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針對上述問題，山東大學(xué)晶體材料國家重點實驗室和齊魯醫(yī)院神經(jīng)外科仇吉川教授、劉宏教授、桑元華教授、齊魯醫(yī)院李剛教授和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院易凡教授團隊聯(lián)合設(shè)計了鈦酸鋇/還原氧化石墨烯（BTO/rGO）雜化壓電納米貼片，用于創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的神經(jīng)干細胞（NSC）治療。該納米貼片經(jīng)超聲激活，可在NSC膜表面產(chǎn)生長期壓電電位，激活電壓門控鈣通道（VGCC）等下游信號通路，加速NSC的神經(jīng)元分化和成熟。在大鼠TBI模型中，移植帶有BTO/rGO納米貼片的NSC并結(jié)合超聲刺激，28天內(nèi)可顯著修復(fù)腦組織并恢復(fù)生理功能。相關(guān)成果于2025年5月6日以《Ultrasound-activated piezoelectric nanostickers for neural stem cell therapy of traumatic brain injury》為題發(fā)表于《Nature Materials》（DOI：10.1038/s41563-025-02214-w）。

研究示意圖

（1）BTO納米顆粒無法誘導(dǎo)神經(jīng)元分化

四方相鈦酸鋇（BTO）納米粒子呈立方體形狀，平均邊長200 nm（圖1a,b）。選區(qū)電子衍射圖像顯示其具有四方晶系衍射圖案（圖1c）。高分辨率透射電子顯微鏡圖像確認晶面間距分別為0.401納米和0.399納米，對應(yīng)四方晶系BTO的（001）和（100）晶面（圖1c）。掃描透射電子顯微鏡（STEM）和能量色散X射線分析（EDX）確認了BTO納米粒子中Ba、Ti和O的存在及其均勻分布（圖1d）。X射線衍射圖譜中2θ=45°處的峰分裂對應(yīng)四方相BTO的（002）和（200）衍射峰，進一步確認其四方晶系結(jié)構(gòu)（圖1e）。壓電力顯微鏡顯示BTO納米粒子具有壓電響應(yīng)和極化切換行為（圖1f）。超聲輻射下，固定BTO納米粒子的微電極產(chǎn)生約0.8 mV的周期性電壓（圖1g）。BTO納米粒子與神經(jīng)干細胞（NSC）共培養(yǎng)后超聲輻射，未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元標志物Tuj1和MAP2的基因或蛋白表達水平有顯著差異（圖1h-k）。BTO+超聲處理在第3天殺死了近10%的NSC，并抑制其增殖（圖1m,n）。BTO+超聲處理誘導(dǎo)NSC中顯著的活性氧（ROS）生成（圖1o,p）。BTO納米粒子被內(nèi)化到溶酶體中，在酸性環(huán)境中，壓電電位易引發(fā)氧進化反應(yīng)并生成ROS（圖1q）。為防止BTO納米粒子內(nèi)吞，設(shè)計了BTO/還原氧化石墨烯（rGO）雜化壓電納米貼片，將BTO納米粒子附著在二維rGO納米片表面。

圖1 BTO 納米粒子的特性及其對 NSC 的影響。（a）BTO納米粒子的SEM圖像；（b）BTO納米粒子的代表性TEM圖像；（c）BTO納米粒子的代表性高分辨率TEM和選區(qū)電子衍射（插圖）圖像；（d）BTO納米粒子的代表性STEM圖像；（e）BTO納米粒子的X射線衍射分析，a.u.為任意單位；（f）BTO納米粒子的相滯回線和蝴蝶滯回線；（g）BTO納米粒子在超聲照射下的電信號，右圖為部分信號放大圖像，箭頭指示超聲施加時刻；（h）和（i）為5天后神經(jīng)干細胞中Tuj1（h）和MAP2（i）的mRNA水平；（j）和（k）為5天后神經(jīng)干細胞的Western blot（j）和相關(guān)分析（k）；（l）和（m）為3天后活/死檢測（l）和神經(jīng)干細胞存活率分析（m）的圖像；（n）為神經(jīng)干細胞的CCK-8檢測結(jié)果；（o）為不同處理下神經(jīng)干細胞中ROS水平的測量；（p）為ROS水平的統(tǒng)計分析；（q）為溶酶體和BTO納米粒子共定位的代表性圖像

