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針對(duì)上述問(wèn)題，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院盧光明教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種多功能納米平臺(tái)SPIT探針，用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的SERS引導(dǎo)切除、光熱治療和免疫治療。SPIT探針由AuNS核、拉曼報(bào)告層和源自巨噬細(xì)胞膜的基因過(guò)表達(dá)SIRPα變體組成，具有強(qiáng)大獨(dú)特的拉曼信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)術(shù)中腫瘤切除。手術(shù)后，其光熱效應(yīng)可消融殘留微小腫瘤灶，且巨噬細(xì)胞膜上SIRPα變體過(guò)表達(dá)能阻斷CD47-SIRPα通路，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞吞噬作用，結(jié)合光熱治療可放大抗腫瘤免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該聯(lián)合療法在原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中實(shí)現(xiàn)了優(yōu)越的抗腫瘤效果，顯著抑制腫瘤復(fù)發(fā)，將小鼠中位生存期延長(zhǎng)兩倍以上，為改善GBM治療結(jié)果和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)帶來(lái)希望。該文章于2025年5月19日以《SERS-Guided Precision Resection Combined with Photothermal-Immunotherapy for Glioblastoma Recurrence Prevention》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202425168）。

研究示意圖

（1）SPIT探針的形態(tài)、拉曼和光熱特性

慢病毒載體將編碼突變型SIRPα變體（vSIRPα）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入RAW 264.7細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞表面SIRPα蛋白表達(dá)。共聚焦成像顯示，RAW 264.7-vSIRPα對(duì)CD47的親和力高于野生型RAW 264.7細(xì)胞（圖1A）。流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了RAW 264.7-vSIRPα細(xì)胞表面vSIRPα的功能（圖1B）。

40 - 42 AuNSs因尖銳尖端具有優(yōu)異SERS性能被選為SERS基底，MBN分子中的腈基（─C═N）提供獨(dú)特拉曼峰，減少樣品基質(zhì)干擾。44 MBN通過(guò)Au - S鍵組裝，AuNS/MBN在2228 cm?1處表現(xiàn)出最大峰強(qiáng)度。通過(guò)共擠壓工藝將AuNS/MBN包覆上RAW 264.7 - vSIRPα細(xì)胞膜，制備SPIT探針。透射電子顯微鏡（TEM）顯示，AuNS/MBN被厚度約4 - 5 nm的巨噬細(xì)胞膜成功包覆（圖1C）。AuNSs包覆上RAW 264.7 - vSIRPα細(xì)胞膜（SMM）后，zeta電位從 - 27.9 mV變?yōu)?- 28.4 mV，平均直徑從73.6 nm增加到91.1 nm（圖1D）。紫外 - 可見(jiàn)光譜顯示，SMM包覆后，代表縱向局域表面等離子體共振的峰值發(fā)生輕微紅移（4.9 nm）（圖1E）。AuNSs、MBN和SPIT探針的拉曼光譜如圖1H，AuNSs無(wú)信號(hào)，MBN粉末信號(hào)微弱，SPIT探針在相同MBN濃度下信號(hào)更強(qiáng)，顯示其作為拉曼成像SERS報(bào)告分子的潛力。SPIT探針的拉曼信號(hào)在細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育72小時(shí)內(nèi)基本保持一致（圖1I），驗(yàn)證了拉曼信號(hào)在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性。

圖1 SPIT探針的制備與表征。（A，B）免疫熒光分析和流式細(xì)胞術(shù)分析SIRPα在野生型RAW 264.7細(xì)胞和RAW 264.7-vSIRPα細(xì)胞中的CD47結(jié)合能力，標(biāo)尺=25 μm；（C）SPIT探針的透射電子顯微鏡（TEM）圖像；（D）動(dòng)態(tài)光散射分析測(cè)量的不同NPs的尺寸分布和zeta電位；（E）水溶液中AuNSs和SPIT探針的紫外-可見(jiàn)吸收光譜；（F）激光照射不同濃度SPIT探針后的溫度升高（PBS，50，100，150和200 μg mL?1）；（G）激光照射不同濃度SPIT探針后的熱圖像；（H）MBN、AuNSs和SPIT探針的拉曼光譜；（I）SPIT探針在血清中孵育72小時(shí)后拉曼信號(hào)的穩(wěn)定性及2217 cm?1峰強(qiáng)度變化（n=3，785 nm激光，150 mW，5×物鏡，0.5 s積分時(shí)間）

