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針對(duì)上述問題，華南理工大學(xué)曹曉東教授團(tuán)隊(duì)提出了一種新的概念設(shè)計(jì)，通過在聚多巴胺（PDA）和聚-L-賴氨酸（PLL）修飾的鎂摻雜生物活性玻璃（MgBG）界面上，對(duì)來自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的細(xì)胞外小囊泡（sEVs）進(jìn)行自組裝編程，成功構(gòu)建了一種新型的sEVs@PPMB（EPPM）囊泡簇，該囊泡簇在增強(qiáng)內(nèi)吞作用方面具有非凡的效率。通過將溫和的席夫堿反應(yīng)與氧化葡聚糖（OD）和季銨化殼聚糖（QCS）相結(jié)合，開發(fā)了一種多功能水凝膠（EPPMO），可以快速促進(jìn)糖尿病傷口愈合。該文章于2025年4月3日以《A multifunctional hydrogel loaded with magnesium-doped bioactive glass-induced vesicle clusters enhances diabetic wound healing by promoting intracellular delivery of extracellular vesicles》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2025.03.025）。

圖1. EPPMO水凝膠制備工藝示意圖

（1）PPMO水凝膠的表征

如圖2a所示，利用聚多巴胺（PDA）和聚-L-賴氨酸（PLL）修飾MgBG來合成PPMB，再由PPMB和QCS與OD通過席夫堿反應(yīng)制備得到了PPMO水凝膠。Zeta電位分析（圖2b）表明PP0.5-MB電位為4.75 ± 4.11 mV。 PPMO水凝膠的制備過程如圖2c所示，PPMB和QCS側(cè)鏈上的氨基與OD側(cè)鏈上的醛基通過席夫堿反應(yīng)結(jié)合，凝膠化時(shí)間約為120秒，席夫堿鍵的動(dòng)態(tài)可逆性賦予了PPMO水凝膠良好的可注射性、自愈合性和組織粘附性。PPMO水凝膠的可注射性如圖2d所示，它可以通過1毫升注射器均勻擠出，形成完整的星形或圓形。PPMO水凝膠的自愈合特性如圖2e所示，當(dāng)兩塊紅色和藍(lán)色的PPMO水凝膠接觸并融合時(shí)，它們會(huì)形成一個(gè)沒有明顯邊界的單一實(shí)體。PPMO水凝膠的組織界面粘附特性如圖2f所示，水凝膠可以粘附在豬皮表面，在旋轉(zhuǎn)或折疊后仍能保持其形狀。具有光熱效應(yīng)的水凝膠敷料在近紅外（NIR）光激發(fā)下可以產(chǎn)生局部高溫，有效破壞細(xì)菌生物膜，PDA修飾的PPMB的加入使這些水凝膠具有將光能轉(zhuǎn)化為熱能的能力。使用808 nm NIR在不同功率水平下測(cè)試了5% PPMO水凝膠的光熱效應(yīng)，如圖2g和h所示。經(jīng)過10分鐘的照射后，隨著NIR強(qiáng)度從0.5 W/cm2逐漸增加到2 W/cm2，5% PPMO水凝膠的最大光熱溫度從39.7 ℃上升到64.3 ℃。隨后，評(píng)估了在1 W/cm2的NIR強(qiáng)度下不同PPMB含量的水凝膠的光熱性能，如圖2i和j所示。與OQ水凝膠相比，PPMO水凝膠的最大光熱溫度隨著PPMB含量的增加而呈梯度增加，顯示出濃度依賴性關(guān)系。然而，超過50 ℃的溫度可能會(huì)導(dǎo)致sEVs中的miRNA和其他活性成分降解。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用1 W/cm2的NIR強(qiáng)度、6分鐘的照射時(shí)間和45 ℃的目標(biāo)溫度。

圖2. PPMO水凝膠的表征。（a）水凝膠制備示意圖。（b）納米粒子的Zeta電位分析結(jié)果。（c）水凝膠的制備工藝。（d）水凝膠的可注射性。（e）水凝膠的自愈合性能。（f）水凝膠的皮膚粘附性能。（g）5% PPMO水凝膠在不同近紅外強(qiáng)度下的溫度變化曲線。（h）5% PPMO在不同近紅外強(qiáng)度下的溫度變化圖像。（i）近紅外強(qiáng)度為1 W/cm2時(shí)水凝膠的溫度變化曲線。（j）近紅外強(qiáng)度為1 W/cm2時(shí)水凝膠的溫度變化圖像