（2）BTO/rGO 納米貼片的合成與生物相容性

BTO納米粒子通過化學(xué)組裝固定在氧化石墨烯納米片上，經(jīng)水溶液還原處理后合成BTO/rGO雜化壓電納米貼片。掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡圖像顯示BTO納米粒子牢固附著在rGO納米片上，形成靈活片狀納米結(jié)構(gòu)（圖2a,b）。電子探針X射線顯微分析和STEM圖像確認BTO納米粒子附著后仍保持立方體形狀和化學(xué)組成（圖2c）。相電壓滯回線和鐵電蝴蝶滯回線證實雜化納米貼片具良好壓電性能（圖2d）。多電極陣列評估顯示，單個BTO/rGO納米貼片在超聲輻射下可產(chǎn)生1毫伏壓電電位（圖2e,f），而單獨rGO納米片無電位輸出。熒光和SEM圖像顯示BTO/rGO納米貼片緊密附著在NSC膜上（圖2g,h），有利于壓電電荷轉(zhuǎn)移。DCFH-DA染色顯示，共培養(yǎng)NSC在超聲輻射下未產(chǎn)生ROS（圖2i,j）?；?死染色（圖2k,l）、EdU增殖實驗（圖2m,n）和CCK-8實驗（圖2o）表明，BTO/rGO納米貼片在超聲輻射下對細胞活性或增殖無副作用，限制壓電電位在膜外可防止由內(nèi)吞BTO納米粒子引起的細胞毒性ROS。BTO/rGO雜化壓電納米貼片具有良好生物相容性，可作為細胞外納米貼片產(chǎn)生壓電電荷刺激細胞膜受體，且不誘導(dǎo)細胞內(nèi)產(chǎn)生細胞毒性ROS。

圖2 BTO/rGO 納米貼紙的特性和生物相容性。（a）BTO/rGO納米貼片的SEM圖像；（b）BTO/rGO納米貼片的代表性TEM圖像；（c）BTO/rGO納米貼片的代表性STEM圖像；（d）BTO/rGO納米貼片的相滯回線和蝴蝶滯回線；（e）單個rGO納米片或BTO/rGO納米貼片在超聲照射下通過MEA產(chǎn)生電信號的測量方法示意圖；（f）單個BTO/rGO納米貼片在超聲照射下產(chǎn)生的電信號，右圖為部分信號放大圖像，箭頭指示超聲施加時刻；（g）NSCs與BTO/rGO納米貼片之間位置關(guān)系的代表性圖像（綠色，BTO/rGO納米貼片；紅色，NSCs的細胞膜；藍色，Hoechst）；（h）BTO/rGO納米貼片與NSCs之間位置關(guān)系的SEM圖像及相應(yīng)的Ba和Ti的能譜X射線分析映射；（i）不同處理后的NSCs中的ROS水平；（j）ROS水平的統(tǒng)計分析；（k）活死染色實驗圖像；（l）3天后神經(jīng)干細胞（NSCs）存活率分析；（m）神經(jīng)干細胞（NSCs）的Edu增殖實驗結(jié)果（綠色，增殖細胞；藍色，Hoechst）；（n）通過Edu增殖實驗評估的神經(jīng)干細胞增殖能力；（o）神經(jīng)干細胞的CCK-8實驗結(jié)果

