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受人類(lèi)皮膚保濕和保護(hù)功能的啟發(fā)，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院廖威明主任和華南理工大學(xué)張琨雨、邊黎明教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種用于加速糖尿病足潰瘍（DFU）愈合的活性氧驅(qū)動(dòng)的供氧水凝膠噴霧（OxyGel）。該噴霧結(jié)合了模擬超氧化物歧化酶（SOD）/過(guò)氧化氫酶（CAT）功能的納米酶和動(dòng)態(tài)交聯(lián)的超分子水凝膠。通過(guò)唑來(lái)膦酸輔助組裝鈰離子并用單寧酸修飾，制備了具有級(jí)聯(lián)催化功能的納米酶（TCZ）。接著利用透明質(zhì)酸、去鐵胺修飾的β-環(huán)糊精和叔丁基苯乙酸修飾的透明質(zhì)酸，通過(guò)動(dòng)態(tài)主客體相互作用和席夫堿鍵制備了可噴霧的OxyGel，并通過(guò)氫鍵錨定TCZ納米酶。OxyGel能有效改善氧化和缺氧微環(huán)境，促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化，并增強(qiáng)體外內(nèi)皮細(xì)胞的存活、遷移和血管生成。在動(dòng)物模型中，僅一次使用OxyGel噴霧即可顯著加快兩周內(nèi)的傷口愈合。該文章于2025年6月10日以《Nanozyme-Reinforced Hydrogel Spray as a Reactive Oxygen Species-Driven Oxygenator to Accelerate Diabetic Wound Healing》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202504829）。

圖1 納米酶增強(qiáng)水凝膠噴霧作為活性氧驅(qū)動(dòng)的氧合器（OxyGel噴霧）加速糖尿病足部潰瘍傷口愈合的示意圖。a）TCZ納米酶的合成路線和級(jí)聯(lián)催化功能示意圖。b）OxyGel噴霧的制備工藝和交聯(lián)機(jī)制示意圖。c）OxyGel噴霧在糖尿病足部潰瘍治療中的作用機(jī)制

（1）TCZ 納米酶和可噴涂 OxyGel 的表征

構(gòu)建了一種納米酶增強(qiáng)型水凝膠噴霧。利用唑來(lái)膦酸介導(dǎo)鈰離子組裝形成CZ納米顆粒，再經(jīng)單寧酸修飾得到抗氧化的TCZ納米酶。透射電子顯微鏡（TEM）顯示TCZ納米酶為均勻球體，平均直徑100 nm，動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)得其流體動(dòng)力學(xué)尺寸約為150 nm（圖2a、b）。TCZ納米酶的催化活性源于Ce³⁺/Ce⁴⁺的氧化還原循環(huán)，具有SOD和CAT類(lèi)活性。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了TCZ納米酶的酶模擬活性（圖2c），其對(duì)超氧陰離子（?O₂^-）的清除能力呈劑量依賴性增加，電子順磁共振（EPR）光譜進(jìn)一步證實(shí)了其SOD模擬活性（圖2d）。TCZ納米酶催化H₂O₂分解產(chǎn)生氧氣的能力隨H₂O₂濃度增加而增強(qiáng)（圖2e）。在溶血實(shí)驗(yàn)中，TCZ納米酶在鈰離子濃度高達(dá)500 μM時(shí)仍保持穩(wěn)定的血液相容性（圖2f）。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示OxyGel具有均勻、連通的多孔微觀結(jié)構(gòu)（圖2h）。動(dòng)態(tài)流變測(cè)試表明，OxyGel具有典型的水凝膠行為，儲(chǔ)能模量（G’）高于損耗模量（G’’），且在75%應(yīng)變下仍能保持完整并快速恢復(fù)（圖2i、j、k）。OxyGel在12 h內(nèi)達(dá)到膨脹平衡并保持穩(wěn)定（圖S10）。通過(guò)單噴頭噴霧，OxyGel可形成均勻且覆蓋面積大的完整薄膜（圖2l、圖S11、S12）。與傳統(tǒng)預(yù)制水凝膠和注射水凝膠相比，OxyGel噴霧使用更方便，可為暴露在空氣中的糖尿病傷口提供即時(shí)物理保護(hù)。OxyGel的pH響應(yīng)性使其在酸性糖尿病傷口微環(huán)境中能夠智能調(diào)節(jié)TCZ納米酶的釋放速率（圖2m）。

