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針對(duì)上述問題，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于仿生肽修飾脂質(zhì)納米顆粒的噴霧式水凝膠系統(tǒng)。定制的兩種肽分別為血小板粘附肽（PAP，序列：GFOGER）和血小板交聯(lián)肽（PCP，序列：GGQQLK），通過酰胺鍵連接到DSPE-PEG2000-COOH上，形成DSPE-PEG-PAP和DSPE-PEG-PCP。這些化合物與二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇以及二硬脂酰磷脂酰絲氨酸混合，通過薄膜水化法構(gòu)建出肽修飾的脂質(zhì)納米顆粒，隨后被納入由CaCl?和藻酸鈉構(gòu)成的離子交聯(lián)噴霧式水凝膠中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該水凝膠在肝臟出血模型中30秒內(nèi)迅速凝膠化并密封傷口。PAP激活并黏附血小板，DSPS和Ca2?放大凝血酶原激活，PCP強(qiáng)化纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，共同促進(jìn)快速止血。該噴霧式水凝膠在管理非壓縮性出血方面具有顯著潛力，為未來臨床應(yīng)用提供了新策略。該文章以《A Sprayable Hydrogel Based on Biomimetic Polypeptide-Modified Lipid Nanoparticles for Treating Non-Compressible Hemorrhaging》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI: 10.1002/adma.202500908）。

研究示意圖

（1）多肽修飾脂質(zhì)納米粒（PLNs）可噴霧水凝膠的設(shè)計(jì)與表征

圖1a展示了血小板粘附肽（PAP）和血小板交聯(lián)肽（PCP）分別通過酰胺鍵連接到DSPE-PEG2000-COOH載體上的合成過程。圖1b通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析確認(rèn)了兩種脂肽偶聯(lián)物的成功合成，DSPE-PEG2000-PAP的質(zhì)量為2732.31 Da，DSPE-PEG2000-PCP的質(zhì)量為2684.31 Da。圖1c是PLNs制造過程的示意圖，利用薄膜水化法將膽固醇、DSPC、DSPS、DSPE-PEG-PCP和DSPE-PEG-PAP自組裝成異多價(jià)肽修飾的納米顆粒。圖1d顯示PLNs的ζ電位數(shù)據(jù)，表明其表面帶有負(fù)電荷。圖1e的動(dòng)態(tài)光散射顯示PLNs的平均粒徑約為100 nm，圖1f的透射電子顯微鏡圖像證實(shí)了這一尺寸分布，且顆粒形態(tài)良好且均勻。

圖1 多肽修飾脂質(zhì)納米粒的設(shè)計(jì)和表征。（a）兩種脂肽綴合物的合成；（b）兩種脂肽綴合物的MALDI-TOF MS（Th：理論質(zhì)量）；（c）使用薄膜水合制備膽固醇、DSPC、DSPS、DSPE-PEG-PCP和DSPE-PEG-PAP以自組裝成雜多價(jià)多肽修飾的納米顆粒的PLN的制備示意圖（DSPC，二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；DSPE，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N [甲氧基]；DSPS，二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-L絲氨酸；PCP，血小板交聯(lián)肽；PAP，血小板粘附肽）；（d）PLN的Zeta電位；（e）通過動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)的PLN的尺寸分布；（f）PLN的透射電子顯微鏡圖像，比例尺=100 nm

圖2展示了PLNs與不同成分結(jié)合后的性能評(píng)估。圖2a證明了PLNs在Ca2?存在下具有快速凝膠化的特性。圖2b和2c通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量了富含血小板血漿（PRP）與不同樣品共孵育后CD62P陽性血小板比率的變化，結(jié)果顯示PLNs能夠顯著促進(jìn)血小板活化。圖2d的熒光圖像進(jìn)一步證實(shí)了PLNs對(duì)血小板的黏附作用。圖2e展示了PLNs噴霧式水凝膠在大鼠肝臟切口模型中的止血效果，表明其相比傳統(tǒng)止血材料具有更好的止血效能，減少了出血量并縮短了止血時(shí)間。

圖2 PLN/凝膠的制備和表征。（a）PLN/凝膠的設(shè)計(jì)和照片；（b）PLN/凝膠的原位止血照片；（c）不同凝膠濃度的凝血指數(shù)；（d）凝膠和PLN/凝膠的孔隙率和（e）溶脹比（ns=不顯著；*p<0.05，*p<0.001，每組n=3）