（3）BTO/rGO 納米貼片促進神經(jīng)元分化

超聲激活的BTO/rGO壓電納米貼片對NSC神經(jīng)元分化的促進作用在基因和蛋白水平上得到評估。如圖3a–f所示，BTO/rGO+超聲（US）處理顯著增加了Tuj1和MAP2的基因和蛋白表達，但不影響膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達，表明該處理促進了NSC向神經(jīng)元分化，而不影響神經(jīng)膠質(zhì)分化。在相同培養(yǎng)條件下，只有四方相BTO/rGO+超聲處理（T-BTO/rGO+US）促進了NSC向神經(jīng)元分化，而rGO納米片或非壓電立方相BTO/rGO納米貼片（C-BTO/rGO）無此效果（圖3g–k），說明壓電信號在NSC神經(jīng)元分化中起關(guān)鍵作用。第7天的免疫熒光分析顯示，BTO/rGO+US組的NSC具有更高的Tuj1表達，分化出更多神經(jīng)元，其中約15%的細胞為Tuj1陽性神經(jīng)元，而其他組僅有約7%（圖3l,m）。

圖3 BTO/rGO壓電納米貼紙促進神經(jīng)元相關(guān)生物標志物的表達。（a）超聲激活的 BTO/rGO 壓電納米貼片促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的示意圖。（b–d）5 天后神經(jīng)干細胞中 Tuj1（b）、MAP2（c）和 GFAP（d）的 mRNA 水平。（e，f）5 天后神經(jīng)干細胞中的 Western blot（e）及關(guān)聯(lián)分析（f）。（g，h）加入對照組后 5 天培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中 Tuj1（g）和 MAP2（h）的 mRNA 水平。（i–k）加入對照組后 5 天培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中的 Western blot（i）及 Tuj1（j）和 MAP2（k）的關(guān)聯(lián)分析。（l）第 7 天的 Tuj1/GFAP 免疫熒光染色。（m）基于 Tuj1/GFAP 免疫熒光染色的分化神經(jīng)元與總神經(jīng)干細胞的比率

（4）BTO/rGO 納米貼片加速神經(jīng)元的成熟

在第10天，BTO/rGO+US組神經(jīng)元數(shù)量顯著增多且突觸長度更長（圖4a）。Sholl分析顯示，BTO/rGO+US組分化神經(jīng)元的神經(jīng)突復(fù)雜度最高（圖4b），表明超聲激活的BTO/rGO壓電納米貼片可加速分化神經(jīng)元成熟。實時鈣離子成像和熒光強度分析表明，第5天時BTO/rGO+US組分化神經(jīng)元出現(xiàn)明顯鈣離子流入流出（圖4c,d中黃色箭頭所示），而其他三組未觀察到該現(xiàn)象，說明無BTO/rGO+US處理時，NSC未分化成功能性神經(jīng)元。BTO/rGO+US組在第10天和第15天的MAP2水平更高，軸突更長，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)更復(fù)雜（圖4e,f）。西方印跡法證實，第10天BTO/rGO+US組神經(jīng)元分化程度顯著高于第15天TCP組（圖4g–i），即BTO/rGO+US處理誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元成熟速度至少加快5天。與突觸相關(guān)的標記物GAP43、PSD95、SYP在BTO/rGO+US組表達水平高于其他三組（圖4j–o），表明壓電刺激加速了突觸成熟。這些結(jié)果表明，僅需5天超聲激活BTO/rGO壓電納米貼片處理，就能加速NSC向成熟神經(jīng)元分化，促進突觸和網(wǎng)絡(luò)快速構(gòu)建，對修復(fù)受損神經(jīng)系統(tǒng)及實現(xiàn)快速NSC基礎(chǔ)的TBI治療意義重大。

