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針對(duì)上述問(wèn)題，四川大學(xué)程沖、邱邐、張勃慶團(tuán)隊(duì)合作設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種集聲激活腫瘤消除與智能骨修復(fù)于一體的3D打印仿生復(fù)合支架系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)原位構(gòu)筑負(fù)載銥簇（Ir clusters）的鈦基納米酶材料（ICTO），并將其高效沉積于具有良好骨傳導(dǎo)性能的羥基磷灰石（HA）支架表面，形成HS-ICTO復(fù)合支架。在腫瘤微環(huán)境中，該支架通過(guò)仿過(guò)氧化物酶（POD）、氧化酶（OXD）活性，聯(lián)合超聲激發(fā)，實(shí)現(xiàn)對(duì)H?O?的催化轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生大量ROS，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生線(xiàn)粒體損傷和凋亡；同時(shí)其仿催化酶（CAT）活性可分解H?O?生成氧氣，緩解缺氧狀態(tài)，增強(qiáng)聲敏響應(yīng)效率。進(jìn)入術(shù)后修復(fù)階段后，該材料又可智能轉(zhuǎn)化功能，通過(guò)清除過(guò)量ROS、緩解氧化應(yīng)激、維持紅氧平衡，調(diào)控干細(xì)胞向成骨方向分化，并抑制破骨細(xì)胞活性，重建骨再生與吸收的動(dòng)態(tài)平衡。整體來(lái)看，該研究構(gòu)建了一種可響應(yīng)氧化壓力變化并實(shí)現(xiàn)階段性功能切換的治療系統(tǒng)，不僅在根除腫瘤方面具備精準(zhǔn)可控性，還能有效推動(dòng)組織再生，為骨肉瘤保肢治療提供了智能化、多功能、可轉(zhuǎn)化的新型策略。該文章于2025年7月4日以《Sono-activable and biocatalytic 3D-printed scaffolds for intelligently sequential therapies in osteosarcoma eradication and defect regeneration》為題發(fā)表于《Nature Communications》上（DOI：10.1038/s41467-025-61377-x）。

圖1. 聲激活與仿酶催化3D打印支架用于骨肉瘤保肢治療的設(shè)計(jì)。（a）ICTO納米酶及其修飾的3D打印羥基磷灰石支架（HS-ICTO）的構(gòu)建過(guò)程；（b）在腫瘤微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)可控ROS產(chǎn)生以智能清除腫瘤細(xì)胞；（c）術(shù)后通過(guò)清除過(guò)量?jī)?nèi)源性H?O?并重塑氧化還原穩(wěn)態(tài)以促進(jìn)骨再生

（1）HS-ICTO的合成與表征

采用濕法蒸發(fā)沉積策略將ICTO納米酶材料負(fù)載于3D打印HA支架表面，構(gòu)建HS-ICTO復(fù)合支架（圖2a）。掃描電鏡觀察顯示，ICTO在支架表面均勻沉積，未顯著改變?cè)冀Y(jié)構(gòu)（圖2b–d），且元素映射證實(shí)Ti、Ir等元素分布均一（圖2f）。TEM與HRTEM圖像顯示，ICTO呈花瓣?duì)钇瑢咏Y(jié)構(gòu)，Ir納米簇平均粒徑約為1.7 nm，規(guī)則附著于TiO?表面，具備清晰晶面條紋（圖2e–h）。HAADF-STEM與FFT圖進(jìn)一步確認(rèn)Ir簇在TiO?上的分布與晶體結(jié)構(gòu)（圖2i）。XPS測(cè)試揭示Ir以Ir?和Ir??兩種價(jià)態(tài)共存，且與TiO?形成Ir-O-Ti結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出電子轉(zhuǎn)移特征（圖2j, k）。XANES與EXAFS分析進(jìn)一步證實(shí)Ir簇處于介于Ir?與IrO?之間的平均氧化態(tài)，并存在顯著的Ir–O–Ti配位結(jié)構(gòu)（圖2l–n）。綜合結(jié)果表明，ICTO納米酶在HS支架上穩(wěn)定負(fù)載，并具備良好的結(jié)構(gòu)完整性和氧化還原催化潛力。

圖2. HS-ICTO支架的形貌與結(jié)構(gòu)表征。（a）從毫米級(jí)到原子尺度的多尺度結(jié)構(gòu)示意圖；（b）HS-ICTO的SEM圖像；（c, d）放大SEM圖像；（e）ICTO的TEM圖像；（f）ICTO的元素映射圖；（g, h）ICTO的高分辨TEM圖像；（i）ICTO的HAADF-STEM圖像及其對(duì)應(yīng)的FFT圖；（j, k）Ir 4f與Ti 2p區(qū)域的XPS光電子譜；（l）Ir L?邊的XANES譜；（m）Ir L邊EXAFS的傅里葉變換k3加權(quán)譜圖；（n）k3加權(quán)EXAFS信號(hào)的WT圖像