（2）EPPMO水凝膠的表征

如圖3a所示。首先，從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）中提取sEVs，通過sEVs與PPMB的蛋白吸附和靜電相互作用成功制備EPPM囊泡簇，TEM和粒徑分析顯示sEVs呈球形或盤狀，平均直徑為63.1 ± 4.12 nm（圖3b和c）。通過將sEVs與PPMB共孵育來制備EPPM囊泡簇，結(jié)果如圖3d所示，sEVs用綠色細(xì)胞膜綠色熒光標(biāo)記染色，與未修飾的MgBG相比，PDA-MgBG、PP0.2-MB和PP0.5-MB的sEVs熒光強(qiáng)度顯著更高。如圖3e所示，未處理的MgBG的sEVs負(fù)載率為4.4 ± 0.40%，而僅用PDA修飾的PDA-MgBG顯示出一定的負(fù)載能力，PP0.5-MB（用PDA和PLL修飾）的sEVs負(fù)載率為66.5 ± 0.46%，顯著高于其他納米顆粒。為了驗(yàn)證sEVs與PP0.5-MB之間的結(jié)合模式，進(jìn)行了zeta電位分析（圖3f），表明通過PDA介導(dǎo)的蛋白吸附和靜電相互作用實(shí)現(xiàn)了sEVs的負(fù)載。通過Western blot分析（圖3g），與sEVs相比，負(fù)載在EPPM上的sEVs以及經(jīng)過EPPMO NIR（+）處理的sEVs的CD9、CD63和TSG101相對(duì)蛋白水平下降了，處理之間沒有顯著差異，這些結(jié)果表明，經(jīng)過一系列處理后制備的EPPMO中的sEVs保持了良好的生物功能。如圖3h所示，當(dāng)sEVs直接負(fù)載在OQ水凝膠上時(shí)，EO水凝膠在pH = 6.5時(shí)3天內(nèi)快速釋放，釋放率約為70.8%。相比之下，EPPMO水凝膠在pH = 6.5時(shí)3天內(nèi)僅釋放了47.5%的sEVs。糖尿病傷口（DWs）的治療周期通常較長(zhǎng)。EPPMO水凝膠的長(zhǎng)期持續(xù)釋放sEVs可以有效延長(zhǎng)sEVs在傷口部位的作用時(shí)間，從而促進(jìn)傷口愈合。

圖3.EPPMO水凝膠的表征。（a）EPPM制備示意圖。（b）sEVs的透射電鏡圖像。（c）sEVs的納米顆粒粒徑分布。（d）復(fù)合納米顆粒的熒光圖像：sEVs（綠色）和PPMB（灰色）。（e）sEVs的裝載效率。（f）Zeta電位分析。（g）Western blot結(jié)果。（h）在pH 7.4和6.5條件下，水凝膠中sEVs的累積釋放結(jié)果

通過Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)估了EPPMO水凝膠的細(xì)胞活性（圖4a）。細(xì)胞接種在孔板底部，將50 μL水凝膠放置在Transwell上層室中進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。通過3D成像（圖4b）證實(shí)sEVs（紅色）、PPMB（綠色）和EPPM在水凝膠中均勻分布，表明實(shí)現(xiàn)了納米顆粒的成功負(fù)載。持續(xù)性炎癥是糖尿病傷口愈合的主要挑戰(zhàn)之一，因此免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用對(duì)于糖尿病傷口修復(fù)至關(guān)重要。RAW 264.7細(xì)胞對(duì)囊泡簇的內(nèi)化作用分析（圖4c）表明，在12 h時(shí)，未修飾的MgBG組未觀察到明顯的綠色熒光，而PPMB被細(xì)胞內(nèi)化但熒光強(qiáng)度較低。與自由釋放的sEVs相比，EPPM的細(xì)胞內(nèi)化增加了約8.2倍（圖4d）。在糖尿病傷口的增殖階段，血管化對(duì)于營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸和傷口愈合至關(guān)重要。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）是血管生成的關(guān)鍵參與者，研究了其對(duì)囊泡簇的內(nèi)化作用（圖4e）。HUVECs對(duì)納米顆粒攝取的熒光成像與RAW 264.7細(xì)胞的結(jié)果相似，EPPM顯示出顯著更高的細(xì)胞內(nèi)化效率，比單獨(dú)的sEVs高約16.7倍（圖4f）。將囊泡簇加載到EPPMO水凝膠中保留了sEVs的活性，增強(qiáng)了生物利用度，并促進(jìn)了MgBG的細(xì)胞內(nèi)遞送和積累，有效調(diào)節(jié)了細(xì)胞的生物學(xué)功能。