圖4 BTO/rGO 壓電納米貼紙加速神經(jīng)元成熟和突觸形成。（a）第10天的MAP2/GFAP免疫熒光代表性圖像。DAPI，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；（b）第10天NSC來源神經(jīng)元的Sholl分析；（c，d）實時鈣離子成像（c）和代表性細胞在不同時間的熒光強度統(tǒng)計分析（d）；（e）第10天和第15天的MAP2/GFAP免疫熒光代表性圖像；（f）第10天和第15天NSCs的Sholl分析；（g–i）第10天和第15天NSCs中Tuj1和MAP2的Western blot（g）以及相關(guān)的Tuj1（h）和MAP2（i）分析；（j）Tuj1/GAP43的免疫熒光染色；（k）GAP43熒光強度的統(tǒng)計分析；（l）Tuj1/PSD95的免疫熒光染色；（m）PSD95熒光強度的統(tǒng)計分析；（n）Tuj1/SYP的免疫熒光染色；（o）SYP熒光強度的統(tǒng)計分析

（5）驗證細胞內(nèi)下游機制

信使RNA測序結(jié)果顯示，鈣離子相關(guān)信號通路對超聲激活的BTO/rGO壓電納米貼片誘導(dǎo)的NSC神經(jīng)元分化至關(guān)重要。圖5a顯示，BTO/rGO+US處理后細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著增加，表明BTO/rGO+US誘導(dǎo)的壓電位促進了鈣離子內(nèi)流。圖5b顯示，BTO/rGO+US處理3天后，Tuj1和MAP2蛋白水平顯著高于其他組。使用鈣離子螯合劑BAPTA-AM抑制下游信號傳導(dǎo)后，圖5d顯示BAPTA-AM顯著抑制了BTO/rGO+US組NSC的加速分化，表明鈣離子在促進NSC神經(jīng)元分化的信號通路中起關(guān)鍵作用。研究表明，超聲激活的BTO/rGO納米貼片產(chǎn)生的壓電信號通過鈣相關(guān)的膜受體啟動了鈣離子內(nèi)流和隨后的信號傳導(dǎo)。使用特異性抑制劑阻斷VGCC、Piezo1和TRPC1三種通道后，圖5f–h顯示用ω-蝎毒素-Hv1a（Hv1a）阻斷VGCC顯著抑制了鈣離子內(nèi)流及BTO/rGO+US組NSC的神經(jīng)元分化，而圖5i–k顯示抑制Piezo1和TRPC1未產(chǎn)生影響，表明VGCC是壓電信號向細胞內(nèi)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵通道。蛋白質(zhì)印跡實驗顯示，與TCP組相比，BTO/rGO+US組3天后磷酸化CaMK II（P-CaMK II）表達上調(diào)4.9倍，磷酸化CREB（P-CREB）表達增加3.3倍，BDNF表達增加5.4倍（圖5l,m）。免疫熒光染色顯示，BTO/rGO+US組中NSCs的P-CaMK II、P-CREB和BDNF表達水平升高（圖5n–p）。酶聯(lián)免疫吸附測定檢測到BTO/rGO+US組培養(yǎng)基中BDNF濃度增加（圖5q）。上述結(jié)果表明，壓電納米貼片誘導(dǎo)的神經(jīng)元分化過程中，關(guān)鍵信號由壓電勢產(chǎn)生，通過VGCC/Ca2?/CaMK II/CREB通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終提高BDNF表達（圖5r）。

