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針對上述問題，華南理工大學(xué)曹曉東教授團隊提出了一種新的概念設(shè)計，通過在聚多巴胺（PDA）和聚-L-賴氨酸（PLL）修飾的鎂摻雜生物活性玻璃（MgBG）界面上，對來自骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的細胞外小囊泡（sEVs）進行自組裝編程，成功構(gòu)建了一種新型的sEVs@PPMB（EPPM）囊泡簇，該囊泡簇在增強內(nèi)吞作用方面具有非凡的效率。通過將溫和的席夫堿反應(yīng)與氧化葡聚糖（OD）和季銨化殼聚糖（QCS）相結(jié)合，開發(fā)了一種多功能水凝膠（EPPMO），可以快速促進糖尿病傷口愈合。該文章于2025年4月3日以《A multifunctional hydrogel loaded with magnesium-doped bioactive glass-induced vesicle clusters enhances diabetic wound healing by promoting intracellular delivery of extracellular vesicles》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2025.03.025）。

圖1. EPPMO水凝膠制備工藝示意圖

（1）PPMO水凝膠的表征

如圖2a所示，利用聚多巴胺（PDA）和聚-L-賴氨酸（PLL）修飾MgBG來合成PPMB，再由PPMB和QCS與OD通過席夫堿反應(yīng)制備得到了PPMO水凝膠。Zeta電位分析（圖2b）表明PP0.5-MB電位為4.75 ± 4.11 mV。 PPMO水凝膠的制備過程如圖2c所示，PPMB和QCS側(cè)鏈上的氨基與OD側(cè)鏈上的醛基通過席夫堿反應(yīng)結(jié)合，凝膠化時間約為120秒，席夫堿鍵的動態(tài)可逆性賦予了PPMO水凝膠良好的可注射性、自愈合性和組織粘附性。PPMO水凝膠的可注射性如圖2d所示，它可以通過1毫升注射器均勻擠出，形成完整的星形或圓形。PPMO水凝膠的自愈合特性如圖2e所示，當兩塊紅色和藍色的PPMO水凝膠接觸并融合時，它們會形成一個沒有明顯邊界的單一實體。PPMO水凝膠的組織界面粘附特性如圖2f所示，水凝膠可以粘附在豬皮表面，在旋轉(zhuǎn)或折疊后仍能保持其形狀。具有光熱效應(yīng)的水凝膠敷料在近紅外（NIR）光激發(fā)下可以產(chǎn)生局部高溫，有效破壞細菌生物膜，PDA修飾的PPMB的加入使這些水凝膠具有將光能轉(zhuǎn)化為熱能的能力。使用808 nm NIR在不同功率水平下測試了5% PPMO水凝膠的光熱效應(yīng)，如圖2g和h所示。經(jīng)過10分鐘的照射后，隨著NIR強度從0.5 W/cm2逐漸增加到2 W/cm2，5% PPMO水凝膠的最大光熱溫度從39.7 ℃上升到64.3 ℃。隨后，評估了在1 W/cm2的NIR強度下不同PPMB含量的水凝膠的光熱性能，如圖2i和j所示。與OQ水凝膠相比，PPMO水凝膠的最大光熱溫度隨著PPMB含量的增加而呈梯度增加，顯示出濃度依賴性關(guān)系。然而，超過50 ℃的溫度可能會導(dǎo)致sEVs中的miRNA和其他活性成分降解。因此，后續(xù)實驗采用1 W/cm2的NIR強度、6分鐘的照射時間和45 ℃的目標溫度。

圖2. PPMO水凝膠的表征。（a）水凝膠制備示意圖。（b）納米粒子的Zeta電位分析結(jié)果。（c）水凝膠的制備工藝。（d）水凝膠的可注射性。（e）水凝膠的自愈合性能。（f）水凝膠的皮膚粘附性能。（g）5% PPMO水凝膠在不同近紅外強度下的溫度變化曲線。（h）5% PPMO在不同近紅外強度下的溫度變化圖像。（i）近紅外強度為1 W/cm2時水凝膠的溫度變化曲線。（j）近紅外強度為1 W/cm2時水凝膠的溫度變化圖像