（2）SPIT探針的BBB跨越機(jī)制和靶向能力

已有研究表明巨噬細(xì)胞膜上整合素α4與Mac - 1及內(nèi)皮細(xì)胞上ICAM - 1或VCAM - 1相互作用，會(huì)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致緊密連接（TJ）破壞和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，增加BBB通透性，還可激活CAM介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。Western blot分析檢測(cè)SPIT探針上相關(guān)分子存在情況（圖2A），證實(shí)整合素α4和Mac - 1在巨噬細(xì)胞膜上表達(dá)且在SPIT探針上保存完好。使用Transwell系統(tǒng)中體外BBB模型研究SPIT探針跨越BBB能力（圖2B），bEnd.3細(xì)胞在上室培養(yǎng)形成完整單層，TEER值超過(guò)200Ω·cm2才有效，模型中緊密單層TEER值達(dá)300Ω·cm2（圖2C）。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)bEnd.3細(xì)胞中ZO - 1表達(dá)評(píng)估SPIT探針引入后TJ破壞情況（圖2D），ZO - 1是與TJ相關(guān)蛋白，SPIT組中ZO - 1表達(dá)分散且較PBS、AuNS和AuNS/MBN@MM組分別降低2.3、2.1和1.7倍（圖2E），表明SPIT探針降低TJ緊密度，促進(jìn)其穿過(guò)血腦屏障。通過(guò)測(cè)量治療后12小時(shí)下層腔室Au濃度量化SPIT探針穿透效率（圖2F），SPIT探針血腦屏障通透性最高，與PBS、AuNS和AuNS/MBN@MM組相比，穿透效率分別高約211.4、2.6和1.7倍。基于下層腔室中GL261細(xì)胞攝取評(píng)估SPIT探針腫瘤靶向能力，共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）（圖2G）和流式細(xì)胞術(shù)分析（圖2H）均顯示，ICG標(biāo)記的SPIT探針腫瘤細(xì)胞靶向效率顯著高于游離ICG、ICG標(biāo)記的AuNS和ICG標(biāo)記的AuNS/MBN@MM，這種增強(qiáng)靶向效率可能由vSIRPα過(guò)表達(dá)介導(dǎo)，與GL261細(xì)胞上CD47相互作用。此外，評(píng)估SPIT探針在活細(xì)胞中SERS成像能力，用SPIT探針?lè)跤?小時(shí)后，細(xì)胞可通過(guò)SERS成像清晰可視化（圖2I），表明其可用于活細(xì)胞輪廓可視化。

圖2 SPIT探針的跨血腦屏障（BBB）和靶向能力。（A）Western blot分析顯示RAW 264.7細(xì)胞、RAW 264.7-vSIRPα細(xì)胞、SMM、AuNS/MBN@MM和SPIT探針中整合素（Integrinα4和Mac-1）的表達(dá)；（B）體外血腦屏障模型的示意圖；（C）上室中培養(yǎng)的bEnd.3細(xì)胞的CLSM圖像，標(biāo)尺：100μm；（D）經(jīng)PBS、AuNSs、AuNS/MBN@MM和SPIT探針處理后的bEnd.3細(xì)胞的代表性免疫熒光圖像和（E）ZO-1熒光強(qiáng)度的定量，ZO-1呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，標(biāo)尺=25μm；（F）與PBS、AuNSs、AuNS/MBN@MM和SPIT探針?lè)跤?2小時(shí)后，下室中Au的含量；（G）經(jīng)BBB滲透后，GL261細(xì)胞中游離ICG、ICG標(biāo)記的AuNS、ICG標(biāo)記的AuNS/MBN@MM和ICG標(biāo)記的SPIT探針?lè)e累的代表性CLSM圖像和（H）流式細(xì)胞術(shù)分析；（I）與SPIT探針?lè)跤?2小時(shí)后，GL261細(xì)胞的明場(chǎng)和SERS圖像