圖5 BTO/rGO 壓電納米貼紙激活 VGCC 并誘導(dǎo)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。（a）對不同處理條件的 NSCs 進行鈣離子成像（i）及其相關(guān)的統(tǒng)計分析（ii）；（b）3 天后 NSCs 的 Western blot（i）及其相關(guān)的 Tuj1（ii）和 MAP2（iii）分析；（c）BAPTA-AM 作用于鈣離子的作用機制示意圖；（d）使用或未使用 BAPTA-AM 處理的 NSCs 的 Western blot（i）及其相關(guān)的 Tuj1（ii）和 MAP2（iii）分析；（e）鈣離子進入細胞的途徑示意圖；（f）Hv1a 作用于 VGCC 的作用機制示意圖；（g）使用或未使用 Hv1a 處理的 NSCs 的鈣離子成像（i）及其相關(guān)的統(tǒng)計分析（ii）；（h）使用或未使用 Hv1a 處理的 NSCs 的 Western blot（i）及其相關(guān)的 Tuj1（ii）和 MAP2（iii）分析；（i）GsMTX4 作用于 Piezo1 和 TRPC1 的作用機制示意圖；（j）使用或未使用 GsMTX4 處理的 NSCs 的鈣離子成像（i）及其相關(guān)的統(tǒng)計分析（ii）；（k）使用或未使用 GsMTX4 處理的 NSCs 的 Western blot（i）及其相關(guān)的 Tuj1（ii）和 MAP2（iii）分析；（l，m）3 天不同處理條件的 NSCs 的 Western blot（l）及其相關(guān)的分析（m）；（n）第 3 天的 P-CaMK II 免疫熒光染色（i）及其相關(guān)熒光強度統(tǒng)計分析（ii）；（o）第 3 天的 P-CREB 免疫熒光染色（i）及其相關(guān)熒光強度統(tǒng)計分析（ii）；（p）第 3 天的 BDNF 免疫熒光染色（i）及其相關(guān)熒光強度統(tǒng)計分析（ii）；（q）通過酶聯(lián)免疫吸附測定測量 NSC 分泌的 BDNF 量；（r）超聲激活的 BTO/rGO 納米貼片產(chǎn)生的壓電信號作用于 VGCC 和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制示意圖

（6）基于NSCs的治療加速了大鼠TBI后的恢復(fù)

本研究構(gòu)建大鼠TBI模型，評估超聲激活的BTO/rGO壓電納米貼片在基于NSC的神經(jīng)再生治療中的效果。實驗分9組，術(shù)后1、7、14、21、28天進行神經(jīng)功能缺損評分。結(jié)果顯示，TBI+NSC+BTO/rGO+US組得分最低，第28天能在平衡梁上停留超60秒（圖6b），在高架身體擺動測試中表現(xiàn)最佳（圖6c），表明該組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)顯著改善。術(shù)后28天分析大鼠腦組織樣本，TBI+NSC+BTO/rGO+US組腦組織空洞被新生神經(jīng)組織填充（圖6d）。HE染色顯示該組未修復(fù)損傷區(qū)域面積最小且修復(fù)組織排列有序（圖6e）。尼氏染色顯示，該組大鼠腦組織尼氏體正常，其他組則變薄、變小甚至溶解（圖6f）。免疫熒光染色顯示，該組大多數(shù)移植的NSC（經(jīng)PKH26標記）分化成功能性神經(jīng)元（圖6g,h），且該組中移植的NSC產(chǎn)生的成熟和未成熟神經(jīng)元數(shù)量更多（圖6i–l），表明超聲激活的BTO/rGO納米貼片促進了NSC向神經(jīng)元分化，增強了神經(jīng)功能恢復(fù)和腦組織再生?？傊?，超聲激活的BTO/rGO壓電納米貼片提高了基于NSC的療法的有效性，為TBI治療提供了巨大潛力。

圖6 基于NSC的治療加速神經(jīng)功能恢復(fù)和組織再生。（a）TBI實驗示意圖；（b）九組在治療期間神經(jīng)功能嚴重程度評分；（c）九組在治療期間體擺動測試結(jié)果；（d）治療28天后腦部代表性圖像；（e）腦部HE染色代表性全景掃描和局部放大圖像，每組每張圖像來自一只大鼠；（f）腦部尼氏染色代表性圖像，每組每張圖像來自一只大鼠；（g）實驗動物治療28天后腦組織切片NeuN免疫熒光染色；（h）NeuN陽性細胞與移植NSCs的比例；（i）實驗動物治療28天后腦組織切片MAP2免疫熒光染色；（j）MAP2陽性細胞與移植NSCs的比例；（k）實驗動物治療28天后腦組織切片Tuj1免疫熒光染色；（l）Tuj1陽性細胞與移植NSCs的比例