（2）PLNs可噴霧水凝膠的生物相容性和降解性

圖3a顯示水凝膠對(duì)紅細(xì)胞的溶血率均低于5%，無毒性。圖3b表明水凝膠處理組的LDH釋放量與PBS對(duì)照組相似，對(duì)血小板無顯著毒性。圖3c和3d顯示人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與水凝膠共培養(yǎng)后，細(xì)胞活力超過95%，形態(tài)正常，AO/EB染色幾乎無死細(xì)胞，證明水凝膠的細(xì)胞相容性。圖3e顯示14天時(shí)Gel組降解率為63.74±2.78%，PLNs/Gel組為71.44±6.74%，有良好體外降解行為。圖3f和g顯示將Gel和PLNs/Gel應(yīng)用于大鼠肝臟表面損傷部位后，14天組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)周圍組織無顯著病理反應(yīng)，各器官也無明顯變化，確認(rèn)其良好組織相容性。圖3h和3i顯示植入材料后SD大鼠全血功能、肝腎功能等指標(biāo)均正常，說明植入材料對(duì)主要代謝器官功能無不利影響。

圖3 PLNs/Gel的體外和體內(nèi)生物相容性。（a）PLN、凝膠和PLN/凝膠組的照片和溶血率，PBS和Triton X-100分別用作陰性和陽性對(duì)照；（b）與PLN、凝膠或PLN/凝膠孵育2小時(shí)后，指示血小板毒性的LDH活性；（c）人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）在與培養(yǎng)基、PLN、凝膠和PLN/凝膠提取物溫育24和48小時(shí)后的細(xì)胞存活率；（d）用PLN/凝膠提取物孵育后HUVEC的代表性活/死染色圖像；（e）在PBS中溶菌酶對(duì)凝膠和PLN/凝膠的體外降解曲線；（f）水凝膠植入大鼠肝臟的實(shí)驗(yàn)方案；（g）在肝臟中植入水凝膠7天和14天后，心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟的代表性H&E圖像；（h）全血細(xì)胞計(jì)數(shù)和（i）皮下植入凝膠和PLN/凝膠后14天的Sprague道利大鼠的血液生化分析（WBC，白細(xì)胞；Lym#，淋巴細(xì)胞；RBC，紅細(xì)胞；HGB，血紅蛋白；HCT，紅細(xì)胞壓積；PLT，血小板；ALT，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；ALP，堿性磷酸酶；ALB，白蛋白；CR，肌酐；GGT，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶；ns=不顯著；*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001，每組n=3）

（3）PLN與血小板相互作用以改善體外凝塊形成

圖4a展示了血小板通過不同成分刺激形成穩(wěn)定血凝塊的過程示意圖。圖4b顯示在新鮮抽取的血液樣本中，CD62P陽性血小板比例為0.33±0.15%。陽性對(duì)照組中，ADP激動(dòng)劑使93.27±0.74%的血小板被激活。圖4c顯示PLNs處理組中CD62P陽性血小板比例顯著高于DSPS、PCP和PAP處理組（分別為89.07±0.5% vs 66.57±0.81%、64.9±0.66%和68.9±0.78%，p<0.001），表明PLNs可協(xié)同誘導(dǎo)血小板活化。圖4d展示了PLNs與天然靜息血小板相互作用的顯微鏡圖像，PLNs（綠色熒光）與血小板表面結(jié)合并激活P-選擇素抗體（紅色熒光），顯示出雙熒光，表明PLNs可以結(jié)合并激活天然靜息狀態(tài)的血小板。

圖4 PLN和血小板之間的相互作用。（a）PLN機(jī)制示意圖；（b、c）流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同樣品（NC：富血小板血漿；PC：ADP血小板激動(dòng)劑，終濃度為10 μM）培養(yǎng)的富血小板血漿（PRP）中CD62P陽性血小板率；（d）與PLN共孵育后血小板的熒光圖像（綠色：PLN；紅色：PE-CD62P，表明血小板活化）（ns=不顯著；*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001，每組n=3）

圖5展示了PLNs參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的過程及其效果。圖5a概述了血小板在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用。圖5b至5d顯示PLNs處理組的APTT、TT和PT均顯著縮短，表明PLNs能加速凝血過程。圖5e顯示PLNs處理組纖維蛋白凝塊的吸光度增加，驗(yàn)證了PLNs對(duì)凝塊形成的促進(jìn)作用。圖5f展示了將修飾納米顆粒注射到大鼠尾靜脈出血模型中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。圖5g和5h顯示PLNs處理組的出血量顯著減少且止血時(shí)間明顯縮短。圖5i顯示PLNs顯著增加激活血小板的聚集率，促進(jìn)止血并減少血栓風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 PLN參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。（a）血小板參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)；（b）治療后貧血小板血漿（PPP）中活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）的分析；（c）凝血酶時(shí)間（TT）的分析；（d）凝血酶原時(shí)間（PT）的分析；（e）形成的纖維蛋白凝塊吸光度；（f）在大鼠尾部橫切出血模型中，將修飾的納米顆粒注射到尾靜脈中；（g）處理30 min后，通過切斷尾部測(cè)量失血量；（h）止血時(shí)間；（i）血小板聚集率（ns=不顯著；*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001，每組n=3）

