惠民福利国产精品午夜一级毛片精品_高清无码操逼免费观看的毛片_惠民福利国产又色又爽又黄的在线观看_91精品久久久久中文字幕_99免费视频在线_欧洲熟妇AV一级_日本不卡在线视频二区三区_嗯…啊摸湿奶头免费视频_国产精品免费观看无遮挡_少妇宾馆粉嫩10p

針對上述問題，復旦大學仰大勇教授和天津大學姚池教授團隊及合作者在DNA功能材料用于黑色素瘤光免疫治療方面取得新進展，發(fā)展了能夠在腫瘤部位特異性啟動光動力單元以及核酸藥物釋放的智能DNA水凝膠，在無需激光照射條件下可實現(xiàn)腫瘤部位的按需光免疫治療。研究人員設計了一種智能能量存儲DNA水凝膠，通過滾環(huán)擴增（RCA）反應構(gòu)建，整合了多種組件：PD-1抑制劑（PD-1 aptamer, Apt PD-1）、免疫佐劑（CpG ODN）、能量存儲光動力模塊（ES-PMSA）。該水凝膠能夠響應多種腫瘤標志物，實現(xiàn)激光自由、按需激活的光免疫療法，實現(xiàn)靶向藥物釋放，用于局部黑色素瘤的治療。該文章于2025年6月4日以《Smart Energy-Storing DNA Hydrogel for On-Demand Laser-Free Photoimmunotherapy of Melanoma》為題發(fā)表于《Journal of the American Chemical Society》上（DOI:10.1021/jacs.5c06905）。

研究示意圖

（1）智能能量儲存DNA水凝膠的制備與表征

本研究通過滾環(huán)擴增（RCA）策略構(gòu)建了兩條部分互補的DNA鏈，形成智能儲能DNA水凝膠網(wǎng)絡。非變性PAGE證實線性模板成功環(huán)化為circDNA，DNA鏈1和鏈2因高分子量在PAGE中被阻滯，表明構(gòu)建成功（圖1A）。圓二色性（CD）光譜中276 nm處的重疊峰表明Apt PD-1成功引入CS-template-1（圖1B）。在K?存在下，AS1411序列形成G四鏈體結(jié)構(gòu)并與SiPcCl2組裝成復合物，CD譜峰藍移驗證了該復合物的構(gòu)建（圖1C）。ES-PM納米顆粒通過以下步驟合成：紫外線照射胺修飾的PLNPs生成儲能PLNPs（ES-PLNPs），再用MnO2殼包封得到ES-PM納米顆粒。ES-PM納米顆粒與SiPcCl2-AS1411通過靜電相互作用結(jié)合，形成ES-PMSA納米復合物（圖1D）。zeta電位測量顯示ES-PMSA的zeta電壓為-36.4 mV，表明其成功形成（圖1E）。動態(tài)光散射測量顯示ES-PMSA的流體動力學直徑為92.5 nm（圖1F）。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示水凝膠具有均勻多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于藥物裝載（圖1G）。流變學分析表明，儲能模量（G'）高于損耗模量（G''），水凝膠具有類固體性質(zhì)和高度柔軟性，賦予其良好的注射性和組織貼合能力（圖1H）。X射線光電子能譜（XPS）證明水凝膠中成功嵌入了ES-PMSA和SiPcCl?（圖1I）。

圖1 智能儲能DNA水凝膠的制備及表征。（A）不同的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳（B）的圓二色性光譜。（C）AS1411+K+和AS1411+K++SiPcCl2的圓二色性光譜。（D） ES-PMSA分子結(jié)構(gòu)示意圖。（E）不同樣品的Zeta電位。（F）不同樣品的DLS。（G）水凝膠的SEM圖像。（H）水凝膠流變測試。（I）X射線光電子能譜

