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受人類皮膚保濕和保護功能的啟發(fā)，中山大學附屬第一醫(yī)院廖威明主任和華南理工大學張琨雨、邊黎明教授團隊開發(fā)了一種用于加速糖尿病足潰瘍（DFU）愈合的活性氧驅(qū)動的供氧水凝膠噴霧（OxyGel）。該噴霧結(jié)合了模擬超氧化物歧化酶（SOD）/過氧化氫酶（CAT）功能的納米酶和動態(tài)交聯(lián)的超分子水凝膠。通過唑來膦酸輔助組裝鈰離子并用單寧酸修飾，制備了具有級聯(lián)催化功能的納米酶（TCZ）。接著利用透明質(zhì)酸、去鐵胺修飾的β-環(huán)糊精和叔丁基苯乙酸修飾的透明質(zhì)酸，通過動態(tài)主客體相互作用和席夫堿鍵制備了可噴霧的OxyGel，并通過氫鍵錨定TCZ納米酶。OxyGel能有效改善氧化和缺氧微環(huán)境，促進M1型巨噬細胞向M2型極化，并增強體外內(nèi)皮細胞的存活、遷移和血管生成。在動物模型中，僅一次使用OxyGel噴霧即可顯著加快兩周內(nèi)的傷口愈合。該文章于2025年6月10日以《Nanozyme-Reinforced Hydrogel Spray as a Reactive Oxygen Species-Driven Oxygenator to Accelerate Diabetic Wound Healing》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202504829）。

圖1 納米酶增強水凝膠噴霧作為活性氧驅(qū)動的氧合器（OxyGel噴霧）加速糖尿病足部潰瘍傷口愈合的示意圖。a）TCZ納米酶的合成路線和級聯(lián)催化功能示意圖。b）OxyGel噴霧的制備工藝和交聯(lián)機制示意圖。c）OxyGel噴霧在糖尿病足部潰瘍治療中的作用機制

（1）TCZ 納米酶和可噴涂 OxyGel 的表征

構(gòu)建了一種納米酶增強型水凝膠噴霧。利用唑來膦酸介導鈰離子組裝形成CZ納米顆粒，再經(jīng)單寧酸修飾得到抗氧化的TCZ納米酶。透射電子顯微鏡（TEM）顯示TCZ納米酶為均勻球體，平均直徑100 nm，動態(tài)光散射（DLS）測得其流體動力學尺寸約為150 nm（圖2a、b）。TCZ納米酶的催化活性源于Ce³⁺/Ce⁴⁺的氧化還原循環(huán)，具有SOD和CAT類活性。實驗驗證了TCZ納米酶的酶模擬活性（圖2c），其對超氧陰離子（?O₂^-）的清除能力呈劑量依賴性增加，電子順磁共振（EPR）光譜進一步證實了其SOD模擬活性（圖2d）。TCZ納米酶催化H₂O₂分解產(chǎn)生氧氣的能力隨H₂O₂濃度增加而增強（圖2e）。在溶血實驗中，TCZ納米酶在鈰離子濃度高達500 μM時仍保持穩(wěn)定的血液相容性（圖2f）。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示OxyGel具有均勻、連通的多孔微觀結(jié)構(gòu)（圖2h）。動態(tài)流變測試表明，OxyGel具有典型的水凝膠行為，儲能模量（G’）高于損耗模量（G’’），且在75%應變下仍能保持完整并快速恢復（圖2i、j、k）。OxyGel在12 h內(nèi)達到膨脹平衡并保持穩(wěn)定（圖S10）。通過單噴頭噴霧，OxyGel可形成均勻且覆蓋面積大的完整薄膜（圖2l、圖S11、S12）。與傳統(tǒng)預制水凝膠和注射水凝膠相比，OxyGel噴霧使用更方便，可為暴露在空氣中的糖尿病傷口提供即時物理保護。OxyGel的pH響應性使其在酸性糖尿病傷口微環(huán)境中能夠智能調(diào)節(jié)TCZ納米酶的釋放速率（圖2m）。

圖2 TCZ 納米酶和可噴涂 OxyGel 的表征。 a) TCZ 納米酶的 TEM 圖像。b) 通過 DLS 測量 TCZ 納米酶的水化尺寸分布。c) TCZ 納米酶的 SOD 和 CAT 模擬活性示意圖。d) TCZ 納米酶的 SOD 和 e) CAT 模擬活性測量（n  = 3）。f) TCZ 納米酶的血液相容性（n  = 3）。插圖：溶血測試的數(shù)碼照片。g) OxyGel 的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。h) OxyGel 的 SEM 圖像。i) OxyGel 的時間和 j) 應變掃描測試。k) OxyGel 的流變學階躍應變振蕩時間掃描測量。l) 噴涂 OxyGel 后形成的即時水凝膠膜的照片。 m) 不同條件下（pH 5.5、6.5 和 7.4）TCZ 納米酶從 OxyGel 中釋放的概況（n = 3）

