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針對(duì)上述問(wèn)題，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所范克龍、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科黨曉衛(wèi)和Ying Cui團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了“AND”邏輯門控納米反應(yīng)器NR@Cur@Gox，將姜黃素（Cur）與Gox共載于一體。該納米系統(tǒng)在生理pH的正常組織中保持疏水關(guān)閉狀態(tài)；到達(dá)酸性腫瘤細(xì)胞后，PC6A質(zhì)子化增強(qiáng)膜通透性，葡萄糖進(jìn)入核心被Gox分解為H?O?和葡萄糖酸；局部高濃度H?O?觸發(fā)納米載體自毀，釋放Cur和醌甲基化物。Cur抑制GLUT1表達(dá)，阻斷葡萄糖攝取和乳酸化，并協(xié)同醌甲基化物耗竭谷胱甘肽（GSH）。通過(guò)葡萄糖剝奪、H?O?累積與GSH耗竭，激活A(yù)MPK-SREBP1-SCD1-LPO和ROS-GPX4雙軸，協(xié)同誘導(dǎo)鐵死亡。饑餓與鐵死亡聯(lián)合引發(fā)強(qiáng)免疫原性細(xì)胞死亡，促進(jìn)CD8? T細(xì)胞增殖，降低Treg和M2-TAM，逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境為“熱”腫瘤，顯著抑制胰腺癌移植瘤生長(zhǎng)，并在與抗PD-L1聯(lián)合應(yīng)用時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)免疫治療效果，實(shí)現(xiàn)了“最大療效-最小副作用”的代謝干預(yù)策略。相關(guān)研究在2025年6月26日以“An ‘AND’ Logic Gate Nanoreactor for Metabolic Remodeling in Starvation-Ferroptosis-Immunotherapy of Pancreatic Cancer”為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI: 10.1002/adfm.202502221）。

圖1 一種“AND”邏輯門控納米反應(yīng)器（NRs@Cur@Gox）的自組裝及其“AND”邏輯藥物釋放、順序pH激活與ROS自焚降解機(jī)制，通過(guò)代謝重塑在腫瘤部位協(xié)同饑餓-鐵死亡-免疫療法

（1）pH-ROS雙響應(yīng)納米反應(yīng)器的制備與表征

DLS與TEM（圖2A）顯示NRs為均勻囊泡，僅在pH 5.5+1 mM H?O?出現(xiàn)雙峰并粒徑增大；ζ電位（圖2B）在此條件下由?10 mV升至+18.2 mV；GSH探針（圖2C）僅在pH 5.5+H?O?組GSH顯著降低，證實(shí)QM釋放。載藥NRs@Cur@Gox釋藥實(shí)驗(yàn)（圖2D–F）表明，Cur與Gox在pH 7.4或單一刺激下釋放<40%，而在pH 5.5+H?O?或+葡萄糖條件下分別約90%與85%，實(shí)現(xiàn)“AND”邏輯門控精準(zhǔn)釋藥。

圖2 NRs@Cur@Gox表征。（A）不同溶液中NRs尺寸分布（插圖TEM）；（B）zeta電位；（C）QM消耗；（D）釋放機(jī)制；（E-F）不同溶液中Cur與Gox釋放曲線；（G）NRs@Cur/NRs@FITCGox細(xì)胞內(nèi)攝取CLSM；（H）FCM分析