（2）類(lèi)酶生物催化評(píng)價(jià)及機(jī)理分析

ICTO具備良好的POD-與OXD類(lèi)酶仿活性，TMB顯色實(shí)驗(yàn)顯示其在弱酸環(huán)境下產(chǎn)生ROS的能力優(yōu)于TO，具有TME特異性（圖3a–b）。動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析顯示ICTO的Vmax和TON分別為3.51×10?? M/s和21.60×10?3 s?1，均高于TO，同時(shí)Km值更低（圖3c）。在GSH過(guò)表達(dá)環(huán)境中，ICTO可顯著消耗GSH，降低ROS清除水平（圖3d）。自由基清除與EPR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)ICTO可高效生成?O??和1O?，超聲激發(fā)可進(jìn)一步增強(qiáng)ROS產(chǎn)量（圖3e）。此外，在中性條件下，ICTO表現(xiàn)出優(yōu)異的CAT類(lèi)酶仿活性，20分鐘內(nèi)可清除約90%的H?O?，并顯著提升O?生成，Vmax為48.23 μM/s，TON為4.11 s?1（圖3f–g）。

密度泛函理論（DFT）計(jì)算揭示，在酸性環(huán)境中，H?O?在Ir位點(diǎn)通過(guò)IrOH中間體生成?OOH，其反應(yīng)能壘為0.51 eV，為POD樣反應(yīng)的限速步驟（圖3h–i）。中性條件下CAT樣反應(yīng)的關(guān)鍵步驟為O?和H?O脫附，能壘分別為0.34 eV和0.38 eV，顯示其高效催化特性。PDOS分析表明OH(Ir)在費(fèi)米能級(jí)附近電子態(tài)密度高于OH(Ti)，反應(yīng)活性更強(qiáng)（圖3j）。差分電荷密度與Bader電荷計(jì)算結(jié)果顯示，Ir-O鍵弱于Ti-O鍵，利于OH(Ir)解離與持續(xù)反應(yīng)（圖3k–l）。綜上，ICTO具備酸性條件下高效ROS生成與中性條件下H?O?清除并釋氧的雙重仿酶活性，源于其Ir-O-Ti界面結(jié)構(gòu)所賦予的協(xié)同電子轉(zhuǎn)移特性，適配腫瘤清除與術(shù)后再生的雙重治療需求。

圖3. ICTO的仿酶催化活性與理論計(jì)算。（a）ICTO結(jié)構(gòu)特性與多酶樣催化活性的示意圖；（b）POD樣與OXD樣催化活性（TMB顯色，652 nm）；（c）ICTO與TO的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較；（d）DTNB捕獲法檢測(cè)GSH耗竭能力；（e）EPR檢測(cè)·O??和1O?的生成；（f）中性條件下ICTO與TO的H?O?清除與O?生成能力；（g）Vmax與Km參數(shù)對(duì)比分析；（h）POD樣與CAT樣催化反應(yīng)路徑；（i）對(duì)應(yīng)的吉布斯自由能變化圖；（j）ICTO中OH（Ir）與OH（Ti）的O 2p軌道PDOS分析；（k）差分電荷密度分布圖；（l）OH（Ti）與OH（Ir）的Bader電荷計(jì)算結(jié)果

（3）骨肉瘤根除的體外治療效果

3D打印支架HS-ICTO在TME條件下展現(xiàn)出POD-與CAT樣活性，并通過(guò)超聲協(xié)同增強(qiáng)ROS生成，維持穩(wěn)定催化性能（圖4a–c）。不同濃度HS-ICTO支架對(duì)BMSCs無(wú)毒性，而對(duì)143b細(xì)胞呈劑量依賴(lài)性抑制作用，HS-ICTO-2.0?+?US組細(xì)胞存活率最低，僅為9.7%，因此選用該濃度用于后續(xù)分析。RNA-seq顯示，HS-ICTO及其聯(lián)合US處理均顯著改變143b細(xì)胞的基因表達(dá)譜，富集于細(xì)胞凋亡、ROS損傷及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)通路（圖4d–f）。CLSM圖像顯示，HS-ICTO處理顯著減少活細(xì)胞數(shù)，HS-ICTO?+?US組幾乎無(wú)存活細(xì)胞（圖4g）。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證143b細(xì)胞的早晚期凋亡比例分別在HS-ICTO組和HS-ICTO?+?US組升高至45.08%和87.13%（圖4h）。Western blot檢測(cè)顯示HIF-1α在HS-ICTO及HS-ICTO?+?US組中表達(dá)均顯著下調(diào)，表明支架具備緩解缺氧的能力，增強(qiáng)超聲療效（圖4i）。綜上，HS-ICTO支架在TME下通過(guò)仿酶與超聲協(xié)同機(jī)制增強(qiáng)ROS積累，誘導(dǎo)線(xiàn)粒體功能損傷與細(xì)胞凋亡，展現(xiàn)出顯著的體外抗腫瘤治療潛力。