（2）EPPMO水凝膠的表征

如圖3a所示。首先，從骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）中提取sEVs，通過sEVs與PPMB的蛋白吸附和靜電相互作用成功制備EPPM囊泡簇，TEM和粒徑分析顯示sEVs呈球形或盤狀，平均直徑為63.1 ± 4.12 nm（圖3b和c）。通過將sEVs與PPMB共孵育來制備EPPM囊泡簇，結(jié)果如圖3d所示，sEVs用綠色細胞膜綠色熒光標記染色，與未修飾的MgBG相比，PDA-MgBG、PP0.2-MB和PP0.5-MB的sEVs熒光強度顯著更高。如圖3e所示，未處理的MgBG的sEVs負載率為4.4 ± 0.40%，而僅用PDA修飾的PDA-MgBG顯示出一定的負載能力，PP0.5-MB（用PDA和PLL修飾）的sEVs負載率為66.5 ± 0.46%，顯著高于其他納米顆粒。為了驗證sEVs與PP0.5-MB之間的結(jié)合模式，進行了zeta電位分析（圖3f），表明通過PDA介導(dǎo)的蛋白吸附和靜電相互作用實現(xiàn)了sEVs的負載。通過Western blot分析（圖3g），與sEVs相比，負載在EPPM上的sEVs以及經(jīng)過EPPMO NIR（+）處理的sEVs的CD9、CD63和TSG101相對蛋白水平下降了，處理之間沒有顯著差異，這些結(jié)果表明，經(jīng)過一系列處理后制備的EPPMO中的sEVs保持了良好的生物功能。如圖3h所示，當sEVs直接負載在OQ水凝膠上時，EO水凝膠在pH = 6.5時3天內(nèi)快速釋放，釋放率約為70.8%。相比之下，EPPMO水凝膠在pH = 6.5時3天內(nèi)僅釋放了47.5%的sEVs。糖尿病傷口（DWs）的治療周期通常較長。EPPMO水凝膠的長期持續(xù)釋放sEVs可以有效延長sEVs在傷口部位的作用時間，從而促進傷口愈合。

圖3.EPPMO水凝膠的表征。（a）EPPM制備示意圖。（b）sEVs的透射電鏡圖像。（c）sEVs的納米顆粒粒徑分布。（d）復(fù)合納米顆粒的熒光圖像：sEVs（綠色）和PPMB（灰色）。（e）sEVs的裝載效率。（f）Zeta電位分析。（g）Western blot結(jié)果。（h）在pH 7.4和6.5條件下，水凝膠中sEVs的累積釋放結(jié)果

通過Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)評估了EPPMO水凝膠的細胞活性（圖4a）。細胞接種在孔板底部，將50 μL水凝膠放置在Transwell上層室中進行后續(xù)細胞實驗。通過3D成像（圖4b）證實sEVs（紅色）、PPMB（綠色）和EPPM在水凝膠中均勻分布，表明實現(xiàn)了納米顆粒的成功負載。持續(xù)性炎癥是糖尿病傷口愈合的主要挑戰(zhàn)之一，因此免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用對于糖尿病傷口修復(fù)至關(guān)重要。RAW 264.7細胞對囊泡簇的內(nèi)化作用分析（圖4c）表明，在12 h時，未修飾的MgBG組未觀察到明顯的綠色熒光，而PPMB被細胞內(nèi)化但熒光強度較低。與自由釋放的sEVs相比，EPPM的細胞內(nèi)化增加了約8.2倍（圖4d）。在糖尿病傷口的增殖階段，血管化對于營養(yǎng)運輸和傷口愈合至關(guān)重要。人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）是血管生成的關(guān)鍵參與者，研究了其對囊泡簇的內(nèi)化作用（圖4e）。HUVECs對納米顆粒攝取的熒光成像與RAW 264.7細胞的結(jié)果相似，EPPM顯示出顯著更高的細胞內(nèi)化效率，比單獨的sEVs高約16.7倍（圖4f）。將囊泡簇加載到EPPMO水凝膠中保留了sEVs的活性，增強了生物利用度，并促進了MgBG的細胞內(nèi)遞送和積累，有效調(diào)節(jié)了細胞的生物學(xué)功能。

