IF：15.7《Nature Communications》中國藥科大學(xué)姜雷：含二聚銅肽的水凝膠用于促進(jìn)糖尿病傷口愈合
專欄：學(xué)術(shù)前沿
發(fā)布日期：2025-08-12
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研究背景：
二聚化是生物體內(nèi)普遍存在的調(diào)控機(jī)制，通過非共價(jià)或共價(jià)方式將兩個(gè)分子組裝成高級(jí)結(jié)構(gòu)，可精確調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性、酶效率、蛋白穩(wěn)定性及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并為需要“一藥多靶”的治療策略提供分子模板。然而，糖尿病慢性創(chuàng)面因ROS持續(xù)高負(fù)荷、炎癥過度、血管新生不足及細(xì)胞增殖受限等多重病理因素相互強(qiáng)化，現(xiàn)有療法難以同步協(xié)調(diào)微環(huán)境各組分。內(nèi)源性三肽GHK與Cu2+形成的銅肽（CuP）兼具抗氧化、抗炎、促血管生成和細(xì)胞增殖作用，理論上可覆蓋創(chuàng)面修復(fù)全階段，卻易被蛋白酶水解失活。傳統(tǒng)穩(wěn)定化策略（自組裝、環(huán)化、聚合物偶聯(lián)）常犧牲活性或引入毒性，因此亟需結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低、生物相容好且能維持甚至提升CuP多重功效的新型化學(xué)設(shè)計(jì)方案。
針對(duì)上述問題，中國藥科大學(xué)涂家生教授、姜雷副教授和南京大學(xué)蔣錫群教授團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種“二聚銅肽-ROS響應(yīng)水凝膠”一體化敷料（G/D-CuP）：通過將二聚銅肽（D-CuP）載入可清除ROS并隨ROS濃度智能釋藥的凝膠基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了“一劑多靶”——同步抗炎、抗氧化、促血管新生和促成纖維細(xì)胞遷移，二聚結(jié)構(gòu)利用空間位阻顯著提升肽酶穩(wěn)定性，凝膠柔軟可形變，能貼合任意創(chuàng)面，且制備簡(jiǎn)便、成本低，具備可觀的臨床轉(zhuǎn)化潛力。該文章于2025年7月1日以《Dimeric copper peptide incorporated hydrogel for promoting diabetic wound healing》為題發(fā)表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-025-61141-1）。
整合二聚銅肽的水凝膠（G/D-CuP）促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合效率。a. G/D-CuP的制備示意圖；b. G/D-CuP在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中的作用
（1）D-CuP的制備與表征
通過賴氨酸橋聯(lián)兩分子GHK三肽合成了二聚肽D-P（圖1a），其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR及HRMS確認(rèn)。D-P與Cu2+以1:0.5摩爾比絡(luò)合得到藍(lán)紫色D-CuP，UV-Vis在584 nm處出現(xiàn)明顯吸收峰（圖1b），與單體銅肽M-CuP的峰位一致，但在相同配位基團(tuán)摩爾濃度下吸光度顯著高于M-CuP，表明D-P具有更高的配位效率與穩(wěn)定性（圖1c、d）。EPR在約3426 mT處檢測(cè)到Cu2+特征信號(hào)，進(jìn)一步證實(shí)D-CuP生成（圖1e）。在模擬皮膚生理（pH 4-6）及慢性創(chuàng)面堿性（pH 7-9）環(huán)境中，584 nm吸收峰保持穩(wěn)定，說明D-CuP在pH 4-9范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)完整。以廣譜蛋白酶K進(jìn)行的體外降解實(shí)驗(yàn)顯示，0.5 h后M-CuP剩余58%，4 h后降至50%；而D-CuP在相同時(shí)間點(diǎn)分別剩余92%和87%，證明二聚結(jié)構(gòu)顯著提高了抗酶解穩(wěn)定性（圖1f）。