（3）體外抗腫瘤治療效果

CCK - 8法評(píng)估SPIT探針在GL261和bEnd.3細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明其在兩種細(xì)胞系中均表現(xiàn)出劑量依賴性的低細(xì)胞毒性（圖3A），具有良好的生物相容性。Calcein - AM/PI染色評(píng)估經(jīng)SPIT探針和激光照射（SPIT + laser）處理的GL261細(xì)胞活力，CLSM成像顯示SPIT + laser組呈現(xiàn)強(qiáng)烈紅色熒光信號(hào)，細(xì)胞大量死亡，而PBS、僅激光和僅SPIT組主要呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞活力較高（圖3B）。流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡結(jié)果相似（圖3C）。Western blot結(jié)果顯示，SPIT + laser組凋亡相關(guān)蛋白Bcl - 2下調(diào)，Bax和cleaved Caspase - 3上調(diào)（圖3D），與凋亡流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果一致，證明SPIT + laser組能顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且在激光照射下，GL261細(xì)胞的殺傷作用呈劑量依賴性，SPIT探針劑量增加，細(xì)胞活力顯著下降（圖3A）。光熱療法（PTT）可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡（ICD），釋放TAAs和DAMPs。免疫熒光分析和ELISA評(píng)估SPIT探針介導(dǎo)的PTT處理后GL261細(xì)胞中CRT暴露及HMGB1和ATP分泌情況，結(jié)果顯示SPIT + 激光處理顯著上調(diào)CRT表達(dá)并增強(qiáng)HMGB1和ATP釋放（圖3E），表明SPIT探針介導(dǎo)的PTT能有效誘導(dǎo)ICD。共培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞和GL261細(xì)胞，評(píng)估高親和力vSIRPα增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能的能力，CLSM和流式細(xì)胞術(shù)均顯示高親和力vSIRPα蛋白導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著增加（圖3F）。

圖3 體外治療效力和免疫效力評(píng)估。（A）不同濃度下使用SPIT探針處理GL261細(xì)胞的相對(duì)活力，有或無(wú)激光照射，通過(guò)CCK - 8測(cè)定法確定，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=5）；（B）用PBS、激光、SPIT和SPIT + 激光處理的GL261細(xì)胞的活/死染色圖像，死細(xì)胞用PI染成紅色，活細(xì)胞用Calcein - AM染成綠色，標(biāo)尺=100μm；（C）流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理24小時(shí)后的GL261細(xì)胞凋亡情況，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3），****p<0.0001；（D）不同處理后GL261細(xì)胞中Bax、cleaved Caspase - 3和Bcl - 2表達(dá)的Western blot分析；（E）不同處理后GL261細(xì)胞中CRT表達(dá)的熒光圖像，標(biāo)尺=25μm；（F）流式細(xì)胞術(shù)分析（左）和相對(duì)定量（右）不同處理后RAW 264.7巨噬細(xì)胞對(duì)GL261細(xì)胞的吞噬情況

（4）靶向效率、SERS 特性及光熱療法在原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤異種移植模型中的表現(xiàn)

為評(píng)估SPIT探針在體內(nèi)的腫瘤靶向效率，建立了GL261原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型。靜脈注射游離ICG、ICG標(biāo)記的金納米顆粒（AuNSs）和ICG標(biāo)記的SPIT探針后，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行體內(nèi)熒光成像。結(jié)果顯示，游離ICG組在腫瘤部位未檢測(cè)到可識(shí)別的熒光信號(hào)，AuNSs組顯示微弱熒光信號(hào)，而SPIT組在腫瘤區(qū)域表現(xiàn)出強(qiáng)烈熒光強(qiáng)度，注射后12小時(shí)達(dá)到峰值（圖4A）。為分析SPIT探針的生物分布，在小鼠注射后12小時(shí)處死，取出大腦和其他主要器官進(jìn)行離體熒光成像，SPIT組在原位腦腫瘤中顯示出最強(qiáng)熒光信號(hào)（圖4B，C），且SPIT探針也在肝臟和脾臟中積聚。這些結(jié)果表明SPIT探針具有高腫瘤蓄積性。隨后，在注射后24小時(shí)收獲主要器官和腫瘤，通過(guò)電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP - AES）對(duì)其Au含量進(jìn)行定量。