圖4. EPPM囊泡簇的細胞內(nèi)化檢測。（a）細胞與EPPMO水凝膠共培養(yǎng)的示意圖。（b）水凝膠內(nèi)納米顆粒的分布情況。（c）水凝膠釋放的納米顆粒被RAW 264.7細胞攝取圖像和（d）定量熒光面積結(jié)果。（e）水凝膠釋放的納米顆粒被HUVECs攝取圖像和（f）定量熒光面積結(jié)果

（3）水凝膠的抗菌性能

在細菌感染會引發(fā)慢性炎癥，進一步阻礙傷口愈合。圖5a展示了水凝膠對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抗菌效果。在未使用近紅外光（NIR）處理的情況下，所有OQ水凝膠對大腸桿菌的抗菌率均超過90%。在使用NIR處理的情況下，PPMO和EPPMO水凝膠的光熱特性實現(xiàn)了約99.9%的抗菌率，瓊脂平板上的菌落計數(shù)結(jié)果（圖5b）與基于吸光度的抗菌結(jié)果一致。此外，圖5c展示了水凝膠對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抗菌效果，所有水凝膠在NIR處理和未處理的情況下，對金黃色葡萄球菌的抗菌率均超過95%，瓊脂平板結(jié)果（圖5d）也證實了這一點。這些結(jié)果表明，EPPMO水凝膠系統(tǒng)的光熱效應(yīng)可以有效殺死細菌，增強抗菌劑的療效，從而促進糖尿病傷口愈合。

圖5.在808納米近紅外（1 W/cm2）下的光熱抗菌效果水凝膠的抗菌性能。（a）水凝膠對大腸桿菌的抗菌率。（b）大腸桿菌菌落存活情況。（c）水凝膠對金黃色葡萄球菌的抗菌率。（d）金黃色葡萄球菌菌落存活情況。NIR（?）表示未進行近紅外處理，NIR（+）表示進行了近紅外處理

（4）水凝膠的生物相容性和細胞招募能力

為了評估水凝膠對L929成纖維細胞（L929）和HUVECs的細胞活性，采用CCK8實驗進行檢測。結(jié)果表明，含有sEVs的EO和EPPMO水凝膠不僅展現(xiàn)出良好的生物相容性，還能顯著促進細胞增殖（圖6a-d）。這種促進作用歸因于sEVs攜帶的多種促進細胞增殖的營養(yǎng)物質(zhì)。為了評估水凝膠的細胞招募能力，進行了12小時的Transwell實驗及其定量分析（圖6e-f），結(jié)果顯示，對照組和OQ水凝膠組沒有細胞招募能力。然而，添加了sEVs和MgBG的EO、PPMO和EPPMO水凝膠顯著增強了L929的招募能力，其中EPPMO水凝膠表現(xiàn)最為顯著。此外，通過劃痕實驗評估了水凝膠促進L929遷移的能力（圖6g），24小時后，對照組的遷移率為46.1 ± 10.96%，而EPPMO水凝膠組的遷移率達到了92.7 ± 4.07%，在EPPMO水凝膠組中，劃痕區(qū)域完全消失，表明其顯著促進了L929的遷移（圖6h）。

圖6.水凝膠的生物相容性和細胞招募性能。（a） L929細胞經(jīng)水凝膠處理后的活/死細胞染色結(jié)果。（b）經(jīng)水凝膠處理的L929細胞CCK8檢測結(jié)果。（c）通過水凝膠對人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行活/死細胞染色。（d）水凝膠處理后HUVECs的CCK-8檢測結(jié)果。（e-f）Transwell實驗及其半定量分析L929細胞與水凝膠的實驗結(jié)果。（g-h）劃痕試驗及其半定量分析結(jié)果