圖2 TCZ 納米酶和可噴涂 OxyGel 的表征。 a) TCZ 納米酶的 TEM 圖像。b) 通過(guò) DLS 測(cè)量 TCZ 納米酶的水化尺寸分布。c) TCZ 納米酶的 SOD 和 CAT 模擬活性示意圖。d) TCZ 納米酶的 SOD 和 e) CAT 模擬活性測(cè)量（n  = 3）。f) TCZ 納米酶的血液相容性（n  = 3）。插圖：溶血測(cè)試的數(shù)碼照片。g) OxyGel 的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。h) OxyGel 的 SEM 圖像。i) OxyGel 的時(shí)間和 j) 應(yīng)變掃描測(cè)試。k) OxyGel 的流變學(xué)階躍應(yīng)變振蕩時(shí)間掃描測(cè)量。l) 噴涂 OxyGel 后形成的即時(shí)水凝膠膜的照片。 m) 不同條件下（pH 5.5、6.5 和 7.4）TCZ 納米酶從 OxyGel 中釋放的概況（n = 3）

（2）OxyGel水凝膠誘導(dǎo)抗炎M2巨噬細(xì)胞極化并捕獲過(guò)量的ROS以促進(jìn)氧合

在炎癥階段，通過(guò)脂多糖（LPS）刺激的巨噬細(xì)胞模型評(píng)估了OxyGel誘導(dǎo)M2型（抗炎）巨噬細(xì)胞極化的抗炎特性（圖3a）。實(shí)驗(yàn)中還構(gòu)建了不含TCZ納米酶的空白水凝膠（Gel）作為對(duì)照。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gel和OxyGel對(duì)巨噬細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）均具有良好的生物相容性。經(jīng)LPS刺激24小時(shí)后，與OxyGel共孵育的巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS，M1標(biāo)志物）熒光強(qiáng)度顯著降低，而精氨酸酶-1（Arg-1，M2標(biāo)志物）熒光強(qiáng)度增加，表明OxyGel可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)變（圖3b-e）。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果高度一致（圖3f-i，圖S17、S18）。與LPS+PBS組相比，OxyGel組巨噬細(xì)胞中促炎介質(zhì)（如CD86、白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α）的mRNA表達(dá)水平降低，而抗炎介質(zhì)（如CD206、白細(xì)胞介素-10和CD163）的基因表達(dá)水平升高，顯示出OxyGel的顯著抗炎功能。

此外，鑒于OxyGel具有清除活性氧（ROS）和產(chǎn)生氧氣的雙重功能，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了其將LPS誘導(dǎo)的ROS轉(zhuǎn)化為氧氣的能力。通過(guò)將HUVECs與OxyGel共孵育，并使用經(jīng)典的ROS探針2′7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）和氧氣探針三（4,7-二苯基-1,10-菲咯啉）釕（II）二氯化物復(fù)合物[Ru(dpp)?Cl?]進(jìn)行染色，觀察到OxyGel顯著降低了由LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS積累，熒光強(qiáng)度降低了約一倍（圖3j、k）。同時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)氧氣的生成，與OxyGel共培養(yǎng)的HUVECs中[Ru(dpp)?]Cl?的熒光信號(hào)顯著猝滅（圖3l、m）。這些結(jié)果證實(shí)了OxyGel能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)高效的ROS清除和持續(xù)的氧氣供應(yīng)，突顯了其在糖尿病傷口愈合中的治療潛力。

