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針對(duì)上述問(wèn)題，浙江大學(xué)張寧、賀永團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了基于螺旋微針貼片（T-MN@EXO@miR-378）的藥物緩釋遞送系統(tǒng)，用于治療IVDD的纖維環(huán)損傷。研究制備了負(fù)載 EXO@miR-378 的螺紋微針，其基于 SiIMA 復(fù)合層粘連蛋白。SiIMA 的高硬度使微針貼片緊密貼合受損纖維環(huán)，層粘連蛋白可吸附并緩慢釋放外泌體。T-MN 遞送 EXO@miR-378 能恢復(fù) AF 細(xì)胞的線粒體自噬功能和 ECM 穩(wěn)態(tài)，展現(xiàn)出修復(fù)受損纖維環(huán)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。該研究為基于線粒體自噬恢復(fù)的長(zhǎng)期治療策略提供新思路，為 IVDD 臨床治療帶來(lái)新可能。相關(guān)成果于 2024 年 3 月 13 日以《Thread-structural microneedles loaded with engineered exosomes for annulus fibrosus repair by regulating mitophagy recovery and extracellular matrix homeostasis》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》。（DOI：10.1016/j.bioactmat.2024.03.006）。

圖1 T-MN@EXO@miR?378的制備與作用機(jī)制。（a）T-MN@EXO@miR?378和工程化外泌體制備示意圖；（b）T-MN@EXO@miR?378可持續(xù)釋放外泌體，調(diào)節(jié)ECM和線粒體自噬；（c）miR-378調(diào)控線粒體自噬途徑

（1）纖維環(huán)線粒體自噬在椎間盤(pán)退變中起保護(hù)作用

纖維環(huán)（AF）破壞在椎間盤(pán)退變（IVDD）中起著至關(guān)重要的作用（圖2A）。分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集GSE199866，比較人類退變AF細(xì)胞與正常AF細(xì)胞差異表達(dá)基因（DEGs）（圖2B）。KEGG分析顯示，差異基因涉及自噬（SQSTM1/BNIP3/WDR45B/CTSL/UBC/CTSD）和線粒體自噬（SQSTM1/BNIP3/UBC/ATF4）通路（圖2C）。推測(cè)自噬和線粒體自噬在椎間盤(pán)保護(hù)中重要。

以IL-1β誘導(dǎo)大鼠AF細(xì)胞退變模型為實(shí)驗(yàn)組，未處理大鼠AF細(xì)胞為對(duì)照組。RNA測(cè)序分析顯示，有7個(gè)自噬相關(guān)差異基因：Foxo1、Tsc1、Em1、Dlc1、Wdfy3、Fos和Map1lc3a（圖2D-F）。KEGG分析（圖2G）和GO注釋分析（圖2H）發(fā)現(xiàn)，這些自噬相關(guān)基因調(diào)控細(xì)胞過(guò)程和生物調(diào)節(jié)功能，與細(xì)胞膜成分密切相關(guān)。結(jié)果表明，退變AF細(xì)胞因自噬損傷導(dǎo)致線粒體膜受損。檢測(cè)退變AF細(xì)胞線粒體自噬水平，發(fā)現(xiàn)其顯著降低，抑制線粒體自噬的蛋白PINK1表達(dá)增加35%，促進(jìn)線粒體自噬的蛋白Parkin和LC3II/I分別減少25%和20%。Fundc1是編碼選擇性自噬和線粒體自噬相關(guān)蛋白的基因，實(shí)驗(yàn)組中Fundc1蛋白表達(dá)水平下降49%（圖2I和J）。表明AF退變模型中，AF細(xì)胞線粒體自噬功能受損。

為研究自噬對(duì)IVDD影響，構(gòu)建Fundc1敲除（KO）小鼠，通過(guò)尾椎穿刺疾病模型驗(yàn)證其作用（圖2K）。HE染色顯示，F(xiàn)undc1-KO受傷組椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)損傷更明顯，椎間盤(pán)高度下降更顯著（圖2L）。SO染色顯示，F(xiàn)undc1-KO受傷組AF軟骨成分減少更明顯（圖2M）。結(jié)果證明，線粒體自噬在退變AF細(xì)胞中起關(guān)鍵保護(hù)作用。