為驗(yàn)證SPIT探針的腫瘤特異性，在注射后24小時(shí)采集腦組織，使用蘇木精和伊紅（H&E）染色及熒光顯微鏡進(jìn)行分析，結(jié)果表明SPIT探針主要定位于GBM腫瘤區(qū)域（圖4D），證明其具有穿過(guò)血腦屏障的能力和腫瘤選擇性積累，其在GBM部位的穩(wěn)定SERS信號(hào)和高積累效率，凸顯了在手術(shù)導(dǎo)航方面的巨大潛力。為驗(yàn)證基于SPIT探針的圖像引導(dǎo)腫瘤切除術(shù)的可行性，使用正立共聚焦拉曼顯微鏡光譜儀收集SERS信號(hào)。通過(guò)拉曼成像觀察整個(gè)完整腫瘤，并在手術(shù)切除過(guò)程中采用SERS對(duì)腫瘤組織去除進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)（圖4E，F(xiàn)），發(fā)現(xiàn)手術(shù)后強(qiáng)SERS信號(hào)的像素?cái)?shù)量逐漸減少。在原發(fā)腫瘤最大切除后，使用SERS掃描手術(shù)區(qū)域以檢查殘留的微腫瘤，拉曼成像成功揭示了顯微鏡下無(wú)法檢測(cè)到的額外殘留微腫瘤信號(hào)，對(duì)這些殘留微腫瘤病灶的手術(shù)切除持續(xù)進(jìn)行，直到檢測(cè)不到拉曼信號(hào)，以確保最大程度腫瘤切除。這些結(jié)果表明，使用SERS進(jìn)行圖像引導(dǎo)的手術(shù)切除術(shù)有助于界定腫瘤邊緣，促進(jìn)原發(fā)腫瘤切除，并識(shí)別術(shù)后殘留的微腫瘤。為進(jìn)一步研究腫瘤邊緣，對(duì)切除的組織進(jìn)行拉曼光譜映射和蘇木精 - 伊紅染色，SERS成像精確地勾勒出了腫瘤與正常組織之間的邊界（圖4G），且透射電子顯微鏡（TEM）證實(shí)腫瘤組織中存在大量SPIT探針，而在鄰近的正常組織中未觀察到探針（圖4H），表明拉曼成像策略可有效應(yīng)用于圖像引導(dǎo)的腫瘤切除術(shù)。

最終評(píng)估了SPIT探針在體內(nèi)的光熱性能。在治療后12小時(shí)，對(duì)GL261原位腫瘤小鼠用808 nm激光（0.5 W cm?2）照射5分鐘，結(jié)果顯示SPIT探針對(duì)腫瘤床產(chǎn)生了良好的光熱效應(yīng)，照射5分鐘后使其溫度從28.9℃升高到45.0℃（圖4I，J），而對(duì)照組在相同條件下僅表現(xiàn)出輕微的溫度升高。

圖4 體內(nèi)SPIT探針的腫瘤蓄積、SERS引導(dǎo)手術(shù)和光熱治療。（A）注射游離ICG、ICG標(biāo)記的AuNS和ICG標(biāo)記的SPIT探針后，不同時(shí)間點(diǎn)GL261膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠原位腫瘤的實(shí)時(shí)生物發(fā)光圖像；（B）治療后腫瘤小鼠主要器官（心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和大腦）的熒光圖像；（C）不同主要器官體外熒光成像的半定量結(jié)果；（D）包含腫瘤的全腦切片的蘇木精 - 伊紅染色及相應(yīng)腫瘤切片的熒光圖像，SPIT探針標(biāo)記ICG（紅色），標(biāo)尺=1毫米；（E）GBM手術(shù)中SERS引導(dǎo)的順序切除示意圖；（F）根據(jù)拉曼信號(hào)位置識(shí)別腫瘤，依次切除腫瘤，所有腫瘤在肉眼判斷完全切除后，組織中仍檢測(cè)到幾個(gè)小的拉曼信號(hào)焦點(diǎn)（橙色虛線方框所示），繼續(xù)切除直至未檢測(cè)到進(jìn)一步拉曼信號(hào)，相應(yīng)的代表性拉曼光譜（星號(hào)符號(hào)）展示了SERS引導(dǎo)的GBM切除的連續(xù)階段；（G）一例GBM邊緣的H&E染色和拉曼光譜圖像，虛線表示腫瘤邊緣，比例尺=50μm；（H）GL261原位腫瘤小鼠GBM組織和對(duì)側(cè)正常腦組織的代表性TEM圖像，顯示腫瘤組織中存在SPIT探針（紅色箭頭），比例尺=50μm；（I）808 nm激光照射后殘留腫瘤腔內(nèi)的紅外熱圖像，顯示溫度變化；（J）照射區(qū)域的相應(yīng)溫度曲線