（2）OxyGel水凝膠誘導抗炎M2巨噬細胞極化并捕獲過量的ROS以促進氧合

在炎癥階段，通過脂多糖（LPS）刺激的巨噬細胞模型評估了OxyGel誘導M2型（抗炎）巨噬細胞極化的抗炎特性（圖3a）。實驗中還構(gòu)建了不含TCZ納米酶的空白水凝膠（Gel）作為對照。CCK-8實驗結(jié)果表明，Gel和OxyGel對巨噬細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）均具有良好的生物相容性。經(jīng)LPS刺激24小時后，與OxyGel共孵育的巨噬細胞中誘導型一氧化氮合酶（iNOS，M1標志物）熒光強度顯著降低，而精氨酸酶-1（Arg-1，M2標志物）熒光強度增加，表明OxyGel可顯著促進巨噬細胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)變（圖3b-e）。實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果高度一致（圖3f-i，圖S17、S18）。與LPS+PBS組相比，OxyGel組巨噬細胞中促炎介質(zhì)（如CD86、白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α）的mRNA表達水平降低，而抗炎介質(zhì)（如CD206、白細胞介素-10和CD163）的基因表達水平升高，顯示出OxyGel的顯著抗炎功能。

此外，鑒于OxyGel具有清除活性氧（ROS）和產(chǎn)生氧氣的雙重功能，實驗評估了其將LPS誘導的ROS轉(zhuǎn)化為氧氣的能力。通過將HUVECs與OxyGel共孵育，并使用經(jīng)典的ROS探針2′7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）和氧氣探針三（4,7-二苯基-1,10-菲咯啉）釕（II）二氯化物復合物[Ru(dpp)?Cl?]進行染色，觀察到OxyGel顯著降低了由LPS誘導的細胞內(nèi)ROS積累，熒光強度降低了約一倍（圖3j、k）。同時，由于細胞內(nèi)氧氣的生成，與OxyGel共培養(yǎng)的HUVECs中[Ru(dpp)?]Cl?的熒光信號顯著猝滅（圖3l、m）。這些結(jié)果證實了OxyGel能夠同時實現(xiàn)高效的ROS清除和持續(xù)的氧氣供應，突顯了其在糖尿病傷口愈合中的治療潛力。

圖3 具有ROS 清除和O2生成雙重功能的 OxyGel 可誘導巨噬細胞從 M1 復極化為 M2。a) 示意圖說明 OxyGel 對 LPS 刺激的巨噬細胞的抗炎作用。b) 和 c) 未經(jīng)或經(jīng)不同處理的巨噬細胞的免疫熒光染色。比例尺，50 μm。d) 巨噬細胞中的 iNOS 和 e) Arg-1 熒光強度（n = 20）。fi) 通過 RT-qPCR 分析評估的 M1 巨噬細胞標志物（CD86 和 IL-1β）和 M2 巨噬細胞標志物（CD206 和 IL-10）的 mRNA 水平（n = 3）。 jk) 使用 ROS 探針 (DCFH-DA) 測量 LPS 誘導的 ROS 清除功能。比例尺，200 μm。 lm)使用O2探針 [Ru(dpp)3Cl2 ]測量O2生成功能。紅色 Ru(dpp)3Cl2熒光被 O2猝滅( n  = 20)。比例尺，200 μm。數(shù)據(jù)以平均值±標準差 (SD) 表示；使用單因素方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 事后檢驗評估統(tǒng)計學差異；***0.0001 < p  < 0.001，和 **** p  < 0.0001

（3）OxyGel水凝膠保護體外增殖、遷移和血管生成免受氧化損傷

在增殖階段，研究了OxyGel對過氧化氫（H₂O₂）誘導的氧化應激下人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的保護作用（圖4a）。實驗建立了H₂O₂誘導的氧化損傷模型，結(jié)果表明OxyGel能清除細胞內(nèi)過量的ROS，使ROS水平恢復正常（圖4b、c）。通過EdU摻入實驗評估OxyGel在富含H₂O₂的微環(huán)境中對細胞增殖的保護作用H₂O₂+OxyGel組的EdU陽性細胞數(shù)量顯著增加，表明DNA合成增多（圖4d、e）。細胞增殖實驗結(jié)果與EdU實驗一致，H₂O₂+OxyGel組的細胞增殖率高于H₂O₂+PBS組，顯示出OxyGel對H₂O₂誘導的氧化損傷具有緩解作用（圖4f）。