（5）巨噬細胞的M2表型極化

為了評估水凝膠對巨噬細胞極化的影響，使用RT-qPCR檢測了RAW 264.7巨噬細胞中炎癥相關(guān)基因的表達（圖7a），與未處理的對照組相比，LPS處理的M0巨噬細胞極化為促炎的M1型，表現(xiàn)為促炎因子TNF-α和iNOS表達升高，而抗炎因子Arg-1和IL-10表達降低。與LPS處理相比，EO、PPMO和EPPMO水凝膠組顯著降低了促炎因子TNF-α和iNOS的表達，同時顯著增加了抗炎因子Arg-1和IL-10的表達。此外，通過免疫熒光染色檢測了M1型巨噬細胞標記物iNOS和M2型巨噬細胞標記物IL-10的表達，結(jié)果由圖7b-e所示，與對照組、LPS組和OQ組相比，EPPMO水凝膠組的iNOS表達顯著降低，而IL-10表達顯著增加。此外，還對NF-κB信號通路中的p65蛋白進行了免疫熒光染色（圖7f），在未激活的NF-κB信號通路中，p65蛋白（紅色）保留在細胞質(zhì)中，核轉(zhuǎn)位受到抑制（對照組），經(jīng)LPS處理的巨噬細胞顯示出NF-κB信號通路的激活，極化為M1型巨噬細胞，p65轉(zhuǎn)移到細胞核（LPS組和OQ組）。與這些組相比，EPPMO水凝膠組顯示出最顯著的p65核轉(zhuǎn)位抑制，這是因為EPPMO水凝膠釋放的EPPM被細胞有效內(nèi)化，EPPM攜帶的miR-199a、miR-146等免疫調(diào)節(jié)miRNA與MgBG釋放的Mg2?協(xié)同作用，有效抑制了NF-κB信號通路的激活，從而防止了p65的核轉(zhuǎn)位，并促進了M1到M2型巨噬細胞的極化，實現(xiàn)了聯(lián)合抗炎效果。

圖7.水凝膠調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的能力。（a）通過RT-qPCR檢測巨噬細胞中的抗炎基因Arg-1和IL-10以及促炎基因TNF-α和iNOS的表達。（b-c）iNOS蛋白表達的免疫熒光染色及半定量分析。（d-e）免疫熒光IL-10蛋白表達的染色及半定量分析。（f） p65蛋白的免疫熒光染色

（6）水凝膠的促血管生成能力

在糖尿病傷口（DWs）的增殖階段，血管化對于營養(yǎng)運輸和傷口愈合至關(guān)重要。通過RT-qPCR檢測了人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）中血管生成相關(guān)基因的表達（圖8a-d），結(jié)果顯示，EPPMO水凝膠組顯著上調(diào)了HIF-α和VEGF基因的表達，同時VEGF受體KDR的表達也顯著增加，促進血管生成的eNOS基因在EPPMO水凝膠組中也表現(xiàn)出顯著上調(diào)。為了進一步評估水凝膠對HUVECs血管生成性能的影響，采用免疫熒光檢測了血管生成標記蛋白CD31的表達（圖8e-f），結(jié)果顯示，EO、PPMO和EPPMO水凝膠組均能促進CD31的表達，其中EPPMO水凝膠組的增加最為顯著。此外，還進行了基質(zhì)膠形成的管狀結(jié)構(gòu)實驗，結(jié)果如圖8g所示，呈現(xiàn)出與免疫熒光染色相似的趨勢。這些結(jié)果表明，EPPMO水凝膠通過促進血管生成相關(guān)基因的表達，增強了血管生成能力，從而在糖尿病傷口愈合過程中發(fā)揮了重要作用。