圖3 具有ROS 清除和O2生成雙重功能的 OxyGel 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從 M1 復(fù)極化為 M2。a) 示意圖說(shuō)明 OxyGel 對(duì) LPS 刺激的巨噬細(xì)胞的抗炎作用。b) 和 c) 未經(jīng)或經(jīng)不同處理的巨噬細(xì)胞的免疫熒光染色。比例尺，50 μm。d) 巨噬細(xì)胞中的 iNOS 和 e) Arg-1 熒光強(qiáng)度（n = 20）。fi) 通過(guò) RT-qPCR 分析評(píng)估的 M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（CD86 和 IL-1β）和 M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（CD206 和 IL-10）的 mRNA 水平（n = 3）。 jk) 使用 ROS 探針 (DCFH-DA) 測(cè)量 LPS 誘導(dǎo)的 ROS 清除功能。比例尺，200 μm。 lm)使用O2探針 [Ru(dpp)3Cl2 ]測(cè)量O2生成功能。紅色 Ru(dpp)3Cl2熒光被 O2猝滅( n  = 20)。比例尺，200 μm。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (SD) 表示；使用單因素方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 事后檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；***0.0001 < p  < 0.001，和 **** p  < 0.0001

（3）OxyGel水凝膠保護(hù)體外增殖、遷移和血管生成免受氧化損傷

在增殖階段，研究了OxyGel對(duì)過(guò)氧化氫（H₂O₂）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的保護(hù)作用（圖4a）。實(shí)驗(yàn)建立了H₂O₂誘導(dǎo)的氧化損傷模型，結(jié)果表明OxyGel能清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS，使ROS水平恢復(fù)正常（圖4b、c）。通過(guò)EdU摻入實(shí)驗(yàn)評(píng)估OxyGel在富含H₂O₂的微環(huán)境中對(duì)細(xì)胞增殖的保護(hù)作用H₂O₂+OxyGel組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明DNA合成增多（圖4d、e）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果與EdU實(shí)驗(yàn)一致，H₂O₂+OxyGel組的細(xì)胞增殖率高于H₂O₂+PBS組，顯示出OxyGel對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的氧化損傷具有緩解作用（圖4f）。

通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估H₂O₂刺激下HUVECs的遷移能力（圖4g、h）。結(jié)果顯示，H₂O₂顯著抑制了HUVECs的遷移，而OxyGel能逆轉(zhuǎn)這一抑制作用。在管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)中，H₂O₂+OxyGel組的HUVECs在共培養(yǎng)6小時(shí)后，分支數(shù)量和總分支長(zhǎng)度均顯著高于其他H₂O₂處理組，表明OxyGel具有促進(jìn)血管生成的潛力。

圖4 OxyGel 促進(jìn)H₂O₂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下 HUVEC 的增殖、遷移和血管生成。a) 示意圖說(shuō)明 OxyGel 對(duì)受H₂O₂刺激的 HUVEC 的保護(hù)作用。b、c)通過(guò) DCFH-DA 測(cè)量H₂O₂誘導(dǎo)的 OxyGel 的 ROS 清除能力 ( n =20)。比例尺，200 μm。de) HUVEC 中的免疫熒光圖像和 EdU 染色的量化 ( n =5)。比例尺，200 μm。f) 接受不同處理的 HUVEC 的細(xì)胞增殖測(cè)定 ( n =3)。g) 對(duì)接受不同處理的 HUVEC 在 0、12 和 24 小時(shí)進(jìn)行的劃痕愈合試驗(yàn) (n=3)。比例尺，200 μm。 h) 體外劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定的傷口愈合率（n =3）。i) 不同處理后HUVEC的成管能力。比例尺：100 μm。j、k) 分支數(shù)量和總分支長(zhǎng)度的量化（n  =3）

（4）OxyGel噴霧加速糖尿病全層背部皮膚傷口愈合

OxyGel具有良好的噴霧性、抗氧化能力、氧氣釋放和抗炎特性，有望用于糖尿病傷口愈合。實(shí)驗(yàn)建立了鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠全層背皮膚缺損模型（直徑10 mm），評(píng)估OxyGel噴霧的愈合加速性能（圖5a）。對(duì)切口傷口分別進(jìn)行一次Gel、OxyGel噴霧或商業(yè)水凝膠敷料（Hydrosorb）處理，未處理傷口作為對(duì)照。結(jié)果顯示，經(jīng)OxyGel噴霧處理的傷口在治療14天后愈合率顯著加快，接近100.00%，與其他組相比差異顯著（圖5b-e）。而Hydrosorb處理組在第14天的愈合率僅比對(duì)照組高約10.00%。