圖1. D-CuP的制備與表征。a. D-CuP結(jié)構(gòu)式；b. D-CuP溶液顏色；c、d. D-CuP的紫外-可見吸收光譜；e. D-CuP的電子順磁共振譜；f. M-CuP與D-CuP經(jīng)蛋白酶K處理的穩(wěn)定性曲線
（2）G/D-CuP的制備與表征
圖2a所示，EBPBA與PVA經(jīng)苯硼酸酯鍵交聯(lián)，并在室溫下與D-CuP共混5 s即得G/D-CuP水凝膠。SEM顯示水凝膠內(nèi)部為三維互通多孔網(wǎng)絡(luò)，孔徑約50-100 μm（圖2b）。動(dòng)態(tài)流變測(cè)試表明，在0.1%–1200%振蕩應(yīng)變及0.1–500 rad·s-1角頻率范圍內(nèi)，儲(chǔ)能模量G’始終保持在2500 Pa左右并高于損耗模量G’’，證實(shí)其彈性固體特性（圖2c、d）。連續(xù)階躍應(yīng)變實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)應(yīng)變由0.1%驟升至1200%時(shí)G’由2500 Pa降至390 Pa，應(yīng)變恢復(fù)后G’瞬時(shí)回升至2500 Pa（圖2e）；宏觀切片實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，水凝膠在被切斷后5 s內(nèi)斷面完全愈合，可承受180°彎折而不產(chǎn)生裂紋（圖2f）。在星形及不規(guī)則創(chuàng)面上，G/D-CuP可在10 s內(nèi)完全鋪展并填充所有縫隙，粘附強(qiáng)度達(dá)12 kPa，有效封閉創(chuàng)面（圖2g）。體外ROS響應(yīng)釋放實(shí)驗(yàn)表明，在1 mM H2O2刺激下，D-CuP在72 h內(nèi)累積釋放90%（圖2h）。
圖2. G/D-CuP的制備與表征。a. G/D-CuP的制備流程；b. G/D-CuP的典型SEM圖像；c. G/D-CuP的流變學(xué)—應(yīng)變掃描；d. G/D-CuP的流變學(xué)—頻率掃描；e. G/D-CuP的連續(xù)階躍應(yīng)變測(cè)試；f. G/D-CuP的自修復(fù)性能；g. G/D-CuP的形變與貼合能力；h. G/D-CuP在PBS與H2O2條件下的累積釋放曲線
（3）G/D-CuP的體外抗炎效應(yīng)與抗氧化能力
在LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的RAW 264.7炎癥模型中，G/D-CuP處理使CD86+ M1巨噬細(xì)胞比例由78.9%降至36.4%，同時(shí)CD206? M2群體由3.1%升至12.2%，極化效果顯著優(yōu)于M-CuP（圖 3a–d）。炎癥因子水平同步下降：TNF-α由320 pg·mL-1降至95 pg·mL-1，IL-6由410 pg·mL-1降至120 pg·mL-1（圖 3e、f）。ROS清除方面，F(xiàn)enton體系中G/D-CuP對(duì)羥自由基的清除率超過95%；胞內(nèi)DCFH-DA熒光檢測(cè)顯示，H2O2刺激下G/D-CuP組ROS熒光強(qiáng)度較陰性對(duì)照下降71%，且SOD活性較G/M-CuP組提高1.8倍（圖 3g、h）。血液相容性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，G/D-CuP的溶血率低于5%，符合生物材料安全要求（圖 3i）。
圖3. G/D-CuP的體外抗炎效應(yīng)與抗氧化能力。a. 不同處理后巨噬細(xì)胞表型的代表性熒光圖；b. 不同處理后RAW 264.7細(xì)胞CD206與CD86表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析；c. M1（CD86+、CD206-）表型巨噬細(xì)胞統(tǒng)計(jì)；d. M2（CD206+、CD86-）表型巨噬細(xì)胞統(tǒng)計(jì)；e. TNF-α與f. IL-6 濃度由ELISA測(cè)定；g. G/D-CuP處理后NIH-3T3細(xì)胞的ROS熒光圖像；h. G/D-CuP處理后NIH-3T3細(xì)胞的SOD活性檢測(cè)；i. G/D-CuP的溶血率
（4）G/D-CuP體外促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及血管生成作用