（2）雙藥納米反應(yīng)器重塑PC糖酵解-乳酸軸

細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)（圖2F–G）顯示，游離FITC-Gox幾乎無(wú)綠色熒光，而NRs@FITC-Gox在2 h和4 h的攝取率分別達(dá)75.0%與82.1%；同樣，NRs@Cur的攝取效率在2 h為82.6%，顯著高于游離Cur的62.5%，4 h時(shí)分別為91.2%與72.4%，提示納米載體顯著提升細(xì)胞內(nèi)遞送效率。機(jī)制研究（圖3A–C）表明，GLUT1–乳酸–MCT4軸的抑制可下調(diào)AMPK–SREBP1–SCD1信號(hào)，減少多不飽和脂肪酸（PUFA）過(guò)氧化，從而阻斷鐵死亡。代謝分析（圖3D–E）進(jìn)一步證實(shí)，NRs@Cur處理使胞外葡萄糖水平升高并降低胞內(nèi)葡萄糖與乳酸，NRs@Gox則同時(shí)降低胞內(nèi)外葡萄糖并促進(jìn)乳酸外排，而兩者聯(lián)合（NRs@Cur@Gox）可進(jìn)一步降低葡萄糖及乳酸水平。胞內(nèi)酸度檢測(cè)（圖3F–H）顯示，隨著乳酸減少，胞內(nèi)酸化程度下降，其中NRs@Cur@Gox組熒光信號(hào)最低，表明其在調(diào)節(jié)糖乳酸代謝及改善胞內(nèi)酸化方面具有最顯著效果。

圖3 NRs@Cur@Gox誘導(dǎo)饑餓與鐵死亡的機(jī)制示意圖。（A）葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)驅(qū)動(dòng)的饑餓抗性與免疫抑制微環(huán)境；（B）NRs@Cur重塑饑餓抗性；（C）NRs@Cur@Gox協(xié)同促進(jìn)饑餓-鐵死亡并逆轉(zhuǎn)免疫抑制；（D–F）細(xì)胞外與胞內(nèi)葡萄糖、乳酸及pH值變化；（G–H）胞內(nèi)pH的CLSM與流式定量；（I–J）胞內(nèi)LPO的CLSM與流式定量；（K）饑餓-鐵死亡軸蛋白Western印跡；（L）MCT4、GLUT1、GPX4免疫熒光；（M）線粒體bioTEM

（3）鐵死亡

活性氧熒光探針檢測(cè)（圖3I）顯示，NRs@Gox、NRs@Cur及NRs@Cur@Gox處理均可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生明顯綠色熒光，其中NRs@Cur@Gox組脂質(zhì)過(guò)氧化（LPO）水平較對(duì)照升高約3.6倍（圖3J）。進(jìn)一步的分子機(jī)制分析（圖3K–L）表明，NRs@Cur@Gox顯著激活A(yù)MPK信號(hào)并上調(diào)SREBP1–SCD1通路，同時(shí)抑制GPX4表達(dá)、升高ACSL4水平；免疫熒光結(jié)果亦顯示MCT4和GLUT1下調(diào)、GPX4顯著降低。超微結(jié)構(gòu)觀察（圖3M）可見(jiàn)線粒體體積縮小、嵴結(jié)構(gòu)消失及外膜破裂；JC-1染色結(jié)果提示該組紅色熒光最弱、綠色熒光最強(qiáng)，表明線粒體膜電位顯著下降。

（4）體外抗腫瘤

血液相容性檢測(cè)（圖4A）顯示，NRs在200 μg mL?1濃度下未引起溶血反應(yīng)。細(xì)胞活力測(cè)定（圖4B）表明，PBS組在24 h和48 h的存活率接近100%，NRs@Cur組分別為61%和52%，NRs@Gox組為88%和95%，而NRs@Cur@Gox組最低，僅為50%和35%，其聯(lián)合指數(shù)接近1，提示Cur與Gox協(xié)同致死效應(yīng)有限。細(xì)胞增殖與死亡染色（圖4C）結(jié)果顯示，Calcein-AM/PI及結(jié)晶紫檢測(cè)的增殖能力順序?yàn)镻BS > NRs@Gox > NRs@Cur > NRs@Cur@Gox，其中NRs@Cur@Gox組細(xì)胞死亡率超過(guò)50%。凋亡分析（圖4D）進(jìn)一步驗(yàn)證了該趨勢(shì)，Annexin V-FITC/PI流式檢測(cè)顯示NRs@Cur@Gox組細(xì)胞存活率僅為19.1%。廣譜MTT檢測(cè)結(jié)果表明，NRs@Cur@Gox對(duì)所有受試腫瘤細(xì)胞系均表現(xiàn)出顯著的殺傷活性。

