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針對以上問題，國立清華大學(xué)Eric Hwang、朱麗安和胡尚秀教授團隊提出了一種原位磁電生成針對miR6236的海綿（miS）和通過導(dǎo)電顆粒支架（cGRAS）進行無線電刺激的策略，用于TBI中的神經(jīng)再生。cGRAS由帶正電的聚乙胺（PEI）/MXene（MX）和帶負電的微珠組成，可以促進miRNA海綿的形成和三維多孔支架的構(gòu)建。在外置交變磁場（AMF）照射下，“電磁信使”誘導(dǎo)電刺激以恢復(fù)大腦功能，并促進時間電穿孔。這種機制結(jié)合cGRAS的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)，增強了體內(nèi)基因輸送，用于形成miRNA海綿，有效減少了miR-6263的過表達，miR-6263是與神經(jīng)損傷相關(guān)的凋亡和炎癥通路中的關(guān)鍵介質(zhì)。這種策略減少了炎癥，促進了新生神經(jīng)元向受損區(qū)域的浸潤，并恢復(fù)了多巴胺神經(jīng)傳遞。此外，它還促進了血管生成。這些通過原位磁電miRNA海綿形成和無線電刺激實現(xiàn)的結(jié)果，改善了大腦功能和行為恢復(fù)。因此，cGRAS代表了一種潛在的變革性和多功能工具，用于臨床神經(jīng)再生工程應(yīng)用。該文章于2025年5月29日以《In Situ Magnetoelectric Generation of miRNA Sponges and Wireless Electric Stimulus by Conductive Granular Scaffolds for Nerve Regeneration》為題發(fā)表于《Advanced Material》（DOI: 10.1002/adma.202500650）。

圖1 miS@cGRAS的表征。（a）miS@cGRAS結(jié)構(gòu)的示意圖，其由包裹PEI-MX納米片和pDNA（miR6236靶向海綿）的可注射微珠構(gòu)成；（b）注入TBI傷口后的miS@cGRAS在AMF刺激下，通過水凝膠的機械應(yīng)力信號通路實現(xiàn)靶向、按需遞送核酸藥物和電子轉(zhuǎn)移，促進TBI治療中的血管生成、神經(jīng)再生和功能恢復(fù)

（1）PEI-MX的合成與表征

該 cGRAS 通過將載有 miRNA 海綿的電磁 PEI - MX 涂覆于明膠微珠制備而成。MX 采用蝕刻劑插層剝離法制備，從 MAX 相前驅(qū)體選擇性去除 A 層得到多層 MX。隨后，帶正電的 PEI 與帶負電且表面含活性基團的 MX 結(jié)合，通過靜電吸附和氫鍵作用形成 PEI-MX 復(fù)合物，其構(gòu)成致密聚氫鍵網(wǎng)絡(luò)，增強材料機械強度并作為非病毒基因遞送系統(tǒng)。SEM 圖像顯示 MX 和 PEI - MX 納米片層厚約 2.5nm，PEI - MX 層間距更大；TEM 圖像中 PEI - MX 表面有聚合物殼；EDS 分析表明 PEI - MX 含 Ti、N 元素，MX 幾乎不含 Al 元素（圖 2a - e）。XRD 分析顯示 PEI 的引入使 PEI - MX 的 2θ 值減小，d 間距增大，且 MX 晶格結(jié)構(gòu)和片層取向發(fā)生輕微變化（圖 2f）。HRXPS 分析發(fā)現(xiàn)，Ti 2p 光譜顯示 MX 和 PEI - MX 的特征峰，PEI - MX 的 C 1s 光譜出現(xiàn) C - N 鍵，N 1s 光譜出現(xiàn)季氮和N - Ti 鍵，證實 PEI 與 MX 成功結(jié)合形成 N - Ti 鍵（圖 2g、h）。在細胞膜通透性研究中，以 DAPI 為標(biāo)志物，通過 CLSM 分析發(fā)現(xiàn)，PEI - MX 因其正電荷與細胞膜負組分的靜電相互作用，較 MX 顯示更強 DAPI 信號，經(jīng) AMF 刺激后，細胞膜破壞更顯著，可能是原位電穿孔作用所致（圖 2i）。DNA 結(jié)合實驗表明，PEI - MX 的 DNA 結(jié)合能力隨 PEI - MX/DNA 比例升高而增強，且僅 PEI 涂層納米粒因靜電吸引顯示出強 DNA 結(jié)合力；其形貌在 miR6236 海綿修飾后無明顯變化（圖 2j）。

