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針對(duì)上述問(wèn)題，中國(guó)藥科大學(xué)丁楊、張華清、周建平等人開(kāi)發(fā)的生物模擬彈性壓縮組裝體，以溫敏性聚合物為基質(zhì)，將疏水性姜黃素加載到超小CeO?納米酶上，經(jīng)PDA外殼和apoA-I修飾，實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)靶向遞送和ROS觸發(fā)的藥物爆發(fā)釋放。在AD病變部位，該組裝體能快速釋放Cur和PCeO?，Cur可高濃度將Aβ激活型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎顟B(tài)并增強(qiáng)其吞噬功能，CeO?持續(xù)抗氧化防止小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體在吞噬Aβ后受損。相關(guān)成果2025年4月30日發(fā)表于《Science Advances》。（DOI：10.1126/sciadv.adr0656）。

圖1 研究示意圖

（1）生物模擬組裝的彈性壓縮和擴(kuò)散的制備和表征

合成溫敏性聚合物pNIPAAm-co-pAAm，其低臨界溶液溫度（LCST）為41℃。在LCST時(shí)，聚合物鏈被壓縮，疏水區(qū)域在CeO?核上形成聚合物殼（圖2A）。熱收縮過(guò)程在37℃和41℃之間可逆（圖2B）。為減少藥物泄漏，設(shè)計(jì)PDA自聚合熱封Cur負(fù)載的PCeO?，形成PPCeO?/Cur，尺寸從約28 nm增至約51 nm（圖2C）。通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)，將apoA-I接枝到PPCeO?/Cur表面，形成APPCeO?/Cur，尺寸約62 nm，在含10%血清的PBS中穩(wěn)定性更好（圖2C和D）。穿過(guò)血腦屏障后，APPCeO?/Cur的PDA外殼會(huì)被ROS特異性降解，使PPCeO?核心伸展彈性聚合物鏈實(shí)現(xiàn)快速藥物釋放。制備不同厚度的APPCeO?/Cur納米顆粒，發(fā)現(xiàn)9 nm外殼的Cur釋放速度比16 nm的更快（圖2E）。具有9 nm外殼的APPCeO?/Cur納米顆粒在0.1 mM H?O?中孵育時(shí)，粒徑在最初2小時(shí)內(nèi)略有減小且分布均勻，8小時(shí)后粒徑分布分為三部分（圖2F）。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，APPCeO?/Cur在H?O?中孵育8小時(shí)后，殼核結(jié)構(gòu)解聚成碎片形態(tài)（圖2G和H）。

圖2 APPCeO?/Cur的表征。（a）CeO?和PCeO?在37°和41°C時(shí)的粒徑分布；（b）CeO?和PCeO?在循環(huán)加熱和冷卻過(guò)程中的尺寸變化（n=3）；（c）PCeO?、PPCeO?/Cur和APPCeO?/Cur的粒徑分布；（d）PPCeO?/Cur和APPCeO?/Cur在含10%血清的介質(zhì)中的粒徑變化（n=3）；（e）不同厚度的APPCeO?/Cur在H?O?（0.1 mM）或PBS（pH 7.4，0.01 M）中的Cur釋放曲線（n=3）；（f）在1、2和8小時(shí)內(nèi)用H?O?（0.1 mM）處理的APPCeO?/Cur的粒徑分布；（g）APPCeO?/Cur的TEM圖像；（h）用0.1 mM H?O?處理的APPCeO?/Cur的TEM圖像；（i）APPCeO?/Cur的BBB跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率（n=3），單因素方差分析結(jié)合Tukey-Kramer事后檢驗(yàn)；（j）用Cy5標(biāo)記的APPCeO?/Cur和BPPCeO?/Cur治療的AD小鼠的代表性圖像；（k）用Cy5標(biāo)記的APPCeO?/Cur和BPPCeO?/Cur治療的腦切片的代表性熒光圖像

（2）生物啟發(fā)的血腦屏障穿透和腦內(nèi)蓄積

ApoA-I可介導(dǎo)HDL高效遞送至大腦。圖2I顯示，F(xiàn)-APPCeO?/Cur的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率約為20.9%，是F-BPPCeO?/Cur組（約4.7%）的4.4倍，表明ApoA-I修飾可促進(jìn)APPCeO?/Cur穿越血腦屏障。為研究血腦屏障轉(zhuǎn)胞吞能力和腦內(nèi)蓄積，將Cy5標(biāo)記的ApoA-I和BSA偶聯(lián)到PPCeO?/Cur上，得到Cy5-APPCeO?/Cur和Cy5-BPPCeO?/Cur，并給予AD模型小鼠，進(jìn)行活體熒光成像（圖2J）。結(jié)果顯示，Cy5-APPCeO?/Cur在腦區(qū)有強(qiáng)熒光信號(hào)，而Cy5-BPPCeO?/Cur熒光微弱且隨時(shí)間幾乎不變。腦切片熒光成像（圖2K）顯示，Cy5-APPCeO?/Cur組中，納米顆粒與Aβ斑塊分布區(qū)域顯著重疊，尤其在大腦皮層和海馬區(qū)。