（5）原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型的治療效果和生物相容性

確定SPIT探針在腫瘤組織中的保留時(shí)間和光熱效應(yīng)后，提出了一種結(jié)合SERS圖像引導(dǎo)手術(shù)、PTT和免疫治療的多模式腫瘤治療方案（圖5A）。利用表達(dá)熒光素酶的GL261腫瘤細(xì)胞建立生物發(fā)光原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型，腫瘤植入后一周，將小鼠隨機(jī)分為六組（每組8只）：G1（對(duì)照組）未治療；G2（手術(shù)組）無(wú)圖像引導(dǎo)的腫瘤切除術(shù)；G3（SERS引導(dǎo)手術(shù)組）SERS引導(dǎo)手術(shù)；G4（SERS引導(dǎo)手術(shù)+PTT組）SERS引導(dǎo)手術(shù)+PTT；G5（SERS引導(dǎo)手術(shù)+免疫治療組）SERS引導(dǎo)手術(shù)+免疫治療；G6（SERS引導(dǎo)手術(shù)+PTT+免疫治療組）SERS引導(dǎo)手術(shù)+PTT+免疫治療。G3和G4組中封裝AuNS/MBN的巨噬細(xì)胞膜來(lái)自野生型RAW 264.7細(xì)胞。G3組手術(shù)前12小時(shí)接受SPIT探針處理，隨后進(jìn)行SERS引導(dǎo)的腫瘤切除術(shù)；G4組接受相同處理，但在手術(shù)期間額外進(jìn)行808 nm激光照射用于PTT。生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)，結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤漸進(jìn)性生長(zhǎng)，手術(shù)組最初腫瘤縮小后快速?gòu)?fù)發(fā)，兩組腫瘤復(fù)發(fā)率均為100%（圖5B、C）。與手術(shù)組相比，S-surg組因SERS檢測(cè)到微觀殘留腫瘤而延遲腫瘤復(fù)發(fā)，S-surg+PTT組和S-surg+IT組進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤抑制效果，分別有50%和37.5%的小鼠觀察到腫瘤復(fù)發(fā)，而S-surg+PTT+IT組僅12.5%的小鼠出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)（圖5D），其總生存期（OS）中位數(shù)超過(guò)70天，顯著長(zhǎng)于其他組（圖5E）。組織學(xué)分析顯示，H&E染色、Ki67免疫熒光和TUNEL檢測(cè)表明S-surg+PTT+IT治療最有效地抑制GBM增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖5F - H）。PBS組和協(xié)同治療組在白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細(xì)胞比容（HCT）、血小板（PLT）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）或肌酐（Cr）水平方面未觀察到顯著差異，表明無(wú)血液學(xué)、肝毒性或腎毒性。

圖5 體內(nèi)治療效果。（A）示意圖說(shuō)明評(píng)估不同方案抗復(fù)發(fā)療效的治療方案時(shí)間線，GL261 - Luc細(xì)胞原位接種到C57小鼠腦內(nèi)，第9天生物發(fā)光強(qiáng)度相似的小鼠隨機(jī)分配到六個(gè)治療組，靜脈注射納米顆粒（NPs），注射后12小時(shí)進(jìn)行膠質(zhì)母細(xì)胞瘤切除，手術(shù)結(jié)束后立即對(duì)腫瘤腔進(jìn)行808 nm激光照射（5分鐘），第12天到第21天每3天進(jìn)行一次額外的納米顆粒注射和光熱治療；（B）不同治療方案下GL261原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠腫瘤進(jìn)展的代表性生物發(fā)光圖像，灰色框表示死亡小鼠；（C）原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤的定量生物發(fā)光水平，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3），**p<0.01；（D）腫瘤復(fù)發(fā)率和（E）Kaplan - Meier生存曲線顯示不同組小鼠的生存情況，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=8），**p<0.01；（F）H&E（標(biāo)尺=2 mm），（G）Ki67（標(biāo)尺=100μm），和（H）TUNEL（標(biāo)尺=100μm）染色為不同治療后腫瘤小鼠腦組織切片

（6）體內(nèi)免疫反應(yīng)研究

治療三周后收集殘余復(fù)發(fā)腫瘤組織進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，S-surg+PTT+IT組腫瘤部位的DC細(xì)胞（CD11c、CD80+和CD86+）數(shù)量高于其他組（圖6A），原因是PTT消融后腫瘤細(xì)胞釋放的TAA能募集更多DC細(xì)胞，且CD47阻斷增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用并激活先天免疫系統(tǒng)，成熟DC細(xì)胞作為APC促進(jìn)了后續(xù)免疫反應(yīng)。該組腫瘤部位的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加（圖6B，C），Treg（CD25+、Foxp3+T細(xì)胞）百分比下降（圖6D），免疫熒光染色也證實(shí)了聯(lián)合治療后CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn)增加（圖6E）。此外，ELISA檢測(cè)顯示S-surg+PTT+IT組腫瘤組織中IL - 6、TNF - α、IFN - γ和IL - 12分泌顯著增加，而IL - 10分泌減少（圖6F - J），表明該策略在增強(qiáng)腫瘤內(nèi)抗腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和減少免疫抑制性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)方面表現(xiàn)出色，實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)大的抗腫瘤免疫效應(yīng)，且全身抗腫瘤免疫被激活。