圖4. HS-ICTO支架在體外骨肉瘤治療中的效果評(píng)估。（a）TME條件下HS-ICTO的治療機(jī)制示意圖；（b）TMB顯色檢測(cè)HS-ICTO-x的POD樣活性；（c）HS-ICTO聯(lián)合超聲觸發(fā)TMB和DPA的催化氧化反應(yīng)；（d）不同細(xì)胞樣本的PCA分析圖；（e）HS-ICTO + US與HS、HS-ICTO與HS的差異基因火山圖；（f）143b細(xì)胞中與ROS相關(guān)的GO富集分析結(jié)果；（g）不同治療下143b細(xì)胞在支架上的活/死染色CLSM圖像；（h）Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞凋亡分析；（i）不同處理組143b細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)水平Western blot檢測(cè)

（4）骨肉瘤異種移植物的體內(nèi)治療效果

在143b骨肉瘤皮下異種移植模型中驗(yàn)證HS-ICTO的體內(nèi)抗腫瘤療效（圖5a）。治療期間，HS-ICTO與HS-ICTO?+?US組均顯著抑制瘤體生長(zhǎng)，其中HS-ICTO?+?US組抑瘤率達(dá)90.43%，顯著優(yōu)于其他組（圖5c–f）。小鼠體重、主要臟器H&E染色及溶血實(shí)驗(yàn)均未顯示明顯毒性（圖5g）。腫瘤組織的H&E染色顯示，HS-ICTO與HS-ICTO?+?US組出現(xiàn)核固縮、胞質(zhì)收縮及組織破壞等典型損傷特征（圖5h）。TUNEL染色結(jié)果顯示HS-ICTO?+?US組DNA斷裂最嚴(yán)重（圖5i），Caspase-3免疫熒光進(jìn)一步確認(rèn)其顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ki67染色結(jié)果顯示HS-ICTO?+?US組腫瘤細(xì)胞增殖水平最低（圖5j）。綜上，HS-ICTO支架在體內(nèi)具有良好的生物安全性和協(xié)同抗腫瘤療效，能通過(guò)緩解TME缺氧、增強(qiáng)ROS生成，有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制增殖。

圖5. HS-ICTO在體內(nèi)骨肉瘤異種移植模型中的治療效果。（a）143b異種移植瘤構(gòu)建及治療流程示意圖；（b）HS-ICTO清除骨肉瘤的機(jī)制示意圖；（c）第15天取瘤后的實(shí)體照片；（d）瘤體積變化曲線(xiàn)；（e）第15天瘤組織稱(chēng)重結(jié)果；（f）瘤體生長(zhǎng)抑制率統(tǒng)計(jì)；（g）小鼠體重變化熱圖；（h）不同組瘤組織的H&E、TUNEL及Ki67熒光染色圖；（i）TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)；（j）Ki67熒光強(qiáng)度定量分析

（5）體外氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和干細(xì)胞保護(hù)

HS-ICTO展現(xiàn)出良好的CAT類(lèi)酶仿活性，可在中性及酸性條件下高效分解H?O?并釋放O?，且其活性隨ICTO負(fù)載量增加而增強(qiáng)（圖6a–c）。在H?O?刺激下，HS-ICTO可有效維持BMSCs的活性與鋪展能力，顯著降低ROS水平（圖6d–e）。TEM觀察顯示，HS?+?H?O?組細(xì)胞出現(xiàn)線(xiàn)粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，而HS-ICTO?+?H?O?組細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整（圖6f）。在成骨誘導(dǎo)條件下，HS-ICTO可顯著逆轉(zhuǎn)H?O?對(duì)ALP活性（第14天）與鈣沉積（第21天）的抑制（圖6g–j），且無(wú)支架共培養(yǎng)組中成骨標(biāo)志物表達(dá)最低，提示HA具一定成骨誘導(dǎo)作用。免疫熒光與RT-qPCR結(jié)果顯示，HS-ICTO可恢復(fù)Runx2、BMP-2、COLI和ALP的表達(dá)水平（圖6k–m），與無(wú)支架組對(duì)比亦明顯上調(diào)。綜上，HS-ICTO可有效調(diào)控H?O?相關(guān)氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護(hù)BMSCs在骨缺損環(huán)境中的活性、遷移及成骨能力（圖6n）。