圖2 線粒體自噬相關(guān)基因在變性纖維環(huán)細(xì)胞中的變化及其在IVDD中的保護(hù)作用。（A）IVDD示意圖；（B）人體IVD數(shù)據(jù)集Umap；（C）人IVD中變性AF細(xì)胞與正常AF細(xì)胞DEG的KEGG富集分析；（D）體外大鼠IVD對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組mRNA轉(zhuǎn)錄譜熱圖；（E）實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組DEG火山圖；（F）對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組參與自噬DEG的mRNA轉(zhuǎn)錄譜熱圖；（G）對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組參與自噬DEG的mRNA轉(zhuǎn)錄譜KEGG富集分析；（H）對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組參與自噬DEG的mRNA轉(zhuǎn)錄譜GO注釋圖；（I）實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組線粒體自噬特征蛋白蛋白表達(dá)；（J）蛋白表達(dá)定量；（K）Fundc1 KO小鼠、IVDD模型及采樣過(guò)程示意圖；（L）各組HE染色圖像；（M）各組番紅O染色圖像

（2）T-MN@EXO@miR-378的制備與表征

為將藥物遞送至纖維環(huán)深層組織，設(shè)計(jì)微針（MN）結(jié)構(gòu)并采用3D打印技術(shù)制作模具，選擇甲基丙烯?；z素蛋白（SiIMA）作為微針主要材料以貼合纖維環(huán)剛性結(jié)構(gòu)（圖3A）。設(shè)計(jì)類似錐形螺紋的螺紋結(jié)構(gòu)微針，可增加摩擦力，使微針貼片牢固固定在組織上，防止髓核滲漏，同時(shí)增大與纖維環(huán)接觸面積，增加藥物釋放面積（圖3B）。為提高T-MN持續(xù)釋放外泌體能力，引入層粘連蛋白吸附外泌體，其長(zhǎng)臂末端可與外泌體上整合素和生長(zhǎng)因子相互作用（圖3C）。層粘連蛋白吸附作用和水凝膠內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)使外泌體滲透到T-MN內(nèi)部并附著在表面（圖3D）。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）證實(shí)層粘連蛋白與SiIMA成功混合，SiIMA酰胺I、II和III帶峰分別出現(xiàn)在1637、1515和1237 cm?1處，與β折疊構(gòu)象一致，混合后SiIMA酰胺帶轉(zhuǎn)變?yōu)棣谅菪龢?gòu)象，層粘連蛋白使SiIMA峰藍(lán)移并增強(qiáng)峰強(qiáng)度，利于吸附外泌體。如圖3D-F所示，25% SiIMA溶脹率最低，因高濃度下交聯(lián)度高，孔隙小。應(yīng)選孔隙率最高濃度確保藥物/因子釋放，但溶脹過(guò)大易使T-MN移位或突出，引發(fā)局部炎癥。測(cè)試四種不同濃度水凝膠的拉伸和壓縮模量，隨SiIMA濃度增加，模量均上升（圖3G和H）。綜合考慮溶脹性能和機(jī)械性能，選20% SiIMA作為主要成分。T-MN針尖強(qiáng)度重要，檢測(cè)單根針斷裂力（圖3I），20% SiIMA T-MN可承受超0.4 N力，能刺入纖維環(huán)表層。為驗(yàn)證T-MN貼片粘附效果，進(jìn)行剝離實(shí)驗(yàn)（圖3J），T-MN貼片最大剝離粘附力為0.47 N，是無(wú)微結(jié)構(gòu)貼片的1.6倍。

驗(yàn)證外泌體和EXO@miR-378表征，通過(guò)超聲震蕩法將miR-378加載到外泌體中。超聲震蕩法使外泌體膜輕微形變（圖3K），外泌體尺寸約100 nm（圖3L），表面蛋白CD81和TSG101陽(yáng)性，陰性蛋白Calnexin未表達(dá)，證明外泌體純度（圖3M）。將EXO@miR-378與DID染料溶液共染色1小時(shí)后，與T-MN針尖部分孵育24小時(shí)，共聚焦顯微鏡掃描顯示EXO@miR-378吸附在T-MN表面（圖3N）。研究人員成功構(gòu)建適應(yīng)纖維環(huán)結(jié)構(gòu)并攜帶EXO@miR-378的T-MN@EXO@miR-378系統(tǒng)。