（2）智能儲能DNA水凝膠多重刺激響應的研究

為實現(xiàn)按需釋放，水凝膠整合了多重腫瘤微環(huán)境響應模塊。首先，通過含有Apt PD-1序列的CS-template-1與T細胞特異性識別，觸發(fā)CpG ODN的釋放，PAGE檢測驗證了T細胞介導的釋放行為（圖2A）。進一步地，引入攜帶HhaI限制性內(nèi)切酶的TGMS納米顆粒，通過蛋白酶觸發(fā)HhaI釋放，該酶可特異切割DNA鏈2中的回文序列（GCGC），實現(xiàn)ES-PMSA的精準釋放。凝膠電泳顯示在蛋白酶存在下出現(xiàn)裂解帶，證實該酶響應機制有效（圖2B）。采用1%的凝膠分離法，研究蛋白酶溶液中酶的時間依賴性斷裂。蛋白酶組中出現(xiàn)了裂解帶，而沒有蛋白酶組的孔中保留帶，這表明腫瘤部位的酶能夠觸發(fā)HhaI釋放（圖2C）。通過釋放的Mn²⁺有效地催化過氧化氫（H₂O₂）轉(zhuǎn)化為氧氣（O₂），為PDC提供了增強的O₂供應。ES-PMA（不含SiPcCl₂）溶液在日光和紫外光下表現(xiàn)出深棕色分散體。在GH存在的情況下，在紫外線照射下觀察到深棕色溶液變成白色和紅色熒光，表明持續(xù)發(fā)光的GH響應性恢復（圖2D、E）。此外，ES-PMSA具GSH響應性。在還原性條件下（模擬腫瘤內(nèi)GSH濃度），ES-PMA溶液發(fā)生光學性質(zhì)變化，發(fā)光恢復隨GSH濃度升高而增強，表現(xiàn)出良好的GSH響應特性。（圖2F）。熒光譜顯示ES-PLNP的發(fā)射峰與SiPcCl₂的吸收峰高度重疊，有利于能量轉(zhuǎn)移和ROS生成。使用SOSG探針檢測發(fā)現(xiàn)，ES-PMSA可在無外源光照下激活產(chǎn)生¹O₂，明顯優(yōu)于無儲能模塊對照組，表明其具自發(fā)激活光動力功能。

圖2 智能儲能DNA水凝膠的多重刺激響應性。（A）PAGE驗證CpG加載及T細胞誘導釋放。（B） HhaI @ TGMS納米顆粒響應釋放ES-PMSA的示意圖。（C）PAGE驗證蛋白酶介導DNA鏈切割以釋放光動力模塊。（D） GSH響應下5G溶液在日光和UV照射下的照片。（E） ES-PMA和ES-PLNP的熒光光譜。（F）不同GSH濃度恢復ES-PMA的熒光光譜。（G） PLNP溶液和SiPcCl₂吸收光譜。（H） SOSG檢測ES-PMSA的ROS生成

（3）對B16癌細胞無激光光動力療法性能研究

光動力模塊（ES-PMSA）通過核苷介導的細胞吸收被B16細胞內(nèi)化，腫瘤內(nèi)GSH觸發(fā)活性氧（ROS）產(chǎn)生，促進無激光光動力療法（PDT）效果（圖3A）。流式細胞術(shù)分析顯示，B16細胞與Cy5標記的ES-PMSA孵育4小時后熒光強度顯著增加，而Smooth細胞（ASMC）、DC和T細胞熒光變化較小，表明ES-PMSA通過受體介導的內(nèi)吞作用被B16細胞吸收（圖3B）。熒光強度分析表明，ES-PMSA和ES-PMSA-G+H組顯著增加綠色熒光，而PMA、ES-PMA或PMSA組未觀察到顯著熒光，說明ES-PMSA有效誘導B16細胞中ROS產(chǎn)生（圖3C）。CCK-8試驗結(jié)果顯示，ES-PMSA和ES-PMSA-G-H組細胞存活率顯著降低，表明無激光PDT取得良好治療效果（圖3D）。通過ATP檢測試劑盒檢測B16細胞ATP分泌水平，ES-PMSA和ES-PMSA-G-H組ATP分泌顯著高于其他組（圖3E）。免疫熒光染色顯示，ES-PMSA和ES-PMSA-G-H組細胞表面CRT暴露顯著增加（圖3F、G），而HMGB1綠色熒光顯著減少，表明無激光PDT有效促進HMGB1釋放（圖3H、I）。這些結(jié)果表明，無激光PDT可誘導強烈的免疫原性細胞死亡（ICD）反應，促進后續(xù)免疫細胞激活。