圖4. EPPM囊泡簇的細(xì)胞內(nèi)化檢測(cè)。（a）細(xì)胞與EPPMO水凝膠共培養(yǎng)的示意圖。（b）水凝膠內(nèi)納米顆粒的分布情況。（c）水凝膠釋放的納米顆粒被RAW 264.7細(xì)胞攝取圖像和（d）定量熒光面積結(jié)果。（e）水凝膠釋放的納米顆粒被HUVECs攝取圖像和（f）定量熒光面積結(jié)果

（3）水凝膠的抗菌性能

在細(xì)菌感染會(huì)引發(fā)慢性炎癥，進(jìn)一步阻礙傷口愈合。圖5a展示了水凝膠對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抗菌效果。在未使用近紅外光（NIR）處理的情況下，所有OQ水凝膠對(duì)大腸桿菌的抗菌率均超過90%。在使用NIR處理的情況下，PPMO和EPPMO水凝膠的光熱特性實(shí)現(xiàn)了約99.9%的抗菌率，瓊脂平板上的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果（圖5b）與基于吸光度的抗菌結(jié)果一致。此外，圖5c展示了水凝膠對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抗菌效果，所有水凝膠在NIR處理和未處理的情況下，對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌率均超過95%，瓊脂平板結(jié)果（圖5d）也證實(shí)了這一點(diǎn)。這些結(jié)果表明，EPPMO水凝膠系統(tǒng)的光熱效應(yīng)可以有效殺死細(xì)菌，增強(qiáng)抗菌劑的療效，從而促進(jìn)糖尿病傷口愈合。

圖5.在808納米近紅外（1 W/cm2）下的光熱抗菌效果水凝膠的抗菌性能。（a）水凝膠對(duì)大腸桿菌的抗菌率。（b）大腸桿菌菌落存活情況。（c）水凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌率。（d）金黃色葡萄球菌菌落存活情況。NIR（?）表示未進(jìn)行近紅外處理，NIR（+）表示進(jìn)行了近紅外處理

（4）水凝膠的生物相容性和細(xì)胞招募能力

為了評(píng)估水凝膠對(duì)L929成纖維細(xì)胞（L929）和HUVECs的細(xì)胞活性，采用CCK8實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，含有sEVs的EO和EPPMO水凝膠不僅展現(xiàn)出良好的生物相容性，還能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖6a-d）。這種促進(jìn)作用歸因于sEVs攜帶的多種促進(jìn)細(xì)胞增殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。為了評(píng)估水凝膠的細(xì)胞招募能力，進(jìn)行了12小時(shí)的Transwell實(shí)驗(yàn)及其定量分析（圖6e-f），結(jié)果顯示，對(duì)照組和OQ水凝膠組沒有細(xì)胞招募能力。然而，添加了sEVs和MgBG的EO、PPMO和EPPMO水凝膠顯著增強(qiáng)了L929的招募能力，其中EPPMO水凝膠表現(xiàn)最為顯著。此外，通過劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估了水凝膠促進(jìn)L929遷移的能力（圖6g），24小時(shí)后，對(duì)照組的遷移率為46.1 ± 10.96%，而EPPMO水凝膠組的遷移率達(dá)到了92.7 ± 4.07%，在EPPMO水凝膠組中，劃痕區(qū)域完全消失，表明其顯著促進(jìn)了L929的遷移（圖6h）。