圖6. HS-ICTO在體外調(diào)控氧化還原穩(wěn)態(tài)并保護(hù)干細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用。（a）骨缺損條件下HS-ICTO調(diào)控H?O?平衡與緩解缺氧的機(jī)制示意圖；（b）HS與不同濃度HS-ICTO對(duì)H?O?的清除效果；（c）在H?O?存在下HS與HS-ICTO產(chǎn)生氧氣的能力；（d）不同處理下BMSCs在支架上培養(yǎng)5天的活/死染色CLSM圖及CCK-8檢測(cè)結(jié)果；（e）BMSCs骨架染色圖及細(xì)胞面積統(tǒng)計(jì)；（f）BMSCs超微結(jié)構(gòu)TEM圖，紅箭頭為損傷線(xiàn)粒體，紅星為膨脹內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；（g）成骨誘導(dǎo)14天后的ALP染色圖；（h）成骨誘導(dǎo)21天后的ARS染色圖；（i, j）ALP與ARS陽(yáng)性染色面積定量分析；（k）BMSCs成骨誘導(dǎo)14天后Runx2、BMP-2與COLI的免疫熒光染色圖；（l）Runx2、BMP-2與COLI的平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)；（m）BMSCs在不同處理下Runx2、BMP-2、COLI與ALP的基因表達(dá)水平；（n）HS-ICTO調(diào)控氧化還原穩(wěn)態(tài)并保護(hù)BMSCs的機(jī)制示意圖

（6）抑制破骨細(xì)胞生成

K7M2與RAW264.7共培養(yǎng)7天后，RAW264.7細(xì)胞中NFATc1、c-Fos、MMP-9和ACP5等破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)，提示骨肉瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)破骨分化（圖7a–b）。HS-ICTO可能通過(guò)清除H?O?和供氧緩解ROS和缺氧信號(hào)，抑制破骨生成（圖7c）。RANKL誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示，HS組未抑制多核巨大細(xì)胞形成，HS-ICTO組破骨細(xì)胞面積顯著縮小（圖7d–e）。TRAP染色進(jìn)一步證實(shí)，HS-ICTO組TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（圖7f–g）。 RT-qPCR結(jié)果顯示，HS-ICTO組中NFATc1、c-Fos、MMP-9和ACP5的表達(dá)分別下降至0.32、0.57、0.43和0.18（圖7h）。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，HS-ICTO能有效抑制RANKL刺激下RAW264.7細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)，而HS與HS?+?RANKL組則無(wú)此效應(yīng)（圖7i）。以上結(jié)果表明，HS-ICTO可通過(guò)調(diào)控ROS與缺氧信號(hào)軸抑制破骨細(xì)胞活性，從而緩解骨肉瘤相關(guān)的骨破壞并促進(jìn)術(shù)后骨修復(fù)。

（7）促進(jìn)骨缺損重建

在大鼠顱骨缺損模型中，HS-ICTO組與HS組在第4、8、12周分別進(jìn)行組織學(xué)與影像學(xué)評(píng)估（圖8a）。RNA-seq顯示HS-ICTO顯著下調(diào)炎癥（如CXCL6、TNF）、破骨（如NFATC1、MMP9）、ROS應(yīng)答（如GPX1、BTG1）及缺氧相關(guān)基因（HIF1A，fold change = 0.58，P = 0.009）（圖8b-d）。H&E與Masson染色結(jié)果顯示，HS-ICTO組在各時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出更多新生骨與膠原沉積（圖8e–f）。Micro-CT結(jié)果顯示，第8周HS-ICTO組BV/TV為31.3%，顯著高于HS組的23.2%（P = 0.0217）；第12周分別為43.6%與28.7%（P = 0.0060），Tb.N亦顯著提升（0.40 mm?1 vs. 0.31 mm?1，P = 0.0084）（圖8g–i），BMD升高、Tb.sp減小。Runx2、BMP-2與COLI免疫熒光染色顯示，HS-ICTO組陽(yáng)性細(xì)胞比例更高（圖8j–l），提示其具備更強(qiáng)成骨誘導(dǎo)能力。TRAP染色顯示HS組周?chē)忻黠@破骨活性，而HS-ICTO組染色區(qū)顯著減少。綜上，HS-ICTO可有效恢復(fù)骨形成與骨吸收的平衡，顯著促進(jìn)缺損區(qū)域的骨組織重建。