圖4 NRs@Cur@Gox體外抗癌功效。（A）不同濃度NRs溶血分析；（B）Pan02細(xì)胞經(jīng)不同NRs處理24 h與48 h后的活力；（C）結(jié)晶紫及Calcein-AM/PI染色示活（綠）死（紅）細(xì)胞；（D）不同NRs誘導(dǎo)的凋亡流式分析，活細(xì)胞列于矩形框內(nèi)；（E-F）CRT與HMGB1免疫熒光染色；（G-H）CRT流式定量與HMGB1 ELISA檢測(cè)；（I）上清液ATP含量

（5）體外ICD效應(yīng)、DC成熟和TAM極化

免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)（圖4E–I）顯示，NRs@Cur@Gox處理可誘導(dǎo)最強(qiáng)的CRT膜暴露紅色熒光及最顯著的HMGB1核-質(zhì)易位與胞外釋放；量化結(jié)果表明，其CRT綠色熒光強(qiáng)度高于NRs@Cur與NRs@Gox，且顯著高于PBS組，培養(yǎng)上清中HMGB1含量亦最高。同時(shí)，NRs@Cur@Gox處理后ATP分泌量約為PBS組的2.1倍。免疫激活分析（圖5A–B）顯示，NRs@Cur@Gox可將CD80?CD86?MHC II?樹(shù)突狀細(xì)胞比例提升至最高水平。巨噬細(xì)胞極化實(shí)驗(yàn)（圖5C–D）進(jìn)一步表明，NRs@Cur@Gox組上清可使M1型（F4/80?CD86?）比例升至45.8±5.2%，而M2型（F4/80?CD206?）比例下降至3.05±1.5%。炎癥因子檢測(cè)（圖5E–F）結(jié)果顯示，NRs@Cur@Gox組IL-12α、TNF-α、iNOS及IL-6表達(dá)水平最高，IL-10最低，提示其在促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

圖5 NRs@Cur@Gox體外免疫應(yīng)答。（A）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟；（B）對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度定量；（C）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TAM極化；（D）對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度定量；（E）CD80與CD206免疫熒光圖像；（F）RT-PCR定量M1-及M2-TAM相關(guān)炎癥因子

（6）體內(nèi)分布驗(yàn)證與ICD-免疫微環(huán)境重塑

體內(nèi)分布成像（圖6A–C）顯示，NRs@DiD經(jīng)靜脈注射后在8 h時(shí)腫瘤部位熒光達(dá)到峰值，其強(qiáng)度約為游離DiD的1.92倍；即使在給藥24 h后，離體腫瘤組織熒光仍高出1.71倍，提示其具備優(yōu)異的腫瘤富集與滯留能力。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步表明，NRs@Cur@Gox組腫瘤組織中GLUT1和MCT4表達(dá)最低，GPX4顯著抑制，同時(shí)CRT膜暴露最強(qiáng)，HMGB1外排量最高。免疫激活分析（圖6F）顯示，腫瘤引流淋巴結(jié)中CD80?CD86?CD11c?成熟樹(shù)突狀細(xì)胞比例在NRs@Cur@Gox組達(dá)12.0±1.0%，為各組最高。免疫微環(huán)境重塑分析（圖6G）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，NRs@Cur@Gox組CD8?T細(xì)胞浸潤(rùn)量較PBS組升高2.42倍，分別為NRs@Cur和NRs@Gox組的1.41倍和1.28倍；F4/80?CD206? M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞占比則降至PBS組的0.35倍、NRs@Cur組的0.51倍及NRs@Gox組的0.36倍，表明其在抑制免疫抑制性細(xì)胞、增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤(rùn)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