進(jìn)一步對(duì)四組再生傷口組織樣本進(jìn)行組織學(xué)分析，包括蘇木精-伊紅（H&E）染色和馬松染色（圖5f-j），評(píng)估傷口愈合參數(shù)，如瘢痕指數(shù)、表皮厚度和膠原比例。OxyGel噴霧組的瘢痕指數(shù)最低，表明其具有無(wú)瘢痕愈合的潛力（圖5g）。此外，該組傷口的表皮層最薄，有利于防止厚痂或瘢痕疙瘩形成（圖5h）。與對(duì)照組和Hydrosorb組相比，OxyGel噴霧組的膠原纖維排列更密集且有序，表明膠原沉積增強(qiáng)。

圖5 OxyGel 噴霧可加速大鼠糖尿病全層背部皮膚傷口愈合。 a) 體內(nèi)背部皮膚傷口（直徑 10 毫米）愈合研究的實(shí)驗(yàn)時(shí)間表，單次給藥和評(píng)估超過(guò) 14 天。b) 不同治療方法后背部傷口愈合過(guò)程的代表性照片。c) 從第 0 天到第 14 天的傷口閉合痕跡。d、e) 傷口面積（mm 2）和傷口閉合率的定量分析（n =6）。f) H&E 染色，g) 疤痕指數(shù)，和 h) 第 14 天背部傷口組織的表皮厚度（n =6）。比例尺，300 μm。i) 第 14 天背部傷口組織的 Masson 染色和膠原體積分?jǐn)?shù)（n =6）。比例尺，300 μm

（5）OxyGel噴霧調(diào)節(jié)傷口愈合過(guò)程的炎癥、增殖和重塑階段，加速難治性糖尿病足潰瘍傷口愈合

在全層背皮膚傷口愈合取得良好效果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步評(píng)估了OxyGel噴霧對(duì)糖尿病大鼠難治性糖尿病足潰瘍（DFUs）的治療效果。與背皮膚傷口相比，DFUs的治療要求更高，因?yàn)樽悴渴侨梭w負(fù)重的主要部位，長(zhǎng)期承受機(jī)械壓力、頻繁活動(dòng)且血供較差。通過(guò)在糖尿病大鼠足背打孔建立直徑6 mm的圓形全層切口DFU模型（圖6a）。在治療期間，OxyGel噴霧處理組的傷口愈合速度最快，第14天時(shí)傷口面積僅為原始面積的3.33%，且外觀接近正常皮膚組織，無(wú)肥厚性或瘢痕疙瘩形成（圖6b-e）。相比之下，Hydrosorb和Gel組的傷口閉合不完全，愈合率不理想。組織病理學(xué)評(píng)估（H&E染色和馬松染色）顯示，OxyGel組的DFU傷口愈合明顯，瘢痕指數(shù)顯著降低，表皮層薄，膠原纖維形成增強(qiáng)，愈合效果良好（圖6f-j）。此外，OxyGel處理組的皮膚組織修復(fù)良好，傷口表面連續(xù)且完整，新生血管、毛囊和腺體密度高，表明DFU傷口愈合過(guò)程穩(wěn)健且平衡。

圖6 OxyGel 噴霧可加速大鼠糖尿病足部潰瘍傷口愈合。a) 體內(nèi)足部潰瘍傷口（直徑 6 毫米）愈合研究的實(shí)驗(yàn)時(shí)間表，單次給藥和評(píng)估超過(guò) 14 天。b) 不同治療方法后足部潰瘍傷口愈合過(guò)程的代表性照片。c) 從第 0 天到第 14 天的傷口閉合痕跡。de) 傷口面積（mm 2）和傷口閉合率的定量分析（n = 6）。f) H&E 染色，g) 疤痕指數(shù)，和 h) 第 14 天足部潰瘍傷口組織的表皮厚度（n = 6）。比例尺，300 μm。i) 第 14 天足部潰瘍傷口組織的 Masson 染色和膠原體積分?jǐn)?shù)（n = 6）。比例尺，300 μm

