散射（DLS）測量結(jié)果顯示，CD38-PHD/G-NPs的平均粒徑為153.4 ± 2.9 nm（圖8C、E），分布均勻（PDI：0.238 ± 0.008，圖8E），zeta電位為?1.99 ± 0.19 mV（圖8F）。與未修飾的PHD/G-NPs相比，粒徑和zeta電位的差異初步證實(shí)了CD38抗體的成功結(jié)合。紅外光譜分析顯示，CD38-PHD/G-NPs在1519 cm?1處出現(xiàn)新的吸收峰，歸屬于CD38抗體的N–H彎曲振動（酰胺II帶），進(jìn)一步證實(shí)了納米顆粒表面的CD38抗體修飾成功（圖8D）。

為了評估CD38抗體修飾是否增強(qiáng)T-ALL細(xì)胞的體外攝取效率，使用熒光染料Cy5.5標(biāo)記納米顆粒并進(jìn)行熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示，與未修飾的Cy5.5-NPs相比，CD38-Cy5.5-NPs處理的T-ALL細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明CD38修飾顯著促進(jìn)了T-ALL細(xì)胞的靶向攝?。▓D8G）。在體內(nèi)分布方面，通過生物發(fā)光成像技術(shù)在T-ALL小鼠中監(jiān)測CD38-Cy5.5-NPs的攝取情況，結(jié)果表明CD38-Cy5.5-NPs的攝取率顯著高于其他配方（圖8H），證實(shí)了其在體內(nèi)的靶向效率更高。此外，體外成像研究顯示，CD38-Cy5.5-NPs在T-ALL小鼠的骨髓和脾臟（白血病細(xì)胞富集部位）中的攝取更為顯著（圖8I）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，CD38-Cy5.5-NPs組骨髓細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度（MFI）顯著高于其他組（圖8J），表明CD38-Cy5.5-NPs優(yōu)先靶向體內(nèi)的白血病細(xì)胞。

在體內(nèi)抗白血病效果方面，NSG小鼠移植Molt4細(xì)胞后，分別給予CD38-Blank-NPs、PHD/G-NPs和CD38-PHD/G-NPs處理，共5次（圖8K）。結(jié)果顯示，CD38-PHD/G-NPs在抑制脾腫大和降低脾臟及骨髓中GFP?白血病細(xì)胞比例方面效果最佳（圖8L、M），且各組間體重?zé)o顯著差異（圖8N）。值得注意的是，接受CD38-PHD/G-NPs治療的小鼠顯示出接近正常的杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)和保留的腸道上皮結(jié)構(gòu)（圖8O），表明減輕了GSI相關(guān)的胃腸道副作用。此外，生存監(jiān)測顯示，接受CD38-PHD/G-NPs治療的Molt4荷瘤小鼠生存期最長（圖8P）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，CD38-PHD/G-NPs通過抑制白血病進(jìn)展和減輕嚴(yán)重胃腸道毒性，顯著增強(qiáng)了聯(lián)合治療效果。由于NSG小鼠缺乏抗腫瘤免疫反應(yīng)，與Notch1誘導(dǎo)的小鼠相比，CD38-PHD/G-NPs在Molt4荷瘤小鼠中的抗白血病效果有所降低。

圖8 CD38-PHD/G-NPs的靶向遞送效果評估。(a) CD38抗體修飾PHD/G-NPs的示意圖；(b) CD38-PHD/G-NPs的TEM圖像；(c) CD38-PHD/G-NPs的粒徑分布；(d) CD38-PHD/G-NPs的紅外光譜分析；(e) CD38-PHD/G-NPs的粒徑和PDI值；(f) CD38-PHD/G-NPs的zeta電位值；(g) T-ALL細(xì)胞攝取CD38-Cy5.5-NPs的熒光顯微鏡圖像；(h) T-ALL小鼠體內(nèi)CD38-Cy5.5-NPs的生物發(fā)光成像結(jié)果；(i) 小鼠主要器官和骨髓的體外成像結(jié)果；(j) 骨髓細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果；(k) NSG小鼠給藥方案示意圖；(l) 不同處理組小鼠脾臟體積比較；(m) 不同處理組小鼠脾臟和骨髓中GFP?白血病細(xì)胞比例；(n) 不同處理組小鼠體重變化；(o) 不同處理組小鼠回腸組織的H&E染色結(jié)果；(p) 不同處理組小鼠的生存曲線