圖3 T-MN@EXO@miR?378的制備和表征。（A）制備程序；（B）（i）PDMS模具微孔SEM圖像，（ii）單個(gè)微孔SEM圖像，（iii）miR?378處T-MN@EXO的SEM圖像，（iv）單個(gè)T-MN@EXO@miR?378的SEM圖像；（C）SilMA-層粘連蛋白水凝膠溶液制備；（D）不同濃度（i）10%，（ii）15%，（iii）20%，（iv）25%的SilMA水凝膠微觀孔SEM圖像；（E）SilMA、層粘連蛋白和SilMA-層粘連蛋白的FTIR光譜；（F）不同濃度SilMA水凝膠隨時(shí)間的溶脹率；（G）不同濃度SilMA水凝膠的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線和模量；（H）不同濃度SilMA水凝膠的壓縮應(yīng)力應(yīng)變曲線和模量；（I）不同濃度SilMA水凝膠單根微針的力-位移曲線和斷裂力；（J）具有T-MN結(jié)構(gòu)和不具有MN結(jié)構(gòu)的貼片的剝離力和剝離粘附力；（K）外泌體（EXO）和EXO@miR-378的TEM分析；（L）外泌體和EXO@miR-378的NTA分析；（M）通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法對(duì)鈣調(diào)蛋白、TSG 101和CD 81的外泌體表征；（N）T-MN和T-MN@EXO@miR?378的熒光圖像（紅色：T-MN；綠色：外泌體）

（3）T-MN@EXO@miR-378調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)代謝和纖維環(huán)細(xì)胞遷移

將T-MN@EXO@miR-378倒置于培養(yǎng)基中，使EXO@miR-378釋放并被纖維環(huán)細(xì)胞攝取（圖4A）。分別用T-MN、T-MN@EXO和T-MN@EXO@miR-378預(yù)處理纖維環(huán)細(xì)胞后與IL-1β共培養(yǎng)24小時(shí)。結(jié)果顯示，T-MN@EXO組使纖維環(huán)細(xì)胞MMP13表達(dá)降低42%，T-MN@EXO@miR-378組降低49%（圖4B），表明二者均能抑制細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。T-MN@EXO和T-MN@EXO@miR-378分別使Col I表達(dá)增加72%和150%（圖4C），證明T-MN@EXO@miR-378在退變環(huán)境下促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成的能力優(yōu)于T-MN@EXO，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果一致（圖4D和E）。為驗(yàn)證T-MN@EXO@miR-378對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞遷移的影響，在培養(yǎng)皿底部劃線模擬細(xì)胞缺損，觀察12小時(shí)和24小時(shí)后細(xì)胞遷移距離。結(jié)果顯示，T-MN@EXO和T-MN@EXO@miR-378組遷移距離較IL-1β組增加近三倍（遷移率提高35%）（圖4F-H）。

圖4 T-MN@EXO@miR?378對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成與分解及纖維環(huán)（AF）細(xì)胞遷移的影響。（A）T-MN@EXO@miR?378對(duì)AF細(xì)胞作用的示意圖；（B）各組Col I、Col II、聚集蛋白聚糖和MMP13的蛋白表達(dá)；（C）Col I和MMP13蛋白表達(dá)的定量分析；（D）各組MMP13的熒光圖像；（E）各組IL-1β刺激后Col I的熒光圖像；（F）各組的遷移實(shí)驗(yàn)；（G）各組12小時(shí)和24小時(shí)遷移率的定量分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示，與IL-1β+PBS組相比，*p<0.05，**p<0.01

（4）T-MN@EXO@miR-378促進(jìn)纖維環(huán)細(xì)胞線粒體自噬

采用JC-1試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，T-MN@EXO使退變纖維環(huán)細(xì)胞JC-1聚集體/單體比值提高275%，T-MN@EXO@miR-378可恢復(fù)至對(duì)照組水平的92%（圖5A）。線粒體形態(tài)觀察顯示，退變纖維環(huán)細(xì)胞線粒體嵴空泡化，T-MN@EXO@miR-378處理后部分恢復(fù)至正常形態(tài)（圖5C）。Western blot結(jié)果顯示，T-MN@EXO@miR-378使線粒體自噬抑制蛋白p62和PINK1表達(dá)降低，促進(jìn)蛋白Fundc1表達(dá)增加（圖5B）。免疫熒光染色顯示，T-MN@EXO和T-MN@EXO@miR-378均降低p62蛋白表達(dá)水平（圖5D），增加LC3蛋白表達(dá)水平（圖5E）。研究還發(fā)現(xiàn)，T-MN@EXO@miR-378通過(guò)PDK1-Akt通路影響自噬激活（圖5F），可降低PDK和pAkt蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)FoxO1和FoxO3蛋白表達(dá)（圖5G）。

圖5 T-MN@EXO@miR?378對(duì)AF細(xì)胞線粒體自噬和功能的影響。（A）各組JC-1熒光圖；（B）各組p62、PINK1、Fundc1蛋白表達(dá)；（C）各組線粒體透射電鏡觀察；（D）各組IL-1β刺激后p62的熒光圖像；（E）各組IL-1β刺激后LC3的熒光圖像；（F）miR-378恢復(fù)自噬途徑的示意圖；（G）各組PDK1、p-Akt、Akt、FoxO1、FoxO3蛋白表達(dá)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（n=8）表示，與對(duì)照組相比，*p<0.05，**p<0.01