圖2 MXene（MX）和 PEI-MX 的合成和表征。a、B）MX 和 PEI-MX 合成的示意圖。c）MX 和 PEI-MX 的 SEM 圖像。d）MX 和 PEI-MX 的 TEM 圖像。e）MX 和 PEI-MX 的 EDS 映射。f）MX 和 PEI-MX 的 XRD 分析。g，h）MX 和 PEI-MX 的高分辨率 X 射線光電子能譜。i）顯示在 AMF 照射下膜破裂和增加的滲透性的代表性圖像。DAPI 染色細胞核，而鈣黃綠素-AM 表示活細胞。j）PEI-MX 的 DNA 結(jié)合能力

（2）cGRAS 的制備和表征

使用微流控芯片制備 cGRAS 核心部分，即單分散微珠（MB）。將 GelMA 溶液（水相）與甲基丙烯酰氯酐（MA）反應(yīng)，制得 GelMA，其取代度（DS）約為 85%。在 T 形微流控連接處，GelMA 溶液形成層流，被油相剪切形成水包油乳液。液滴經(jīng)毛細管并在紫外線（365 nm，1500 系列，OmniCure）照射下交聯(lián)成微凝膠（圖 3a）。得到的 MB 在明視野顯微鏡下呈現(xiàn)均勻的尺寸、圓形形狀和光滑表面（圖 3b）。PEI-MX 涂覆后，微凝膠表面變黑且粗糙（圖 3c、f），CLSM 圖像顯示滴液外表面有明顯的導(dǎo)電涂層殼（圖 3c、f），表明成功吸附了納米顆粒。與未涂覆的 MB 相比，PEI - MX 涂覆的 MB 或 miS@PEI - MX 涂覆的 MB 表面粗糙（圖 3g - i），表明 miS/PEI - MX 在 MB 表面致密均勻結(jié)合，可能利于 AMF 照射后的電刺激以促進神經(jīng)再生。miS@cGRAS 的平均直徑約為 150 μm（圖 3j），適合注射且對組織再生理想。通過在含膠原酶的條件下進行降解實驗評估其穩(wěn)定性，結(jié)果顯示其可生物降解（圖 3k）。測量了大塊微凝膠表面的孔隙率（圖 3l），表明 cGRAS 內(nèi)有相互連接的通道。此外，miS@cGRAS 在水溶液中表現(xiàn)出輕微的溶脹和分散能力（圖 3m）。對 miS@cGRAS 施加 AMF 刺激以產(chǎn)生電流，通過微凝膠相互連接網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移改善基因傳遞和神經(jīng)分化（圖 3n、o）。將 cGRAS 放置在 FTO 基底上并暴露于 AMF 下，結(jié)果證明可按需產(chǎn)生電流（圖 3o），確認導(dǎo)電材料在誘導(dǎo)電流方面的有效性。cGRAS 的流變和自修復(fù)性能歸因于非共價顆粒間鍵的可逆性。隨著時間的推移，cGRAS 可聚集成大塊凝膠，形成更硬的水凝膠并增加內(nèi)部交聯(lián)密度（圖 3p）。cGRAS 在外部機械應(yīng)力下保持結(jié)構(gòu)完整性的能力至關(guān)重要，可確保水凝膠的功能性和耐用性。如圖 3q 所示，大塊 cGRAS 凝膠在承受機械切割力并經(jīng)紫外線交聯(lián)后可恢復(fù)原始形狀，還可重塑成其他形狀。