在圖4a、b所示的Ki67免疫熒光及定量分析中，G/D-CuP使HUVEC增殖率升至69%，顯著高于所有對(duì)照；圖4c的MTT結(jié)果顯示，D-CuP在低濃度下對(duì)NIH/3T3的促增殖活性優(yōu)于M-CuP，且G、D-CuP、G/D-CuP三組的細(xì)胞存活率均保持在90%以上，未見細(xì)胞毒性。進(jìn)一步地，圖4d、e的管腔形成實(shí)驗(yàn)顯示，G/D-CuP組的管腔總長度及網(wǎng)格數(shù)均顯著高于其余處理組；圖4f的VEGF ELISA結(jié)果同樣提示其促血管生成能力顯著增強(qiáng)。遷移能力方面，圖4g、h的Transwell實(shí)驗(yàn)表明G/D-CuP顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移；圖4i、j的劃痕實(shí)驗(yàn)亦顯示D-CuP在30 h內(nèi)使L929細(xì)胞劃痕閉合率高于M-CuP，提示二聚銅肽因穩(wěn)定性及活性提升而加速創(chuàng)面修復(fù)。
圖4. G/D-CuP的體外促細(xì)胞增殖、遷移與血管生成作用。a. HUVEC細(xì)胞經(jīng)不同處理后Ki67免疫熒光代表性圖像；b. Ki67+細(xì)胞定量分析；c. NIH/3T3細(xì)胞與D-CuP或M-CuP共培養(yǎng)24 h后的相對(duì)細(xì)胞活力；d. 經(jīng)calcein-AM染色（綠色）的HUVEC細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)代表性圖像；e. 總管長定量分析；f. ELISA測(cè)定VEGF濃度；g. L929細(xì)胞Transwell遷移實(shí)驗(yàn)代表性圖像；h. 遷移細(xì)胞數(shù)定量分析；i. L929 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)圖像；j. 劃痕愈合率隨時(shí)間變化
（5）D-CuP治療作用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
圖5a所示流程下，對(duì)L929纖維肉瘤細(xì)胞行定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)；圖5b的PCA圖顯示D-CuP組與PBS組蛋白表達(dá)譜明顯分離。差異蛋白火山圖（圖5c）共篩得74個(gè)DEP（29個(gè)上調(diào)、45個(gè)下調(diào)，p<0.05，|FC|>1.2）。按愈合三階段分類，炎癥與氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Cop1、H2-D1、Ndufa6、Fam76a顯著下調(diào)，增殖、遷移及血管生成相關(guān)蛋白Slc38a2、Psph、Jagn1、Rorb顯著上調(diào)（圖5d）。GO富集（圖5e）揭示分子功能調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、細(xì)胞膜組分、細(xì)胞過程與生物調(diào)控為主要條目；KEGG通路（圖5f）則聚焦核苷酸切除修復(fù)、p53、mTOR、IL-17、NOD樣受體及HIF-1信號(hào)軸。分子對(duì)接（圖5g）給出D-CuP對(duì)p53 DNA結(jié)合域和HDAC7催化域的結(jié)合能分別為-5.7 kcal·mol-1與-6.4 kcal·mol-1，顯著優(yōu)于M-CuP的-4.2 kcal·mol-1與-4.8 kcal·mol-1。SPR動(dòng)力學(xué)（圖5h）進(jìn)一步測(cè)定D-CuP與p53、HDAC7的平衡解離常數(shù)KD分別為3.8×10-6 M和1.81×10-6 M，而M-CuP在各濃度下響應(yīng)均<5 RU，證實(shí)二聚結(jié)構(gòu)通過多價(jià)協(xié)同增強(qiáng)靶點(diǎn)結(jié)合。
圖5. D-CuP干預(yù)前后L929細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)評(píng)估。a. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程示意圖；b. 基于兩組L929細(xì)胞差異表達(dá)蛋白的PCA主成分分析；c. D-CuP處理后上調(diào)與下調(diào)基因的火山圖；d. 差異蛋白熱圖；e. D-CuP組與對(duì)照組差異蛋白的GO功能分析；f. D-CuP組與對(duì)照組差異蛋白的KEGG通路富集；g. p53與M-CuP、p53與D-CuP、HDAC7與M-CuP、HDAC7與D-CuP分子對(duì)接示意圖；h. SPR測(cè)定M-CuP與D-CuP對(duì)p53或HDAC7的結(jié)合親和力