圖3 無激光光動力治療(PDT)誘導B16癌細胞免疫原性細胞死亡。（A） GSH刺激下無激光ROS生成用于腫瘤殺傷的示意圖。（B）流式細胞術(shù)分析ES-PMSA內(nèi)化到B16細胞，DC和CTLL-2作為對照。（C）不同組分在8小時對B16細胞中的ROS生成的熒光顯微鏡和ES-PMSA-G圖像。（D）CCK-8測定不同組分對B16細胞存活率。（E）不同處理后細胞外 ATP的定量。（F）不同組分處理后，與鈣網(wǎng)蛋白 (CRT) 熒光探針 (綠色) 和DAPI (藍色) 孵育的B16細胞的CLSM圖像。（G）CRT的相應相對熒光強度。（H）不同組分處理后，B16細胞與HMGB1蛋白熒光探針 (HMGB1，綠色) 和DAPI (藍色) 孵育的CLSM圖像。（I）HMGB1的相對熒光強度

（4）CpG釋放對T細胞應答及樹突狀細胞（DC）成熟的影響研究

CpG ODN是含有未甲基化CpG基序的短DNA序列，可激活DC增強抗腫瘤免疫反應。智能儲能DNA水凝膠與T細胞孵育時，通過Apt PD-1與T細胞的特異性識別結(jié)合釋放CBP，進而刺激DC成熟（圖4A）。熒光實驗顯示，紅色熒光標記的Apt PD-1與綠色熒光標記的T細胞共定位，產(chǎn)生強烈黃色熒光信號，而陰性對照組（NC）重疊極小，Apt PD-1組Pearson系數(shù)顯著高于NC組，表明Apt PD-1特異性識別T細胞并成功釋放PGP ODN（圖4B）。綠色熒光染色的DNA水凝膠與紅色熒光標記的T細胞孵育結(jié)果顯示，含有Apt PD-1序列的水凝膠熒光強度顯著高于不含Apt PD-1的NC組，驗證了DNA水凝膠與T細胞的特異性識別（圖4C）。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ISA）檢測發(fā)現(xiàn)，Gel-ATG +T組上清中免疫細胞因子濃度最高，腫瘤壞死因子-α為2000.7 μg/mL，IL-6為2450.2 μg /mL，而缺乏CBP釋放的組細胞因子水平顯著降低（圖4D、E），表明T細胞可觸發(fā)DNA水凝膠釋放ATG ODN，刺激BMDCs分泌免疫細胞因子。流式細胞術(shù)檢測BPDC表面CD80和CD86蛋白表達水平，Gel-ATG +T組CD80蛋白表達量從15.2%增加到53.6%，CD86蛋白表達量從14.9%增加到55.8%，而未釋放ATG的組變化不足20.0%（圖4F、G），表明釋放的ATG ODN激活了DC?？傮w而言，T細胞觸發(fā)釋放的CBP ODN可促進不成熟DC成熟，激活T細胞以清除腫瘤細胞。

圖4 T細胞反應性釋放CpG促進DC體外成熟。（A）T細胞觸發(fā)的CpG釋放以促進用于T細胞活化的DC成熟的示意圖。（B）用Cy5-labeled Apt PD-1and Cy5-labeled NC孵育的DiO染色的T細胞的代表性熒光顯微鏡圖像 (非相關(guān)序列)。（C）具有和不具有Apt PD-1的DNA網(wǎng)絡捕獲的T細胞的代表性熒光顯微鏡圖像。（D，E）測試不同材料BMDC細胞上清液TNF-α和 IL-6的分泌水平。（F，G）流式細胞術(shù)測定DC (BMDCs) 上CD80和CD86表達水平及評估DC成熟度