關(guān)于生物材料與腦組織之間的生物屏障和支架整合，材料的儲能模量（G'）至關(guān)重要，因其顯著影響組織-材料相容性。MB、cGRAS 和 miS@cGRAS 的自修復(fù)性能源于非共價顆粒間鍵的可逆性，有助于在整合過程中保持材料完整性，從而在保持支架功能的同時允許適當(dāng)?shù)募毎櫤徒M織修復(fù)。在施加 100% 應(yīng)變后，MB、cGRAS 和 miS@cGRAS 的儲能模量（G'）和損耗模量（G''）均恢復(fù)到原始值。值得注意的是，由于密集氫鍵網(wǎng)絡(luò)的增強作用，cGRAS 和 miS@cGRAS 的儲能模量（G'）更高，并且表現(xiàn)出凝膠特性（G' > G''）（圖 3r）。這些發(fā)現(xiàn)表明，miS@cGRAS 在機械力作用下具有強大的自修復(fù)能力和重塑特性，并且這種可適應(yīng)的水凝膠可作為注射生物支架，用于促進受傷大腦內(nèi)的細胞增殖（圖 3s）。

圖3 可注射 miS@cGRAS 的表征。（a） 微珠制備用微流控芯片設(shè)計；（b） 微珠的明視野圖像；（c - f） 微珠外 PEI - MX 涂層殼的熒光圖像；（g - i） MB、cGRAS 和 miS@cGRAS 的 SEM 圖像；（j） 水包油乳液微珠的直徑；（k） 微珠在 37 °C PBS 中孵育兩周后的降解實驗；（l） 通過溶劑置換法評估的孔隙率測試；（m） 水溶液中的分散能力表明有效釋放核酸藥物的潛力；（n） 外部磁電刺激下微珠的示意圖及檢測工具；（o） 在間歇應(yīng)用 AMF（3.2 kW 和 1 MHz）下，導(dǎo)電納米復(fù)合材料和微珠凝膠的 I - T 曲線，其中 AMF 以 5 秒激活和 5 秒停用的交替模式循環(huán)；（p） 不同涂層后微珠凝膠的凝膠化；（q） miS@cGRAS 的損傷愈合能力和重塑潛力；（r） 通過在 37°C 下連續(xù)步進應(yīng)變（1% 應(yīng)變 → 100% 應(yīng)變 → 1% 應(yīng)變）測量，展示微珠凝膠的流變自修復(fù)性能；（s） 可注射 miS@cGRAS 能適應(yīng) TBI 腔

(3) cGRAS 的生物相容性和細胞毒性

通過對 PEI 劑量的優(yōu)化，在最小化細胞毒性與維持高效基因轉(zhuǎn)染之間取得平衡。將 MB、cGRAS 和 miS@cGRAS 與 NIH-3T3 細胞系（源自小鼠胚胎成纖維細胞的成纖維細胞系）及神經(jīng)干細胞（NSC）共孵育 24 小時，以評估其體外細胞毒性。在 NIH-3T3 細胞中評估含 PEI - MX 的 cGRAS 的細胞毒性，結(jié)果顯示，當(dāng) MX 濃度低于 200 μg mL?1 且 PEI - MX 中的 PEI 濃度低于 1 μg mL?1 時，無顯著細胞毒性，后續(xù)實驗據(jù)此選擇濃度。各種凝膠孵育后，NIH-3T3 細胞的活性保持在 80% 以上（圖 4a）。CLSM 圖像顯示，MB、cGRAS、miS@cGRAS 和 miS@cGRAS + AMF 與 NIH-3T3 細胞共孵育 7 天時細胞附著良好，表明其良好的生物相容性（圖 4b - e）。這種相容性歸因于生物相容性肽（如 RGD 和 MMPs）具有良好的細胞親和力。水凝膠的粘附特性使其能夠彌合生物材料表面與細胞之間的間隙。GelMA 基水凝膠通過明膠的羥基和胺基與甲基丙烯酸酐反應(yīng)合成，保留了用于細胞粘附和酶切的生物活性基序。值得注意的是，miS@cGRAS 在不同導(dǎo)電層濃度下，無論有無 AMF 處理，均展現(xiàn)出良好的生物相容性，即使經(jīng)過幾分鐘的 AMF 暴露也未顯現(xiàn)顯著毒性。