圖6.水凝膠的生物相容性和細(xì)胞招募性能。（a） L929細(xì)胞經(jīng)水凝膠處理后的活/死細(xì)胞染色結(jié)果。（b）經(jīng)水凝膠處理的L929細(xì)胞CCK8檢測(cè)結(jié)果。（c）通過水凝膠對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行活/死細(xì)胞染色。（d）水凝膠處理后HUVECs的CCK-8檢測(cè)結(jié)果。（e-f）Transwell實(shí)驗(yàn)及其半定量分析L929細(xì)胞與水凝膠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（g-h）劃痕試驗(yàn)及其半定量分析結(jié)果

（5）巨噬細(xì)胞的M2表型極化

為了評(píng)估水凝膠對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，使用RT-qPCR檢測(cè)了RAW 264.7巨噬細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)（圖7a），與未處理的對(duì)照組相比，LPS處理的M0巨噬細(xì)胞極化為促炎的M1型，表現(xiàn)為促炎因子TNF-α和iNOS表達(dá)升高，而抗炎因子Arg-1和IL-10表達(dá)降低。與LPS處理相比，EO、PPMO和EPPMO水凝膠組顯著降低了促炎因子TNF-α和iNOS的表達(dá)，同時(shí)顯著增加了抗炎因子Arg-1和IL-10的表達(dá)。此外，通過免疫熒光染色檢測(cè)了M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物iNOS和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物IL-10的表達(dá)，結(jié)果由圖7b-e所示，與對(duì)照組、LPS組和OQ組相比，EPPMO水凝膠組的iNOS表達(dá)顯著降低，而IL-10表達(dá)顯著增加。此外，還對(duì)NF-κB信號(hào)通路中的p65蛋白進(jìn)行了免疫熒光染色（圖7f），在未激活的NF-κB信號(hào)通路中，p65蛋白（紅色）保留在細(xì)胞質(zhì)中，核轉(zhuǎn)位受到抑制（對(duì)照組），經(jīng)LPS處理的巨噬細(xì)胞顯示出NF-κB信號(hào)通路的激活，極化為M1型巨噬細(xì)胞，p65轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核（LPS組和OQ組）。與這些組相比，EPPMO水凝膠組顯示出最顯著的p65核轉(zhuǎn)位抑制，這是因?yàn)镋PPMO水凝膠釋放的EPPM被細(xì)胞有效內(nèi)化，EPPM攜帶的miR-199a、miR-146等免疫調(diào)節(jié)miRNA與MgBG釋放的Mg2?協(xié)同作用，有效抑制了NF-κB信號(hào)通路的激活，從而防止了p65的核轉(zhuǎn)位，并促進(jìn)了M1到M2型巨噬細(xì)胞的極化，實(shí)現(xiàn)了聯(lián)合抗炎效果。

圖7.水凝膠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的能力。（a）通過RT-qPCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞中的抗炎基因Arg-1和IL-10以及促炎基因TNF-α和iNOS的表達(dá)。（b-c）iNOS蛋白表達(dá)的免疫熒光染色及半定量分析。（d-e）免疫熒光IL-10蛋白表達(dá)的染色及半定量分析。（f） p65蛋白的免疫熒光染色

（6）水凝膠的促血管生成能力

在糖尿病傷口（DWs）的增殖階段，血管化對(duì)于營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸和傷口愈合至關(guān)重要。通過RT-qPCR檢測(cè)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中血管生成相關(guān)基因的表達(dá)（圖8a-d），結(jié)果顯示，EPPMO水凝膠組顯著上調(diào)了HIF-α和VEGF基因的表達(dá)，同時(shí)VEGF受體KDR的表達(dá)也顯著增加，促進(jìn)血管生成的eNOS基因在EPPMO水凝膠組中也表現(xiàn)出顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步評(píng)估水凝膠對(duì)HUVECs血管生成性能的影響，采用免疫熒光檢測(cè)了血管生成標(biāo)記蛋白CD31的表達(dá)（圖8e-f），結(jié)果顯示，EO、PPMO和EPPMO水凝膠組均能促進(jìn)CD31的表達(dá)，其中EPPMO水凝膠組的增加最為顯著。此外，還進(jìn)行了基質(zhì)膠形成的管狀結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8g所示，呈現(xiàn)出與免疫熒光染色相似的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，EPPMO水凝膠通過促進(jìn)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)了血管生成能力，從而在糖尿病傷口愈合過程中發(fā)揮了重要作用。