（4）PLNs可噴霧水凝膠對(duì)紅細(xì)胞和血小板的粘附作用

圖6a顯示噴霧水凝膠與全血共孵育后約30秒內(nèi)形成穩(wěn)定血凝塊，凝血速度顯著優(yōu)于紗布和明膠海綿等傳統(tǒng)止血材料。血液凝固指數(shù)（BCI）測(cè)定證實(shí)其優(yōu)異凝血效能，BCI值越低止血效果越顯著。噴霧水凝膠接觸血液后迅速形成膠體網(wǎng)絡(luò)，覆蓋傷口物理性阻止血細(xì)胞流失，負(fù)電荷海藻酸鹽材料吸附多種血液蛋白增強(qiáng)血細(xì)胞聚集，PLNs加速傷口處血小板激活觸發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，鈣離子激活凝血過程促使血細(xì)胞快速聚集。圖6b和c定量分析不同材料表面的紅細(xì)胞和血小板粘附率，PLNs/Gel組紅細(xì)胞粘附率為92.66±3.85%，血小板粘附率為91.05±4.61%，顯著高于Gel組和其他對(duì)照組，證實(shí)PLNs噴霧水凝膠能有效增強(qiáng)血細(xì)胞粘附能力促進(jìn)凝血過程。圖6d和e通過SEM觀察材料表面紅細(xì)胞和血小板粘附情況，Gel和PLNs/Gel組表面有大量聚集的紅細(xì)胞和血小板，PLNs/Gel組血小板展現(xiàn)明顯偽足延伸，表明血小板被激活，而紗布和明膠海綿對(duì)照組僅吸附少量血細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)噴霧水凝膠對(duì)血細(xì)胞聚集的促進(jìn)作用。圖6f為PLNs噴霧水凝膠在大鼠肝臟出血模型中止血的示意圖，描繪其在肝臟出血部位形成緊密物理屏障迅速阻止血液流失。圖6g的SEM圖像展示噴霧水凝膠在肝臟出血部位的應(yīng)用效果，快速凝膠網(wǎng)絡(luò)在傷口處形成致密物理屏障固定大量紅細(xì)胞，聚集紅細(xì)胞形態(tài)由雙凹圓盤狀變?yōu)椴灰?guī)則形狀，因PLNs加速血小板激活導(dǎo)致血小板收縮應(yīng)力引發(fā)纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)收縮，PLNs表面多價(jià)修飾增強(qiáng)血小板和纖維蛋白間凝塊形成，減小附著纖維蛋白絲間角度促使網(wǎng)絡(luò)收縮，傷口處快速凝膠化使紅細(xì)胞緊密關(guān)聯(lián)，共同促進(jìn)聚集紅細(xì)胞形態(tài)變化。

圖6 PLN/凝膠誘導(dǎo)的體外凝血。（a）空白組、紗布組、GS組、凝膠組和PLN/凝膠組的時(shí)間依賴性凝血行為和BCI值；（b）紗布、GS、凝膠和PLN/凝膠組中RBC粘附百分比的定量分析；（c）血小板粘附百分比的定量分析；（d）RBC粘附的代表性SEM圖像；（e）血小板粘附的代表性SEM圖像，還顯示了矩形區(qū)域的高倍放大圖像（白色箭頭：紅細(xì)胞或血小板；紅色箭頭：活化的血小板）；（f）觀察區(qū)的示意圖；（g）肝出血部位的SEM圖像（ns=不顯著；*p<0.05，*p<0.001，每組n=3）

（5）PLNs可噴霧水凝膠的止血性能

圖7a展示了大鼠肝臟切口模型的示意圖，肝臟表面制造5毫米切口模擬急性出血，觀察不同材料止血效果。圖7b顯示不同材料處理后止血效果，PLNs/Gel組出血明顯減少，凝血速度快，止血效果優(yōu)于其他組。圖7c展示了PLNs的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，PAP和PCP分別激活和粘附血小板，DSPS和Ca2?放大凝血酶激活過程，PCP與纖維蛋白交聯(lián)形成穩(wěn)定凝血塊。圖7d和e定量分析了不同處理組的失血量和止血時(shí)間，PLNs/Gel組失血量為0.44±0.08克，止血時(shí)間為29.48±2.83秒，均顯著優(yōu)于其他組。實(shí)驗(yàn)表明PLNs噴霧水凝膠通過模擬凝血機(jī)制，快速形成穩(wěn)定凝血塊，提升止血效率，具有處理復(fù)雜傷口和內(nèi)部器官傷口的潛力。

圖7 大鼠模型中PLN/Gel的體內(nèi)止血功效。（a）大鼠肝臟切開模型的圖示；（b）紗布、GS、凝膠和PLN/凝膠在大鼠肝臟切口模型中的止血效果；（c）多肽修飾脂質(zhì)納米粒的設(shè)計(jì)與機(jī)理；（d）大鼠肝臟切開模型中的失血量；（e）止血時(shí)間（ns=不顯著；*p<0.05，*p<0.001，每組n=3）