（6）G/D-CuP促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的效果
圖6a所示體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將糖尿病小鼠創(chuàng)面隨機(jī)分為PBS（NC）、G、M-CuP、D-CuP、G/M-CuP及G/D-CuP六組，并以健康鼠PBS處理作為空白對(duì)照（BC）。圖6b、c的宏觀照片記錄顯示，第3天起各治療組創(chuàng)面面積已明顯小于NC；第7天G/D-CuP組剩余面積僅17.3%，優(yōu)于其余各組（圖6d）。到第12天，NC與M-CuP組仍分別殘留34.2%與17.8%創(chuàng)面，D-CuP組降至9.8%，而G/D-CuP組僅余2.8%。組織學(xué)層面，圖6e的H&E染色表明，第7天G/D-CuP組已形成致密肉芽組織，第12天完成表皮覆蓋并可見大量新生毛囊與皮脂腺；圖6f定量顯示其肉芽厚度顯著高于其他組，提示G/D-CuP在加速糖尿病創(chuàng)面閉合、促進(jìn)皮膚附件再生及提升愈合質(zhì)量方面具有最顯著優(yōu)勢(shì)。
圖6. G/D-CuP促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的效果。a. 各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸示意圖；b. 不同處理組創(chuàng)面代表性照片；c. 第0、3、7、12天各組創(chuàng)面愈合情況對(duì)比；d. 12天內(nèi)創(chuàng)面愈合率；e. 第12天各處理組創(chuàng)面組織H&E染色；f. 第12天各組肉芽組織厚度
圖7a、b的第3天ELISA結(jié)果顯示，G/D-CuP組創(chuàng)面IL-6水平最低、IL-10最高，提示炎癥期提前結(jié)束；圖7c的第7天組織染色進(jìn)一步驗(yàn)證TNF-α與IL-6下調(diào)、IL-10上調(diào)。進(jìn)入增殖期，圖7d的第3天VEGF ELISA及圖7c、e的第7天免疫組化表明，G/D-CuP組VEGF與CD31表達(dá)均最高，CD31平均光密度比G/M-CuP組提高1.48倍；第12天該組新生血管數(shù)量已顯著減少，顯示血管生成被適時(shí)終止，重塑期提前啟動(dòng)。圖7c、f的Ki67染色顯示，G/D-CuP組第7天細(xì)胞增殖信號(hào)最強(qiáng)，第14天迅速回落；Masson三色（圖7g）表明其膠原密度、厚度及排列方向均優(yōu)于G/M-CuP組，接近健康皮膚結(jié)構(gòu)。
圖7. G/D-CuP加速糖尿病創(chuàng)面三期修復(fù)。ELISA測(cè)定第3天創(chuàng)面 a. IL-6、b. IL-10、d. VEGF濃度；c. 第7天TNF-α、VEGF、CD31、Ki67免疫組化代表性圖像及第12天Masson染色代表性圖像；e. 第7天CD31、f. Ki67免疫組化定量分析；g 第12天各組膠原沉積定量
總之，該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種集“時(shí)空ROS清除—巨噬極化調(diào)控—促血管與成纖維細(xì)胞再生”于一體的多功能敷料G/D-CuP。該敷料以PVA-EBPBA可自愈、可塑形的苯硼酸酯動(dòng)態(tài)水凝膠為基質(zhì)，負(fù)載二聚銅肽D-CuP；二聚結(jié)構(gòu)賦予其更高的蛋白酶穩(wěn)定性、多價(jià)協(xié)同活性及緩釋性能。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)G/D-CuP能有效清除ROS、誘導(dǎo)M1→M2巨噬極化并上調(diào)SOD，顯著促進(jìn)HUVEC管腔形成與NIH/3T3、L929增殖遷移；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，其可在12天內(nèi)將糖尿病小鼠創(chuàng)面面積由100%縮小至2.8%，并同步加速炎癥、增殖與重塑三期進(jìn)程，最終形成結(jié)構(gòu)完整、膠原致密、皮膚附件豐富的新生組織。該體系合成簡(jiǎn)便、成本低廉、生物相容性優(yōu)異，為糖尿病創(chuàng)面管理提供了可臨床轉(zhuǎn)化的“一站式”解決方案，也為線性活性肽的二聚化設(shè)計(jì)提供了普適策略。
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