圖6 NRs體內(nèi)生物分布與免疫應(yīng)答。（A）靜脈注射NRs@DiD或游離DiD（2.5 mg DiD kg?1）后不同時(shí)間Pan02荷瘤小鼠活體熒光成像；（B）對(duì)應(yīng)腫瘤平均熒光強(qiáng)度；（C）24 h離體腫瘤及主要器官熒光成像；（D）24 h離體組織平均熒光強(qiáng)度；（E）實(shí)驗(yàn)流程及治療計(jì)劃示意圖；（F）流式分析dLN CD80?CD86?細(xì)胞及脾CD4?、CD8?、F4/80?CD206?細(xì)胞；（G）對(duì)應(yīng)流式定量

（7）體內(nèi)抗腫瘤

體內(nèi)抗腫瘤療效評(píng)估（圖7A–E）顯示，小鼠分別于第1、4、7天靜脈注射PBS、NRs@Cur、NRs@Gox或NRs@Cur@Gox（Cur劑量5 mg kg?1）。在21 d觀察期內(nèi)，NRs@Cur與NRs@Gox單藥組腫瘤體積均增長(zhǎng)至約1000 mm3，而NRs@Cur@Gox組腫瘤生長(zhǎng)完全停滯并出現(xiàn)輕度回縮，其終末腫瘤重量亦為最低（圖7D）。組織學(xué)分析（圖7F–G）表明，NRs@Cur@Gox組腫瘤組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例最高，H&E染色亦呈現(xiàn)最顯著的凋亡與組織破壞。安全性評(píng)估（圖7H–I）顯示，各組小鼠體重曲線均平穩(wěn)，主要臟器H&E形態(tài)學(xué)及血生化指標(biāo)在NRs@Cur@Gox組與PBS對(duì)照間無(wú)顯著差異，提示該聯(lián)合體系具備優(yōu)良的體內(nèi)安全性。

圖7 NRs@Cur@Gox體內(nèi)抗腫瘤作用。（A）腫瘤誘導(dǎo)及治療流程示意圖；（B-C）21 d內(nèi)Pan02腫瘤體積變化；（D）第21 d腫瘤重量；（E）第21 d離體腫瘤照片；（F）第21 d腫瘤TUNEL凋亡染色；（G）第21 d腫瘤及主要器官H&E染色；（H）21 d體重曲線；（I）21 d血清生化指標(biāo)

（8）NRs@Cur@Gox 協(xié)同 aPD-L1 打破免疫抑制

協(xié)同免疫治療效果評(píng)估（圖8A–E）顯示，在Pan02荷瘤小鼠模型中，NRs@Cur@Gox聯(lián)合aPD-L1治療可顯著抑制腫瘤進(jìn)展。PBS組小鼠腫瘤體積在第13天即增至約800 mm3，而聯(lián)合治療組腫瘤重量?jī)H約0.25 g，且體重?zé)o顯著變化。免疫微環(huán)境分析（圖8F–I）進(jìn)一步表明，聯(lián)合治療組在腫瘤及脾臟中均表現(xiàn)出最高比例的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL, CD3?CD8?）和輔助性T細(xì)胞（CD3?CD4?），同時(shí)Treg及M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）比例最低，提示該策略可有效增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答并緩解免疫抑制微環(huán)境。

圖8 NRs@Cur@Gox聯(lián)合aPD-L1體內(nèi)協(xié)同抑瘤。（A）腫瘤誘導(dǎo)及治療流程示意圖；（B-C）13 d內(nèi)Pan02腫瘤體積變化；（D）第13 d離體腫瘤照片；（E）第13 d腫瘤重量；（F-G）腫瘤與脾臟免疫細(xì)胞流式分析；（H-I）對(duì)應(yīng)免疫細(xì)胞定量