圖6 體內(nèi)免疫應(yīng)答激活。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示不同治療組腫瘤中（A）CD80+CD86+樹(shù)突狀細(xì)胞的百分比，（B）CD3+CD8+T細(xì)胞的百分比，（C）CD3+CD4+T細(xì)胞的百分比，以及（D）CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的百分比；（E）腫瘤組織中CD4+和CD8+T細(xì)胞的免疫熒光圖像，標(biāo)尺=100μm；（F - J）不同治療后檢測(cè)到的血清IL - 6、TNF - α、IFN - γ、IL - 10和IL - 12水平，所有數(shù)據(jù)均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）

（7）抗腫瘤治療的機(jī)制探索

從接受PBS和S - surg+PTT+IT治療的小鼠體內(nèi)收集腫瘤組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，兩組腫瘤的基因表達(dá)譜差異由圖7A中的Venn圖所示，共鑒定出869個(gè)差異表達(dá)基因，包括632個(gè)上調(diào)基因和237個(gè)下調(diào)基因（|log?FC|>1.0，P≤0.05）?；鹕綀D（圖7B）展示了DEGs的分布，顯著上調(diào)的基因以紅色表示，下調(diào)的基因以藍(lán)色表示。差異表達(dá)基因通過(guò)基因本體論（GO）分析被歸類為“生物過(guò)程”、“細(xì)胞組分”和“分子功能”模塊，在細(xì)胞粘附、細(xì)胞外空間、微絲馬達(dá)活性等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。進(jìn)一步篩選出20個(gè)與免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因，包括抗原處理和呈遞相關(guān)的CD1B和CALR，細(xì)胞因子相關(guān)的ADM2、ANGPTL5和AMBN，趨化因子相關(guān)的CCL13和CAMP，這些基因在S - surg+PTT+IT組中顯著上調(diào)（圖7C），表明PTT聯(lián)合免疫治療能有效刺激腫瘤組織中的免疫反應(yīng)。免疫相關(guān)基因的京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析顯示，免疫反應(yīng)的激活主要依賴于細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)、C型凝集素受體信號(hào)通路以及細(xì)胞色素P450的氧化作用，S - surg+PTT+IT治療有效激活了小鼠的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)了免疫抑制性微環(huán)境，增強(qiáng)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤免疫治療的療效。RNA - Seq數(shù)據(jù)的KEGG富集分析顯示，S - surg+PTT+IT治療改變了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中與HIF - 1α信號(hào)通路、MEK/ERK信號(hào)通路和PI3K - Akt信號(hào)通路等相關(guān)的基因表達(dá)（圖7D）。Western blot檢測(cè)顯示，在S - surg+PTT+IT組中p - MEK和p - ERK水平降低，而MEK、ERK、PI3K、P - AKT和HIF - 1α水平?jīng)]有顯著變化（圖7E），免疫熒光分析進(jìn)一步證實(shí)了S - surg+PTT+IT組中P - MEK和P - ERK表達(dá)的顯著下調(diào)（圖7F），表明S - surg+PTT+IT治療抗GBM效應(yīng)的可能機(jī)制之一是MEK/ERK信號(hào)通路的抑制。

圖7 轉(zhuǎn)錄組分析抗腫瘤機(jī)制。（A）顯示PBS組和S-surg+PTT+IT組腫瘤基因表達(dá)重疊的維恩圖；（B）PBS組和S-surg+PTT+IT組腫瘤中上調(diào)和下調(diào)基因的火山圖；（C）顯示差異表達(dá)免疫相關(guān)基因的熱圖；（D）PBS組和S-surg+PTT+IT組上調(diào)和下調(diào)基因簇的KEGG富集分析；（E）各組腫瘤組織中HIF - 1α、MEK、P - MEK、ERK、P - ERK、PI3K、AKT和P - AKT的表達(dá)的Western印跡；（F）GBM組織中P - MEK和P - ERK的免疫熒光染色，標(biāo)尺=20μm