（5）TAA和ATG對B16細胞的免疫治療性能

智能儲能DNA水凝膠通過誘導PDC效應釋放TAA，并編碼Apt PD-1富集腫瘤部位的T細胞，同時充當免疫檢查點阻滯劑。T細胞從Apt PD-1中取代ATG ODN并釋放CBP ODN以促進DC成熟，增強T細胞抗腫瘤能力（圖5A）。實驗中，將TAA組（B16細胞來源的TAA）和CPD T組（T細胞觸發(fā)釋放的CPD ODN）與BMDCs共孵育，檢測BMDCs表面CD80和CD86表達以及上清中腫瘤壞死因子-α和IL-6濃度。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，TAA+CPGT組（同時添加TAA和CPD ODN）的CD80和CD86表達率最高，分別為48.0%和46.9%，其他組依次為PBS組、TAA組、CPGT組（圖5B、C）。TAA+CPGT組的腫瘤壞死因子-α和IL-6水平顯著高于其他組（圖5D、E），表明TAA和ATG ODN可協(xié)同促進DC成熟。通過DDD-8試驗檢測成熟BMDCs激活T細胞的能力，TAA+CPGT組的T細胞存活率最高，為462.9%，顯著高于單一抗原組（圖5F），說明TAA與ATG ODN聯(lián)合可有效調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。此外，通過混合細胞實驗（DC、T細胞和B16細胞）評估智能儲能DNA水凝膠的協(xié)同抗腫瘤效果。實驗中，不同組的DNA凝膠與細胞共孵育后，熒光顯微鏡記錄紅色熒光B16細胞（圖5G）。結(jié)果顯示，含有Apt PD-1、ATG和ES-PMSA的DNA凝膠（第VII組）對B16細胞的殺傷效果最強，紅色熒光強度最弱，表明無激光光動力療法（ES-PMSA）、免疫佐劑（ATG）和免疫檢查點抑制劑（Apt PD-1）的聯(lián)合治療具有顯著的協(xié)同抗腫瘤作用。

圖5 TAAs和CpG對B16細胞的免疫治療性能。（A） TAAs和CpG協(xié)同免疫治療示意圖。（B，C）流式細胞術(shù)分析BMDCs上CD80和CD86的表達。（D，E） ELISA測定不同處理的BMDCs培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6的濃度。（F） CCK-8法評估BMDCs分泌因子處理的T細胞增殖率。（G）共培養(yǎng)T細胞和DCs與B16細胞的熒光顯微鏡圖像

（6）智能儲能DNA水凝膠在體內(nèi)治療的評價

建立了原位黑色素瘤小鼠模型，以研究智能儲能DNA水凝膠的體內(nèi)治療性能。35只荷B16腫瘤小鼠隨機分為7組，每3天通過瘤內(nèi)注射不同組分的藥物（圖6A）。結(jié)果顯示，v-VII組腫瘤生長呈減速趨勢，優(yōu)于iii和iv組的單藥治療（圖6B）。隨后提取腫瘤并拍照稱重，腫瘤照片顯示智能儲能DNA水凝膠對腫瘤生長有顯著抑制作用（圖6C）。腫瘤重量分析表明，組ii、iii、iv、v、vi和VII的腫瘤抑制率分別為4.0%、18.3%、33.6%、49.4%、53.8%和73.3%（圖6D）。與對照組（i）相比，含有Apt PD-1、ATG和ES-PMSA的DNA凝膠（VII組）顯示出最強的腫瘤抑制效果。含有ES-PMSA的DNA凝膠（iv組）也表現(xiàn)出腫瘤抑制作用，證明ES-PMSA從DNA水凝膠中釋放并實現(xiàn)了無激光光動力療法。與iv組相比，含有Apt PD-1、ATG和ES-PMSA的DNA凝膠（vi組）進一步減少了腫瘤，表明釋放的ATG ODN、TAA和Apt PD-1可有效增強免疫治療。

圖6 智能儲能DNA水凝膠在原位黑色素瘤小鼠模型中的抗腫瘤性能。（A）建立和治療B16黑色素瘤小鼠模型的示意圖。（B）不同組中的平均腫瘤生長概況。（C）切除腫瘤的圖像。（D）不同組中平均腫瘤重量的統(tǒng)計。（E） 用Cy5和DAPI分別染色的腫瘤切片的CRT (紅色) 和細胞核 (藍色) 的免疫熒光圖像。（F）流式細胞術(shù)測定提取的腫瘤組織中CD80、CD86和CD8的分泌水平。 （G）不同組的H & E染色的腫瘤