（3）通過(guò)爆發(fā)式藥物釋放實(shí)現(xiàn)微膠球狀態(tài)轉(zhuǎn)換

Cur以濃度依賴性方式使小膠質(zhì)細(xì)胞正?；?，設(shè)計(jì)爆發(fā)式藥物釋放機(jī)制對(duì)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)至關(guān)重要（圖3A）。模擬AD腦中ROS觸發(fā)的爆發(fā)釋放，不同濃度Cur的APPCeO?/Cur被0.1 mM H?O?預(yù)處理后與Aβ激活的膠質(zhì)共孵育。CD206用于標(biāo)記歸一化的膠質(zhì)（圖3B）。在PCeO?、PPCeO?和APPCeO?處理組中，CD206表達(dá)無(wú)顯著影響。低劑量（1 μg/ml，L）或中劑量（5 μg/ml，M）Cur的APPCeO?/Cur處理組中，CD80水平略有下降，CD206表達(dá)增加。高濃度（10 μg/ml，H）Cur的APPCeO?/Cur處理組中，CD206表達(dá)顯著增加，CD80下降。定量分析顯示，Aβ激活的小膠質(zhì)細(xì)胞（CD80?）比例從3.7%降至23.6%，正常小膠質(zhì)細(xì)胞（CD206?）比例從3.7%增至18.7%，在APPCeO?/Cur (H) (Pre-H?O?)組中增加五倍。高劑量Cur高效調(diào)節(jié)Aβ激活的小膠質(zhì)細(xì)胞至正常小膠質(zhì)細(xì)胞。

使用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的促炎因子，不同組的條件培養(yǎng)基用于與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育（圖3C）。如圖3D，隨著Cur濃度增加，APPCeO?/Cur (L)–、APPCeO?/Cur (M)–和APPCeO?/Cur (H)–處理組的促炎細(xì)胞因子水平依次降低，抗炎因子IL-4、TGF-β和IL-10水平分別增加60.8%、80.2%和98.2%。細(xì)胞因子分泌趨勢(shì)與小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變一致，證實(shí)表型轉(zhuǎn)變減輕炎癥反應(yīng)。如圖3E，與PBS組條件培養(yǎng)液共培養(yǎng)后，SH-SY5Y細(xì)胞活力降至52.0%，表明Aβ毒性和炎癥因子加劇神經(jīng)元損傷。PCeO?、PPCeO?和APPCeO?組條件培養(yǎng)液孵育的SH-SY5Y細(xì)胞存活率高于PBS組。小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)調(diào)控改善炎癥微環(huán)境并恢復(fù)神經(jīng)元損傷。此外，表型調(diào)控后小膠質(zhì)細(xì)胞的Aβ吞噬能力增強(qiáng)，APPCeO?/Cur (H) (Pre-H?O?)表現(xiàn)出更高的Aβ細(xì)胞內(nèi)化效率（圖3F）。

圖3 巨噬細(xì)胞受曲美他嗪調(diào)節(jié)的表征。（a）巨噬細(xì)胞受曲美他嗪爆發(fā)式釋放調(diào)節(jié)的示意圖；（b）巨噬細(xì)胞與不同濃度的曲美他嗪納米顆粒孵育48小時(shí)后，Aβ激活巨噬細(xì)胞生物標(biāo)志物CD80和正常巨噬細(xì)胞生物標(biāo)志物CD206的表達(dá)；（c）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖，包括炎癥細(xì)胞因子分析和SH-SY5Y條件培養(yǎng)；（d）通過(guò)ELISA檢測(cè)BV-2細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）和抗炎細(xì)胞因子（如IL-4、IL-10和TGF-β）的水平（n=3）；（e）炎癥改善后的神經(jīng)保護(hù)作用（n=6）；（f）不同制劑處理后Aβ激活巨噬細(xì)胞的Aβ細(xì)胞攝取效率（n=3）