通過劃痕實驗評估H₂O₂刺激下HUVECs的遷移能力（圖4g、h）。結(jié)果顯示，H₂O₂顯著抑制了HUVECs的遷移，而OxyGel能逆轉(zhuǎn)這一抑制作用。在管狀結(jié)構(gòu)形成實驗中，H₂O₂+OxyGel組的HUVECs在共培養(yǎng)6小時后，分支數(shù)量和總分支長度均顯著高于其他H₂O₂處理組，表明OxyGel具有促進血管生成的潛力。

圖4 OxyGel 促進H₂O₂誘導的氧化應激下 HUVEC 的增殖、遷移和血管生成。a) 示意圖說明 OxyGel 對受H₂O₂刺激的 HUVEC 的保護作用。b、c)通過 DCFH-DA 測量H₂O₂誘導的 OxyGel 的 ROS 清除能力 ( n =20)。比例尺，200 μm。de) HUVEC 中的免疫熒光圖像和 EdU 染色的量化 ( n =5)。比例尺，200 μm。f) 接受不同處理的 HUVEC 的細胞增殖測定 ( n =3)。g) 對接受不同處理的 HUVEC 在 0、12 和 24 小時進行的劃痕愈合試驗 (n=3)。比例尺，200 μm。 h) 體外劃痕實驗測定的傷口愈合率（n =3）。i) 不同處理后HUVEC的成管能力。比例尺：100 μm。j、k) 分支數(shù)量和總分支長度的量化（n  =3）

（4）OxyGel噴霧加速糖尿病全層背部皮膚傷口愈合

OxyGel具有良好的噴霧性、抗氧化能力、氧氣釋放和抗炎特性，有望用于糖尿病傷口愈合。實驗建立了鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠全層背皮膚缺損模型（直徑10 mm），評估OxyGel噴霧的愈合加速性能（圖5a）。對切口傷口分別進行一次Gel、OxyGel噴霧或商業(yè)水凝膠敷料（Hydrosorb）處理，未處理傷口作為對照。結(jié)果顯示，經(jīng)OxyGel噴霧處理的傷口在治療14天后愈合率顯著加快，接近100.00%，與其他組相比差異顯著（圖5b-e）。而Hydrosorb處理組在第14天的愈合率僅比對照組高約10.00%。

進一步對四組再生傷口組織樣本進行組織學分析，包括蘇木精-伊紅（H&E）染色和馬松染色（圖5f-j），評估傷口愈合參數(shù)，如瘢痕指數(shù)、表皮厚度和膠原比例。OxyGel噴霧組的瘢痕指數(shù)最低，表明其具有無瘢痕愈合的潛力（圖5g）。此外，該組傷口的表皮層最薄，有利于防止厚痂或瘢痕疙瘩形成（圖5h）。與對照組和Hydrosorb組相比，OxyGel噴霧組的膠原纖維排列更密集且有序，表明膠原沉積增強。

圖5 OxyGel 噴霧可加速大鼠糖尿病全層背部皮膚傷口愈合。 a) 體內(nèi)背部皮膚傷口（直徑 10 毫米）愈合研究的實驗時間表，單次給藥和評估超過 14 天。b) 不同治療方法后背部傷口愈合過程的代表性照片。c) 從第 0 天到第 14 天的傷口閉合痕跡。d、e) 傷口面積（mm 2）和傷口閉合率的定量分析（n =6）。f) H&E 染色，g) 疤痕指數(shù)，和 h) 第 14 天背部傷口組織的表皮厚度（n =6）。比例尺，300 μm。i) 第 14 天背部傷口組織的 Masson 染色和膠原體積分數(shù)（n =6）。比例尺，300 μm

（5）OxyGel噴霧調(diào)節(jié)傷口愈合過程的炎癥、增殖和重塑階段，加速難治性糖尿病足潰瘍傷口愈合

在全層背皮膚傷口愈合取得良好效果的基礎上，進一步評估了OxyGel噴霧對糖尿病大鼠難治性糖尿病足潰瘍（DFUs）的治療效果。與背皮膚傷口相比，DFUs的治療要求更高，因為足部是人體負重的主要部位，長期承受機械壓力、頻繁活動且血供較差。通過在糖尿病大鼠足背打孔建立直徑6 mm的圓形全層切口DFU模型（圖6a）。在治療期間，OxyGel噴霧處理組的傷口愈合速度最快，第14天時傷口面積僅為原始面積的3.33%，且外觀接近正常皮膚組織，無肥厚性或瘢痕疙瘩形成（圖6b-e）。相比之下，Hydrosorb和Gel組的傷口閉合不完全，愈合率不理想。組織病理學評估（H&E染色和馬松染色）顯示，OxyGel組的DFU傷口愈合明顯，瘢痕指數(shù)顯著降低，表皮層薄，膠原纖維形成增強，愈合效果良好（圖6f-j）。此外，OxyGel處理組的皮膚組織修復良好，傷口表面連續(xù)且完整，新生血管、毛囊和腺體密度高，表明DFU傷口愈合過程穩(wěn)健且平衡。