在 NIH-3T3 細胞中展現(xiàn)出良好的生物相容性后，還利用從 ED16  Wistar大鼠胚胎收集和分離的 NSCs 來評估細胞活性（圖 4f、g）。明視野圖像捕捉了 miS@cGRAS 與神經(jīng)球共培養(yǎng) 1、3 和 7 天的情況（圖 4h）。第一天，神經(jīng)元開始在 miS@cGRAS 上生長神經(jīng)突起，隨著孵育時間的延長，神經(jīng)突起變得更長，證明了其強大的生物相容性。與對照組相比，miS@cGRAS 處理組也顯示出明顯的神經(jīng)突起萌發(fā)，表明引入 miS@cGRAS 并未引發(fā)任何不良反應(yīng)（圖 4i）。為了監(jiān)測神經(jīng)突起的生長，使用 βIII - 筒蛋白（Tuj1）對神經(jīng)突起進行染色，以在凝膠上可視化它們。培養(yǎng)一周后，神經(jīng)突起在微珠周圍生長，表明這些材料可以作為合適的生物支架，并在水凝膠表面提供大量的細胞粘附肽（圖 4k、l）。此外，在 AMF 刺激下，觀察到圍繞 miS@cGRAS 延伸的長而密集的神經(jīng)突起，表明外部電流的產(chǎn)生可以增強神經(jīng)細胞的增殖并建立神經(jīng)突起連接（圖 4l、m）。AMF 促進神經(jīng)生長的機制可以解釋為：外部電刺激能有效傳遞電信號，促進神經(jīng)沖動的及時傳遞，并支持生物信息的交流。此外，非侵入性的無線遠端電刺激顯著減少了與神經(jīng)組織的接觸，最小化了通常與植入電極相關(guān)的界面效應(yīng)和炎癥反應(yīng)。

圖4 miS@cGRAS的生物相容性及細胞毒性。（a）NIH-3T3細胞與MB、cGRAS及miS@cGRAS共孵育后的細胞活性；（b-e）NIH-3T3細胞與不同微珠共培養(yǎng)的共聚焦圖像，AMF照射促進細胞增殖且無明顯毒性；（f-i）原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞實驗時間表、取材過程及與miS@cGRAS共培養(yǎng)的明亮視野圖像，顯示微珠上顯著的神經(jīng)突生長且無細胞毒性，其生長模式與對照組相似；（j）NSCs與MB、cGRAS及miS@cGRAS共孵育后的細胞活性；（k-m）NSCs在微珠上的神經(jīng)突生長示意圖、共聚焦圖像及其神經(jīng)突連接的代表性圖像，顯示微珠培養(yǎng)時NSCs的強健生長現(xiàn)象及優(yōu)異的生物相容性