（5）T-MN@EXO@miR-378持續(xù)釋放EXO@miR-378促進(jìn)纖維環(huán)修復(fù)的體內(nèi)研究

在大鼠尾椎節(jié)段建立纖維環(huán)損傷模型，分別給予T-MN、T-MN@EXO和T-MN@EXO@miR-378處理后進(jìn)行肌皮縫合（圖6A和B）。結(jié)果顯示，受損椎間盤(pán)高度隨時(shí)間降低，術(shù)后4周T-MN@EXO@miR-378組椎間盤(pán)高度指數(shù)（DHI%）較損傷組保留率提高28%，8周時(shí)優(yōu)勢(shì)更顯著（圖6D-E）。大體觀察顯示T-MN@EXO@miR-378組椎間盤(pán)形態(tài)保持最佳（圖6F）。DID熒光標(biāo)記檢測(cè)外泌體緩釋特性，負(fù)載層粘連蛋白的T-MN組第1天外泌體滯留能力顯著，7天后含量仍高于無(wú)層粘連蛋白組（圖6G）。安全性評(píng)估顯示，T-MN@EXO@miR-378長(zhǎng)期滯留未引起心、肝、脾、腎等器官炎癥反應(yīng)（圖6H），血液生化指標(biāo)檢測(cè)表明該治療系統(tǒng)對(duì)重要器官功能無(wú)顯著影響（圖6I）。

圖6 T-MN@EXO@miR?378對(duì)椎間盤(pán)高度的保護(hù)作用及體內(nèi)外泌體釋放特性。（A）大鼠椎間盤(pán)退變（IVDD）修復(fù)中T-MN@EXO@miR?378的示意圖；（B）手術(shù)示意圖；（C）椎間盤(pán)高度指數(shù)（DHI）的計(jì)算方法；（D）各組4周和8周時(shí)的椎間盤(pán)X線圖像；（E）4周和8周時(shí)DHI的評(píng)估；（F）各組椎間盤(pán)的外觀視圖；（G）DID標(biāo)記的外泌體在第1、3、7天的體內(nèi)外泌體熒光強(qiáng)度；（H）對(duì)照組和T-MN@EXO@miR?378組的心臟、腎臟、脾臟和肝臟的HE染色圖像；（I）血生化指標(biāo)（Ca、CRE、ALP、Na、K、Cl、GOT/GPT、BUN）與對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)

（6）T-MN@EXO@miR-378恢復(fù)纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)和線粒體自噬的體內(nèi)研究

對(duì)各組進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）和番紅O-固綠（SO）染色。組織學(xué)分析顯示，SO染色中T-MN@EXO@miR-378組能更好地保護(hù)內(nèi)層纖維環(huán)和髓核的軟骨成分（紅色區(qū)域）（圖7A），HE染色結(jié)果顯示各組椎間盤(pán)狀態(tài)的變化（圖7B）。免疫組化（IHC）染色分析證實(shí)，損傷組中線粒體自噬促進(jìn)蛋白（Fundc1、Parkin）表達(dá)較低，而線粒體自噬抑制蛋白（PINK1）表達(dá)較高，T-MN@EXO@miR-378能促進(jìn)線粒體自噬促進(jìn)蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制線粒體自噬抑制蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)ECM穩(wěn)態(tài)（圖7C和D）。在Fundc1基因敲除（KO）小鼠中建立椎間盤(pán)穿刺模型，結(jié)果顯示，纖維環(huán)受損的Fundc1 KO小鼠的線粒體自噬功能受損更嚴(yán)重，ECM損傷也更顯著（圖7E和F）。

圖7 T-MN@EXO@miR?378對(duì)ECM合成、分解及體內(nèi)線粒體自噬的影響。（A）各組番紅O染色圖像；（B）各組HE染色圖像；（C）各組MMP13和Col I的免疫組化檢測(cè)；（D）各組Fundc1、Parkin和PINK1的免疫組化檢測(cè)；（E）WT、FUNDC1 KO、WT-損傷和FUNDC1-KO-損傷組的MMP13和Col I的免疫組化檢測(cè)；（F）WT、FUNDC1-KO、WT-損傷和FUNDC1-KO-損傷組的Fundc1、Parkin和PINK1的免疫組化檢測(cè)