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針對上述問題，浙江大學計劍和王幽香團隊開發(fā)了氧氣爆破微針（MN）系統(tǒng)，以減輕增生性疤痕（HS）中的低氧狀況并增強5 - 氟尿嘧啶（5 - Fu）的治療效果。實驗發(fā)現(xiàn)低氧條件下5 - Fu對人類HS纖維母細胞的細胞毒性顯著降低。轉(zhuǎn)錄組分析揭示了147個與5 - Fu響應(yīng)相關(guān)的基因在低氧環(huán)境下表達改變，特別是參與有絲分裂細胞周期過程的基因 ?；诖耍芯咳藛T設(shè)計了包含高壓氧氣捕獲顆粒（HOTP）的核心 - 殼層MN平臺，可局部共遞送氧氣和5 - Fu，改善藥物穿透致密HS組織的效果。體內(nèi)實驗結(jié)果證實該MN系統(tǒng)能有效緩解低氧狀態(tài)，顯著提升5 - Fu的治療效果。研究還展示了HOTP MNs的制備過程及其在HS組織中應(yīng)用時的有效性和安全性，為優(yōu)化HS療法提供了新策略。該文章于2025年4月18日以《Hypoxia alleviation enhances the efficacy of 5-fluorouracil in hypertrophic scar therapy via an oxygen-popping microneedle system》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI: 10.1002/adfm.202422678）。

圖1 研究示意圖

（1）低氧和常氧條件下5-Fu對HSFbs的作用差異

圖2A顯示，在常氧條件下，隨著5-Fu濃度增加，細胞存活率逐漸下降至100 μg/mL時為51.7%；低氧條件下細胞存活率維持在80%以上，表明低氧顯著削弱5-Fu的細胞毒性。圖2B通過Calcein-AM（綠色熒光）和碘化丙啶（紅色熒光）標記活細胞和死細胞，進一步證實低氧環(huán)境下5-Fu細胞毒性降低。圖2C的RNA測序分析表明，在常氧條件下，5-Fu處理后有554個差異表達基因（DEGs），其中191個上調(diào)，363個下調(diào)。圖2D對比低氧與常氧條件下5-Fu處理后的DEGs，發(fā)現(xiàn)兩者存在顯著差異。圖2E的Venn圖顯示兩組共有147個DEGs，這些基因在低氧條件下表達模式不同。圖2F的基因本體論（GO）富集分析顯示，這些DEGs主要涉及細胞遷移、有絲分裂細胞周期過程及磷酸代謝過程的調(diào)控。圖2G以熱圖形式展示與有絲分裂細胞周期相關(guān)的基因表達變化，表明在常氧條件下5-Fu可有效抑制BUB1和SPAG5等基因表達，而在低氧條件下這種抑制作用減弱。

圖2 缺氧對HSFbs中5-Fu療效的影響。（a）細胞活力；（b）不同處理后HSFbs的活/死染色的代表性熒光圖像；（c）常氧/5-Fu和常氧組之間DEG的火山圖；（d）低氧/5-Fu組和常氧/5-Fu組之間DEG的火山圖；（e）維恩圖，顯示常氧/5-Fu與常氧和低氧/5-Fu與常氧/5-Fu比較之間的交叉DEG；（f）顯著豐富了相交DEG的GO項；（g）在相交DEG中有絲分裂細胞周期過程基因的熱圖分析

（2）HOTP的研制及其對缺氧和5-Fu增效作用的體外評價

圖3A展示了HOTP的制備流程，通過注入氧氣并快速冷卻熔融碳水化合物混合物，成功捕獲高壓氧氣。圖3B顯示HOTP在水環(huán)境中迅速釋放大量氧氣氣泡，同時通過添加羅丹明6G（Rh6G）標記的不含氧氣顆粒（NOP）進行對比（詳見支持信息中的Figure S8和Videos S1和S2）。圖3C表明，HOTP加入脫氧PBS溶液后，氧氣濃度在60秒內(nèi)急劇增加，隨后逐漸降低。圖3D的免疫熒光成像顯示，低氧條件下HIF-1α表達增強，而HOTP處理顯著下調(diào)其表達。圖3E和圖3F的Western blot分析進一步證實HOTP對HIF-1α蛋白表達的抑制作用。圖3G顯示，在低氧條件下，HOTP與5-Fu共處理顯著增強細胞毒性，將細胞存活率降低至57.9%（100 μg/mL 5-Fu濃度），表明HOTP有效緩解低氧狀態(tài)并增強5-Fu療效。