（4）原子力顯微鏡下質(zhì)子海綿效應(yīng)和電穿孔介導(dǎo)的溶酶體逃逸

帶正電的 PEI - MX 通過質(zhì)子海綿效應(yīng)實現(xiàn)內(nèi)質(zhì)-溶酶體逃逸，使 miR6236 海綿進入細胞質(zhì)，AMF 刺激結(jié)合質(zhì)子海綿效應(yīng)可增強膜電穿孔，提高基因載體貨物進入細胞的效率（圖 5a）。CLSM 圖像顯示，PEI-MX 因其陽離子特性較純MX逃逸效率更高，AMF 應(yīng)用可改變膜電位，增強電穿孔和溶酶體排除，組合方式的溶酶體逃逸效率最高（圖 5b、c）。在體外轉(zhuǎn)染實驗中，將 miR6236 海綿（miS）應(yīng)用于 cGRAS，miS 配備了兩個強啟動子和雙報告基因（編碼 d2EGFP 和 mCherry）。miS 通過靶向在早期受損神經(jīng)微環(huán)境中高豐度的 miR6236 來促進神經(jīng)再生。在 NIH - 3T3 細胞系中，miS@cGRAS 的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于 ctS@cGRAS，且 AMF 誘導(dǎo)的電穿孔與質(zhì)子海綿效應(yīng)協(xié)同作用可增強轉(zhuǎn)染效率。在原代神經(jīng)元中，miS@cGRAS 處理后，EGFP 表達降低，表明 miS 成功表達且 miR6236 與海綿結(jié)合并耗盡 EGFP 表達（圖 5e、f、g）。流式細胞儀分析進一步確認了轉(zhuǎn)染效率。miS@PEI - MX 組的轉(zhuǎn)染效率相較于游離 miS 有所提高，這歸因于轉(zhuǎn)染劑涂層有助于 miS 的高效細胞內(nèi)遞送（圖 5i、j、k）。此外，AMF 刺激使 ctS@cGRAS 或 miS@cGRAS 的轉(zhuǎn)染效率提高至 1.6 倍（圖 5h），熒光定量數(shù)據(jù)表明 AMF 有效促進細胞對基因載體的攝取，轉(zhuǎn)染效率提升至 1.36 倍（圖 5h），與熒光強度測量結(jié)果一致。這些發(fā)現(xiàn)證實了 miR6236 海綿的功能，表明 miS@PEI - MX 與 AMF 刺激聯(lián)合應(yīng)用有望優(yōu)化基因遞送，推動神經(jīng)再生治療的發(fā)展。

圖5 miS@PEI-MX的溶酶體逃逸能力及體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。（a）基因載體載體貨物（miS@PEI-MX）溶酶體逃逸的示意圖；（b-c）共聚焦圖像顯示溶酶體信號（綠色）與顆粒（紅色）的共定位及Pearson系數(shù)比較量化；（d）通過無線電穿孔和機械力在cGRAS上發(fā)生轉(zhuǎn)染，miS@PEI-MX通過溶酶體逃逸轉(zhuǎn)錄雙mRNA以表達功能，mCherry為指示基因，EGFP為目標(biāo)基因用于測量miR6236水平；（e-f）用對照海綿（ctS）或miR6236海綿（miS）處理后神經(jīng)元轉(zhuǎn)染信號的放大CLSM圖像及成功轉(zhuǎn)染miS至神經(jīng)元后的偽彩色基因表達信號圖像；（g-i）EGFP/mCherry比值量化分析，流式細胞術(shù)評估m(xù)iR6236海綿功能（通過測量雙報告基因表達水平）及不同納米復(fù)合物配方（對照、PEI-MX、僅miS、miS@PEI-MX、miS@PEI-MX+AMF）的轉(zhuǎn)染能力；（j-k）流式細胞術(shù)評估不同納米復(fù)合物處理細胞的轉(zhuǎn)染能力及相應(yīng)實驗的平均熒光強度

（5）體外刺激 NSC 分化和功能恢復(fù)

在評估 NSC 海綿效應(yīng)后，通過 CLSM 圖像評估了 miS@cGRAS 對 NSC 分化的影響（圖 6a）。AMF 處理組每天使用 3.2 kW 功率、1 MHz 頻率的 AMF 輻照 3 分鐘，直至 NSC 固定。到第 7 天，CLSM 圖像顯示 NSC 分化和神經(jīng)突起生長明顯（圖 6a）。通過分析神經(jīng)標(biāo)志物 Tuj1 和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP，星形細胞標(biāo)志物）的表達來評估分化結(jié)果。與 ctS@cGRAS 相比，miS@cGRAS 處理的 NSC 顯著萌發(fā)，類似于 miRNA 海綿效應(yīng)（圖 6b）。AMF 暴露可有效促進神經(jīng)元分化，Tuj1 陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，但對星形細胞分化無明顯影響（圖 6c）。此外，AMF 刺激促進 ctS@cGRAS 或 miS@cGRAS 中的神經(jīng)突起延長，表明實現(xiàn)了電流誘導(dǎo)的 NSC 神經(jīng)分化（圖 6d）。AMF 誘導(dǎo)的電刺激激活了促進神經(jīng)萌發(fā)和神經(jīng)生長的多條細胞內(nèi)信號通路，包括鈣信號通路、cAMP 和 MAPK 通路，這些通路共同協(xié)調(diào)細胞反應(yīng)，刺激神經(jīng)萌發(fā)，促進神經(jīng)連接形成和突觸可塑性。