OxyGel在DFU傷口愈合的三個(gè)階段中表現(xiàn)出良好效果。在炎癥階段期間，第7天DCFH-DA染色顯示OxyGel顯著清除ROS（圖7a、b）；第14天iNOS/Arg-1染色表明OxyGel促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1向M2極化（圖7a、c、d）。在增殖階段，第14天CD31和α-SMA共染色顯示OxyGel促進(jìn)新生血管形成（圖7a、e）；Western blot顯示OxyGel上調(diào)HIF-1α和VEGF蛋白水平；Ki67染色顯示OxyGel促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖7a、f）。最后在重塑階段，第14天膠原蛋白染色顯示OxyGel促進(jìn)膠原蛋白I沉積，減少膠原蛋白III（圖7a、g、h）。該團(tuán)隊(duì)還進(jìn)行了安全性評(píng)估，14天內(nèi)血液分析和主要器官H&E染色未發(fā)現(xiàn)OxyGel引起系統(tǒng)毒性或炎癥反應(yīng)。

圖7 用不同水凝膠治療的糖尿病足潰瘍傷口組織的免疫熒光染色。 a) 傷口組織 DCFH-DA、iNOS/Arg-1、CD31/α-SMA、Ki67、Col I 和 Col III 免疫熒光染色的代表性圖像。比例尺，300 μm。b) DCFH-DA、c) iNOS、d)Arg-1、e) CD31、f) Ki67、g) Col I 和 h) Col III 免疫熒光染色的定量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（n = 6）

（6）OxyGel噴霧促進(jìn)與加速糖尿病足潰瘍傷口愈合相關(guān)的信號(hào)通路的豐富

對(duì)OxyGel噴霧組和對(duì)照組大鼠傷口組織進(jìn)行RNA測(cè)序。主成分分析（PCA）顯示樣本具有高重復(fù)性和相關(guān)性（圖8a）。與對(duì)照組相比，OxyGel噴霧組有690個(gè)基因上調(diào)，521個(gè)基因下調(diào)，表明OxyGel通過(guò)清除過(guò)量ROS和持續(xù)供氧在調(diào)節(jié)DFU傷口修復(fù)中起重要作用（圖8b-d）。基因本體（GO）分析顯示，與免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、遷移、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組織和膠原代謝過(guò)程相關(guān)的通路顯著富集（圖8e），表明OxyGel噴霧具有抗炎、促增殖和膠原重塑活性，支持其在DFU治療中的潛力。此外，GO分析還顯示細(xì)胞因子活性、表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合和膠原結(jié)合等分子功能，以及細(xì)胞外基質(zhì)和黏著斑等細(xì)胞組分的富集（圖8f、g）。京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）分析揭示了11條與OxyGel噴霧促進(jìn)傷口愈合相關(guān)的信號(hào)通路，包括TNF信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路等（圖8h）?；蚣患治觯℅SEA）顯示，炎癥反應(yīng)和ROS代謝過(guò)程下調(diào)，而表皮細(xì)胞分化、表皮發(fā)育、角化和皮膚發(fā)育上調(diào)（圖8i-n）?？傮w而言，OxyGel噴霧促進(jìn)了與DFU傷口愈合相關(guān)的信號(hào)通路的富集。

圖8 糖尿病足潰瘍傷口組織轉(zhuǎn)錄組分析。a）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）。b）顯示上調(diào)（紅色）和下調(diào)（藍(lán)色）基因數(shù)量的直方圖。c）差異表達(dá)基因的火山圖。d）差異表達(dá)基因的熱圖。對(duì)OxyGel噴霧組差異表達(dá)基因的e）生物過(guò)程、f）分子功能和g）細(xì)胞成分進(jìn)行基因本體論（GO）富集分析。h）OxyGel噴霧組差異表達(dá)基因的KEGG富集分析。對(duì)i）炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，j）活性氧代謝過(guò)程，k）表皮細(xì)胞分化，l）表皮發(fā)育，m）角化，和n）皮膚發(fā)育進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）