圖6 OxyGel 噴霧可加速大鼠糖尿病足部潰瘍傷口愈合。a) 體內(nèi)足部潰瘍傷口（直徑 6 毫米）愈合研究的實驗時間表，單次給藥和評估超過 14 天。b) 不同治療方法后足部潰瘍傷口愈合過程的代表性照片。c) 從第 0 天到第 14 天的傷口閉合痕跡。de) 傷口面積（mm 2）和傷口閉合率的定量分析（n = 6）。f) H&E 染色，g) 疤痕指數(shù)，和 h) 第 14 天足部潰瘍傷口組織的表皮厚度（n = 6）。比例尺，300 μm。i) 第 14 天足部潰瘍傷口組織的 Masson 染色和膠原體積分數(shù)（n = 6）。比例尺，300 μm

OxyGel在DFU傷口愈合的三個階段中表現(xiàn)出良好效果。在炎癥階段期間，第7天DCFH-DA染色顯示OxyGel顯著清除ROS（圖7a、b）；第14天iNOS/Arg-1染色表明OxyGel促進巨噬細胞從M1向M2極化（圖7a、c、d）。在增殖階段，第14天CD31和α-SMA共染色顯示OxyGel促進新生血管形成（圖7a、e）；Western blot顯示OxyGel上調(diào)HIF-1α和VEGF蛋白水平；Ki67染色顯示OxyGel促進細胞增殖（圖7a、f）。最后在重塑階段，第14天膠原蛋白染色顯示OxyGel促進膠原蛋白I沉積，減少膠原蛋白III（圖7a、g、h）。該團隊還進行了安全性評估，14天內(nèi)血液分析和主要器官H&E染色未發(fā)現(xiàn)OxyGel引起系統(tǒng)毒性或炎癥反應。

圖7 用不同水凝膠治療的糖尿病足潰瘍傷口組織的免疫熒光染色。 a) 傷口組織 DCFH-DA、iNOS/Arg-1、CD31/α-SMA、Ki67、Col I 和 Col III 免疫熒光染色的代表性圖像。比例尺，300 μm。b) DCFH-DA、c) iNOS、d)Arg-1、e) CD31、f) Ki67、g) Col I 和 h) Col III 免疫熒光染色的定量統(tǒng)計數(shù)據(jù)（n = 6）

（6）OxyGel噴霧促進與加速糖尿病足潰瘍傷口愈合相關(guān)的信號通路的豐富

對OxyGel噴霧組和對照組大鼠傷口組織進行RNA測序。主成分分析（PCA）顯示樣本具有高重復性和相關(guān)性（圖8a）。與對照組相比，OxyGel噴霧組有690個基因上調(diào)，521個基因下調(diào)，表明OxyGel通過清除過量ROS和持續(xù)供氧在調(diào)節(jié)DFU傷口修復中起重要作用（圖8b-d）?；虮倔w（GO）分析顯示，與免疫反應、細胞增殖、遷移、血管生成、細胞外基質(zhì)（ECM）組織和膠原代謝過程相關(guān)的通路顯著富集（圖8e），表明OxyGel噴霧具有抗炎、促增殖和膠原重塑活性，支持其在DFU治療中的潛力。此外，GO分析還顯示細胞因子活性、表皮生長因子受體結(jié)合和膠原結(jié)合等分子功能，以及細胞外基質(zhì)和黏著斑等細胞組分的富集（圖8f、g）。京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析揭示了11條與OxyGel噴霧促進傷口愈合相關(guān)的信號通路，包括TNF信號通路、PPAR信號通路等（圖8h）?；蚣患治觯℅SEA）顯示，炎癥反應和ROS代謝過程下調(diào)，而表皮細胞分化、表皮發(fā)育、角化和皮膚發(fā)育上調(diào)（圖8i-n）。總體而言，OxyGel噴霧促進了與DFU傷口愈合相關(guān)的信號通路的富集。

圖8 糖尿病足潰瘍傷口組織轉(zhuǎn)錄組分析。a）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）。b）顯示上調(diào)（紅色）和下調(diào)（藍色）基因數(shù)量的直方圖。c）差異表達基因的火山圖。d）差異表達基因的熱圖。對OxyGel噴霧組差異表達基因的e）生物過程、f）分子功能和g）細胞成分進行基因本體論（GO）富集分析。h）OxyGel噴霧組差異表達基因的KEGG富集分析。對i）炎癥反應的調(diào)節(jié)，j）活性氧代謝過程，k）表皮細胞分化，l）表皮發(fā)育，m）角化，和n）皮膚發(fā)育進行基因集富集分析（GSEA）