鑒于神經(jīng)突起延長與神經(jīng)再生的密切關(guān)系，降低 miR6236 水平可能有助于增強損傷后的神經(jīng)再生。為了在體外模擬損傷后的環(huán)境，將 NSC 種植在用硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPG）包被的表面上（圖 6e），CSPG 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的星形膠質(zhì)細胞瘢痕中積累。假設(shè) miR6236 會在 CSPG 抑制性基質(zhì)上積累，耗盡 miR6236 將導(dǎo)致神經(jīng)突起長度增加。通過電穿孔將表達 miR6236 海綿的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 NSC 中，立即進行接種，以克服 CSPG 基質(zhì)對神經(jīng)生成的限制（圖 6g）。轉(zhuǎn)染后，神經(jīng)元在 CSPG 包被的表面上培養(yǎng) 7 天，然后固定并分析以評估 miR6236 耗盡對神經(jīng)再生的影響。與未處理組相比，CSPG 表面的 NSC 培養(yǎng)顯示出受損神經(jīng)突起的不健康模式（圖 6f）。預(yù)測在 CSPG 包被的表面上，表達 miR6236 靶向海綿的神經(jīng)元比表達對照海綿的神經(jīng)元延伸出顯著更長的神經(jīng)突起（圖 6h,i）。CLSM 圖像顯示，對照海綿組的神經(jīng)突起生長不連續(xù)且呈珠狀，而 miR6236 海綿組顯示連續(xù)的神經(jīng)突起生長，支持 miR6236 耗盡增強神經(jīng)再生的觀點。此外，AMF 刺激進一步增強了神經(jīng)突起生長，在對照海綿組中神經(jīng)突起長度增加了 1.8 倍，在 miR6236 海綿組中增加了 1.4 倍（圖 6j）。鑒于 miRNA 在脊髓損傷、創(chuàng)傷性腦損傷和中風(fēng)中的新興作用，miR6236 可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR6236 耗盡有潛力增強損傷中樞神經(jīng)元的再生。

圖6 TBI動物研究。（a）TBI實驗時間線、處理過程及犧牲/免疫染色分析示意圖；（b）展示TBI手術(shù)過程的圖片；（c）體內(nèi)轉(zhuǎn)染過程及治療后48小時TBI腔周圍的CLSM圖像，放大圖像顯示綠色熒光（EGFP）相對于紅色熒光（mCherry）減少，部分細胞僅顯示mCherry，表明miR6236完全耗盡及EGFP表達抑制；（d）有無AMF照射的轉(zhuǎn)染效率量化；（e）TBI生物響應(yīng)總結(jié)及miS@cGRAS治療效果，未處理組出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)營炎性，miS@cGRAS治療組炎癥減輕、神經(jīng)營退因子抑制及神經(jīng)修復(fù)能力增強；（f）傷后7天拍攝的CLSM圖像，顯示損傷部位鄰近區(qū)域的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞（綠色，Iba1染色）、星形膠質(zhì)細胞（紫色，GFAP染色）和神經(jīng)絲陽性細胞（黃色，NF200染色），細胞核呈藍色，DAPI染色；（g-i）免疫響應(yīng)、瘢痕邊界和NF200浸潤面積的定量分析