圖8.水凝膠血管生成性能的評價。（a-d）通過rt-qpcr檢測的huvec中血管生成相關(guān)基因hif-α，VEGF，KDR和eNOS的表達。（e-f）免疫熒光法測定CD31 蛋白的表達及其半定量分析結(jié)果。（g）基質(zhì)膠基質(zhì)形成血管的鈣黃素AM染色

（7）動物實驗

使用SD大鼠的糖尿病感染性全層皮膚缺損模型（圖9a）來評估水凝膠在體內(nèi)促進傷口愈合的能力。在術(shù)后3天，空白組（Blank）的傷口尚未結(jié)痂且有化膿現(xiàn)象（圖9b），而OQ和EO水凝膠組的傷口沒有顯著的化膿。此外，由于納米簇的溫和光熱效應(yīng)和QCS的抗菌特性，PPMO和EPPMO組的傷口迅速結(jié)痂，沒有明顯的感染和潰瘍跡象。值得注意的是，EPPMO組的傷口開始顯示出愈合的初步跡象。在術(shù)后14天，EPPMO組的傷口幾乎完全愈合，其他水凝膠組的傷口愈合情況良好，而空白組的傷口仍未完全結(jié)痂。對組織形態(tài)進行半定量分析（圖9c和d）顯示，EPPMO水凝膠組的傷口愈合率顯著高于其他組。

圖9.水凝膠系統(tǒng)結(jié)合近紅外輻射對促進糖尿病皮膚缺損愈合效果的評價。（a）糖尿病皮膚傷口模型的構(gòu)建過程示意圖。（b）用不同水凝膠樣品處理的皮膚傷口區(qū)域的宏觀圖像。（c）術(shù)后第3天、第7天及第14天的皮膚傷口閉合情況。（d）術(shù)后第3、7和14天的傷口閉合率定量數(shù)據(jù)

為了進一步研究SD大鼠的炎癥微環(huán)境和血管生成，對傷口組織進行了免疫組化染色，檢測抗炎標志物IL-10（綠色，圖10a,d）和促炎標志物TNF-α（紅色，圖10a,e），在第3天，空白組和OQ組顯示出顯著的TNF-α陽性表達，而IL-10表達為陰性。然而，在加入抗炎劑后，EO和PPMO組顯示出促炎因子的顯著減少和抗炎因子IL-10的陽性表達，在sEVs和PPMB的協(xié)同作用下，EPPMO組顯示出促炎因子的顯著減少和IL-10的陽性表達，表明其具有卓越的抗炎能力。使用免疫組化染色檢測α-SMA（綠色）和CD31（紅色）來評估DWs中的血管生成（圖10b,f），空白組和OQ組CD31表達較低，而含有sEVs的PPMO組增加了相關(guān)蛋白的表達，得益于sEVs和PPMO的協(xié)同作用，EPPMO組顯示出顯著增強的表達，血管生成有助于維持細胞代謝和增殖，從而促進糖尿病傷口愈合。 采用Masson染色來分析皮膚修復(fù)中的膠原沉積，如圖10c所示，在第3天和第7天，空白組僅表現(xiàn)出少量膠原表達（藍色）。EO和PPMO水凝膠組已經(jīng)開始膠原沉積，而EPPMO水凝膠顯示出顯著的膠原沉積。在第14天，空白組和OQ組均顯示出膠原表達，而含有活性物質(zhì)的EO、PPMO和EPPMO水凝膠顯示出更顯著的膠原表達，且EPPMO組的膠原排列緊密且成熟。

圖10. 組織學(xué)免疫熒光和Masson染色。（a）IL-10和TNF-α的免疫熒光染色。（b） α-SMA和CD31的免疫組化染色。（c）Masson染色。（d）IL-10免疫熒光染色的熒光面積的半定量結(jié)果。（e）TNF-α免疫熒光染色的熒光面積的半定量結(jié)果。（f）CD31免疫熒光染色的熒光面積的半定量結(jié)果