圖3 HOTP的開發(fā)和表征。（a）HOTP制造工作流程；（b）HOTP的代表性照片及在PBS溶液中的視圖；（c）氧釋放動力學：加入HOTP后PBS溶液中氧濃度的變化；（d）不同處理的HSFb的免疫熒光圖像（綠色熒光：HIF-1α，藍色熒光：用DAPI染色的細胞核）；（e）各組中HIF-1α表達的代表性Western blot條帶；（f）HIF-1α表達的相應(yīng)定量數(shù)據(jù)（n=3個生物學上獨立的樣品）；（g）5-Fu/NOP和5-Fu/HOTP共處理后低氧下HSFbs的細胞存活率

（3）MN體系的制備與表征

圖4A展示了MN系統(tǒng)制備流程，包括制備可溶解的MN殼層結(jié)構(gòu)并將HOTP加載至微腔中。圖4B提供了MN在HOTP封裝前后的照片，顯示微腔結(jié)構(gòu)的變化。圖4C和圖4D展示了包含5×5陣列的HOTP MNs的照片及其SEM圖像，顯示圓錐形針頭高度為1400 μm、基底直徑為700 μm。圖4E對比了PVP固體MN、含微腔MN及HOTP MN的壓力-位移曲線，表明HOTP MN具有良好的機械強度。圖4F通過H&E染色證實HOTP MN應(yīng)用于HS組織后可有效改善局部低氧狀態(tài)。圖4G顯示應(yīng)用霜劑或MN后20分鐘內(nèi)HS組織的熒光橫截面圖像，表明MN顯著提高了藥物滲透效率。

圖4 MN系統(tǒng)的制造和表征。（a）HOTP MN制造的工作流程；（b）HOTP包封前后具有微腔的MN的代表性照片；（c）HOTP MN的代表性照片；（d）HOTP MN的SEM圖像；（e）PVP固體MN、具有微腔的MN和HOTP MN的壓縮力-位移圖；（f）應(yīng)用HOTP MN后HS組織的H&E染色；（g）施用乳膏或MNs 20分鐘后HS組織的代表性熒光橫截面圖像（合并：亮視野+紅色Rh 6G）

（4）MN系統(tǒng)對HS的體內(nèi)治療效果

圖5A展示了實驗設(shè)計示意圖，說明通過每周一次的MN系統(tǒng)局部應(yīng)用評估療效的過程。圖5B的micro-CT分析結(jié)果顯示，HOTP MNs處理顯著改善低氧環(huán)境并減少紊亂的骨小梁結(jié)構(gòu)。圖5C的H&E染色和番紅O/快綠染色圖像顯示，HOTP MNs處理顯著改善HS組織中細胞排列和基質(zhì)密度。圖5D表明，HOTP MNs處理后膠原蛋白含量顯著增加，促進膠原蛋白合成。圖5E的免疫熒光染色驗證了HOTP MNs處理組中膠原蛋白II（COL II）和聚集蛋白聚糖（ACAN）表達增加，同時IL-6表達減少，抑制炎癥反應(yīng)。圖5F的定量分析結(jié)果表明，HOTP MNs促進細胞外基質(zhì)（ECM）成分合成。圖5G顯示，HOTP MNs處理后疤痕厚度顯著減少，改善HS病理狀態(tài)。

圖5 F/R凝膠在兔耳增生性瘢痕模型中的體內(nèi)抗瘢痕評估。（a）實驗各階段時間軸示意圖；（b）第0天創(chuàng)面以及不同處理前后瘢痕照片；（c）第40天瘢痕組織H&E染色、Masson三色染色及天狼星紅染色的典型圖像；（d–f）基于染色圖像的瘢痕指數(shù)（SEI）、真皮細胞密度及I/III型膠原比率的定量分析（n = 3獨立生物樣本）；（g）第40天各組瘢痕組織HIF-1α與α-SMA免疫熒光染色的典型圖像；ns表示無統(tǒng)計學差異，*p < 0.05，***p < 0.001，****p < 0.0001