（6）miS@cGRAS 對 TBI 的體內(nèi)研究

在小鼠 TBI 模型中評估 miS@cGRAS 的體內(nèi)效應(yīng)。7 周齡雌性 C57BL/6 小鼠每組 5 只，通過從運動皮層去除腦組織至 1.5 mm 深度建立損傷模型，miS@cGRAS 在損傷后立即注射到受影響區(qū)域，并在植入后一天開始 AMF 刺激直至處死小鼠。結(jié)果顯示，miS@cGRAS 促進 TBI 中的基因傳遞和轉(zhuǎn)染。植入 miS@cGRAS 并應(yīng)用 AMF 后，治療后 48 小時的大腦 CLSM 圖像顯示 TBI 腔周圍有強烈的基因表達（圖 7c）。AMF 暴露 3 分鐘提高了轉(zhuǎn)染效率，從約 18% ±5% 提高到 32% ±5%（圖 7d），表明磁電刺激改善了電穿孔并促進了基因貨物進入細胞質(zhì)。

第 7 天處死的小鼠觀察到傷口的短期變化，分為 5 組：1）假手術(shù)組，2）cGRAS 組，3）ctS@cGRAS 組，4）miS@cGRAS 組，5）miS@cGRAS + AMF 組。miS@cGRAS + AMF 處理后，大腦的炎癥較弱且 TBI 腔較小。IVIS 圖像顯示 TBI 位點的水凝膠植入。miS@cGRAS 治療通過平衡免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)瘢痕邊界、恢復(fù)神經(jīng)可塑性和保護大腦完整性，顯示出減輕 TBI 不良影響的潛力（圖 7e）。第 7 天評估 miS@cGRAS 在促進抗炎方面的作用。假手術(shù)組顯示出大量的巨噬細胞 / 小膠質(zhì)細胞，而 cGRAS 處理組的 Iba - 1 水平顯著降低，表明 ECM 樣 cGRAS 減少了病變體積和炎癥（圖 7f、g）。與假手術(shù)組相比，cGRAS 和 miS@cGRAS + AMF 處理組的星形膠質(zhì)細胞更少且排列更松散（圖 7f - h），這可能歸因于微凝膠的微孔結(jié)構(gòu)，有助于細胞滲透到創(chuàng)傷部位，為再生和愈合創(chuàng)造更有利的環(huán)境。

使用 NF200 標(biāo)記的 CLSM 圖像評估受累區(qū)域的軸突浸潤，虛線標(biāo)示浸潤區(qū)域（圖 7f、i）。量化結(jié)果顯示，假手術(shù)組顯示約 15.4% 的 NF200 陽性浸潤，miS@cGRAS + AMF 組的 NF200 浸潤面積進一步增加至 36.7%，分別是假手術(shù)組和 miS@cGRAS 組的 2.4 倍和 1.3 倍。術(shù)后 14 天通過 CD31 標(biāo)記評估血管恢復(fù)，miS@cGRAS + AMF 組顯示出明顯的血管形成，部分血管超過 100 μm 并在 miS@cGRAS 內(nèi)部通道增殖。這些發(fā)現(xiàn)表明，miS@cGRAS 通過促進神經(jīng)發(fā)生和血管生成，為神經(jīng)損傷后的有效組織再生提供了有利的微環(huán)境。

圖7 TBI動物研究。（a）TBI實驗時間線、處理過程及犧牲/免疫染色分析示意圖；（b）展示TBI手術(shù)過程的圖片；（c）體內(nèi)轉(zhuǎn)染過程及治療后48小時TBI腔周圍的CLSM圖像，放大圖像顯示綠色熒光（EGFP）相對于紅色熒光（mCherry）減少，部分細胞僅顯示mCherry，表明miR6236完全耗盡及EGFP表達抑制；（d）有無AMF照射的轉(zhuǎn)染效率量化；（e）TBI生物響應(yīng)總結(jié)及miS@cGRAS治療效果，未處理組出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)營炎性，miS@cGRAS治療組炎癥減輕、神經(jīng)營退因子抑制及神經(jīng)修復(fù)能力增強；（f）傷后7天拍攝的CLSM圖像，顯示損傷部位鄰近區(qū)域的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞（綠色，Iba1染色）、星形膠質(zhì)細胞（紫色，GFAP染色）和神經(jīng)絲陽性細胞（黃色，NF200染色），細胞核呈藍色，DAPI染色；（g-i）免疫響應(yīng)、瘢痕邊界和NF200浸潤面積的定量分析