圖8.水凝膠血管生成性能的評(píng)價(jià)。（a-d）通過rt-qpcr檢測(cè)的huvec中血管生成相關(guān)基因hif-α，VEGF，KDR和eNOS的表達(dá)。（e-f）免疫熒光法測(cè)定CD31 蛋白的表達(dá)及其半定量分析結(jié)果。（g）基質(zhì)膠基質(zhì)形成血管的鈣黃素AM染色

（7）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

使用SD大鼠的糖尿病感染性全層皮膚缺損模型（圖9a）來評(píng)估水凝膠在體內(nèi)促進(jìn)傷口愈合的能力。在術(shù)后3天，空白組（Blank）的傷口尚未結(jié)痂且有化膿現(xiàn)象（圖9b），而OQ和EO水凝膠組的傷口沒有顯著的化膿。此外，由于納米簇的溫和光熱效應(yīng)和QCS的抗菌特性，PPMO和EPPMO組的傷口迅速結(jié)痂，沒有明顯的感染和潰瘍跡象。值得注意的是，EPPMO組的傷口開始顯示出愈合的初步跡象。在術(shù)后14天，EPPMO組的傷口幾乎完全愈合，其他水凝膠組的傷口愈合情況良好，而空白組的傷口仍未完全結(jié)痂。對(duì)組織形態(tài)進(jìn)行半定量分析（圖9c和d）顯示，EPPMO水凝膠組的傷口愈合率顯著高于其他組。

圖9.水凝膠系統(tǒng)結(jié)合近紅外輻射對(duì)促進(jìn)糖尿病皮膚缺損愈合效果的評(píng)價(jià)。（a）糖尿病皮膚傷口模型的構(gòu)建過程示意圖。（b）用不同水凝膠樣品處理的皮膚傷口區(qū)域的宏觀圖像。（c）術(shù)后第3天、第7天及第14天的皮膚傷口閉合情況。（d）術(shù)后第3、7和14天的傷口閉合率定量數(shù)據(jù)

為了進(jìn)一步研究SD大鼠的炎癥微環(huán)境和血管生成，對(duì)傷口組織進(jìn)行了免疫組化染色，檢測(cè)抗炎標(biāo)志物IL-10（綠色，圖10a,d）和促炎標(biāo)志物TNF-α（紅色，圖10a,e），在第3天，空白組和OQ組顯示出顯著的TNF-α陽性表達(dá)，而IL-10表達(dá)為陰性。然而，在加入抗炎劑后，EO和PPMO組顯示出促炎因子的顯著減少和抗炎因子IL-10的陽性表達(dá)，在sEVs和PPMB的協(xié)同作用下，EPPMO組顯示出促炎因子的顯著減少和IL-10的陽性表達(dá)，表明其具有卓越的抗炎能力。使用免疫組化染色檢測(cè)α-SMA（綠色）和CD31（紅色）來評(píng)估DWs中的血管生成（圖10b,f），空白組和OQ組CD31表達(dá)較低，而含有sEVs的PPMO組增加了相關(guān)蛋白的表達(dá)，得益于sEVs和PPMO的協(xié)同作用，EPPMO組顯示出顯著增強(qiáng)的表達(dá)，血管生成有助于維持細(xì)胞代謝和增殖，從而促進(jìn)糖尿病傷口愈合。 采用Masson染色來分析皮膚修復(fù)中的膠原沉積，如圖10c所示，在第3天和第7天，空白組僅表現(xiàn)出少量膠原表達(dá)（藍(lán)色）。EO和PPMO水凝膠組已經(jīng)開始膠原沉積，而EPPMO水凝膠顯示出顯著的膠原沉積。在第14天，空白組和OQ組均顯示出膠原表達(dá)，而含有活性物質(zhì)的EO、PPMO和EPPMO水凝膠顯示出更顯著的膠原表達(dá)，且EPPMO組的膠原排列緊密且成熟。

圖10. 組織學(xué)免疫熒光和Masson染色。（a）IL-10和TNF-α的免疫熒光染色。（b） α-SMA和CD31的免疫組化染色。（c）Masson染色。（d）IL-10免疫熒光染色的熒光面積的半定量結(jié)果。（e）TNF-α免疫熒光染色的熒光面積的半定量結(jié)果。（f）CD31免疫熒光染色的熒光面積的半定量結(jié)果