圖8 TBI后不同治療對神經(jīng)恢復(fù)的全腦成像分析及行為評估。（a）未治療TBI與miS@cGRAS有效治療對比示意圖；（b）不同材料治療TBI的全鼠腦重建3D圖像，突出SMI312（軸突標(biāo)志，綠色）和剩余損傷區(qū)域（橙色）；（c）顯示損傷部位周圍新生軸突纖維再生的圖像，miS@cGRAS+AMF組新生神經(jīng)元密度最高；（d）各組剩余損傷體積和新生軸突體積量化（n=3）；（e）顯示多巴胺神經(jīng)傳遞的全鼠腦3D圖像，酪氨酸羥化酶（TH）染成黃色；（f）miS@cGRAS+AMF組放大圖像顯示TH標(biāo)志及受損側(cè)（紫色）清晰的黑質(zhì)紋狀體纖維束，與正常側(cè)（藍色）對比；（g）多巴胺能腦區(qū)TH細胞密度比較；（h-i）多巴胺能腦區(qū)TH陽性細胞強度和密度量化；（j）紋狀體對稱性評估，受損側(cè)（左腦，紫色）和未受損側(cè)（右腦，藍色）；（k）創(chuàng)傷周邊區(qū)域血管成像的凝集素染色腦圖像；（l-n）血管長度、表面積和分支量化

（7）miS@cGRAS 處理后全腦中的新生神經(jīng)元

腦損傷（TBI）會延長炎癥反應(yīng)，促進miR6236富集，并降低大腦中的多巴胺神經(jīng)傳遞（圖8a）。研究使用3D全鼠腦清除和免疫染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miS@cGRAS與AMF聯(lián)合治療顯著減少殘留損傷體積，增強神經(jīng)再生，表現(xiàn)為SMI312標(biāo)記的新神經(jīng)元數(shù)量最多（圖8b,d）。神經(jīng)纖維向損傷部位延伸，AMF照射進一步促進神經(jīng)再生和組織修復(fù)。治療后新生神經(jīng)元區(qū)域顯著增加，形成密集的神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)，歸因于miR6236的下調(diào)。外部渦流場的應(yīng)用使新生神經(jīng)元體積比對照組增加3.63倍，比單獨miS@cGRAS治療增加1.33倍，顯示協(xié)同促進神經(jīng)發(fā)生和組織修復(fù)的潛力。

在多巴胺神經(jīng)傳遞方面，通過分析酪氨酸羥化酶（TH）的分布和活性，發(fā)現(xiàn)miS@cGRAS+AMF組的TH強度在黑質(zhì)和黑質(zhì)紋狀體纖維束中顯著高于其他組（圖8i），表明治療刺激了多巴胺合成。該組黑質(zhì)紋狀體纖維束大小幾乎對稱，紋狀體形態(tài)對稱性恢復(fù)，左右腦平衡改善（圖8j）。此外，miS@cGRAS+AMF治療使創(chuàng)傷周邊區(qū)域血管生成增加約128%（圖8k,l,n），增強組織修復(fù)和恢復(fù)。

行為測試顯示，miS@cGRAS+AMF組在圓柱測試、網(wǎng)格測試和生面條測試中表現(xiàn)最佳，表明運動功能和精細動作技能恢復(fù)。生物可降解性和H&E染色評估表明，水凝膠植入物在14天內(nèi)降解，無毒性副產(chǎn)物，具有良好的生物相容性。