（4）分解Aβ斑塊以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的Aβ清除

Aβ的親和力是Aβ捕獲和去聚合的基礎(chǔ)。分子建模實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)接計(jì)算和分析聚合物在PCeO?表面上的單元與Aβ肽的氨基酸殘基之間的相互作用，表明Aβ被結(jié)合在Aβ單體的螺旋結(jié)構(gòu)、寡聚物和纖維的β片結(jié)構(gòu)中的聚合物片段上。圖4A顯示了對(duì)接聚合物鏈的50個(gè)構(gòu)象中最好的對(duì)接分?jǐn)?shù)。PCeO?裝配對(duì)Aβ單體和寡聚體的結(jié)合親和力顯著增加，親和力值分別為5.12×10??和3.03×10??M（圖4B）。使用ThT檢查PCeO?對(duì)Aβ纖維素的解聚作用，圖4C顯示PBS組因Aβ纖維素中豐富的β折疊結(jié)構(gòu)顯示出最大的ThT熒光，而PCeO?組熒光強(qiáng)度顯著降低（約33%），僅用聚合物處理的組降低了17%，驗(yàn)證了聚合物在Aβ斑塊中的解聚能力及PCeO?的多價(jià)結(jié)合可加速Aβ斑塊分解。

為探索PCeO?引起的斑塊解聚是否會(huì)減弱“揚(yáng)塵”效應(yīng)，應(yīng)用膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡（圖4D）。Aβ寡聚體組凋亡率為49.98%，Aβ纖維組凋亡率為37.01%。而用PCeO?處理的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率分別降至4.11%和4.02%，表明PCeO?能有效防止由“揚(yáng)塵”效應(yīng)引起的神經(jīng)元凋亡。為研究促進(jìn)Aβ解聚后PCeO?的Aβ清除效果，檢測(cè)了Aβ攝取能力。圖4E顯示，即使在PCeO?幫助下有更多Aβ????內(nèi)吞到小膠質(zhì)細(xì)胞中，仍檢測(cè)到最低的細(xì)胞內(nèi)Aβ????水平。共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)一步探索Aβ的降解過(guò)程，與PCeO?共孵育的FAM-Aβ在細(xì)胞膜上熒光弱，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)，且FAM-Aβ與溶酶體共定位，證實(shí)PCeO?通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞的溶酶體網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)Aβ降解。

圖4 APPCeO?/Cur促進(jìn)Aβ斑塊解聚和清除的表征。（a）APPCeO?/Cur促進(jìn)Aβ斑塊解聚和清除的方案，聚合物鏈與Aβ肽的疏水和親水殘基相結(jié)合；（b）SPR測(cè)定PCeO?和釋放的PCeO?與Aβ單體（或寡聚體）的結(jié)合親和力；（c）采用ThT熒光測(cè)定法監(jiān)測(cè)Aβ沉積物的解聚（n=6）；（d）流式細(xì)胞術(shù)分析多種制劑處理后的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡分析；（e）ELISA檢測(cè)多種制劑處理后小膠質(zhì)細(xì)胞中的Aβ含量（n=3）；（f）4小時(shí)后不同制劑處理后的BV-2細(xì)胞中FAM-Aβ的代表性圖像，釋放的PCeO?代表H?O?預(yù)處理和通過(guò)超濾離心去除Cur

（5）消除活性氧和預(yù)防線粒體損傷

Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生過(guò)多ROS，導(dǎo)致線粒體功能障礙，減弱吞噬和降解能力。APPCeO?/Cur組裝體釋放的CeO?納米酶通過(guò)Ce3?和Ce??原子的電子轉(zhuǎn)移消除ROS（圖5A）。XPS分析顯示，PCeO?的Ce3?組分在聚合物配位改性后幾乎不變，且在H?O?耗盡后可恢復(fù)還原態(tài)，表明其抗氧化特性不受影響（圖5B和C）。DCFH探針檢測(cè)結(jié)果顯示，與PCeO?組孵育的熒光強(qiáng)度最弱，與CeO?組相同，表明ROS清除效果顯著（圖5D）。細(xì)胞水平上，Aβ刺激的BV-2細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)綠色熒光，而CeO?組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光減少，ROS水平比PBS組降低55.6%（圖5E和F）。JC-1檢測(cè)顯示，CeO?處理后BV-2細(xì)胞線粒體膜電位恢復(fù)，紅綠熒光比增加到2.7，表明CeO?通過(guò)清除ROS阻止膜電位去極化（圖5G）。

圖5 CeO?的ROS清除及線粒體保護(hù)表征。（a）CeO?在組裝和線粒體保護(hù)中的ROS清除示意圖；（b）Ce 3d軌道的XPS分析顯示Ce3?（陰影）和Ce??的結(jié)合能水平，A.U.為任意單位；（c）Ce3?在CeO?表面的百分比定量；（d）用于展示CeO?在ROS清除中的酶活性的熒光強(qiáng)度（n=3）；（e）Aβ刺激的BV-2細(xì)胞在用不同制備物孵育后的細(xì)胞內(nèi)ROS水平分析（n=3）；（f）不同制備物孵育后Aβ刺激的BV-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的代表性圖像；（g）Aβ存在和不同制備物處理下BV-2細(xì)胞的線粒體膜電位。PCeO?（Pre-H?O?）和PCeO?（H?O?耗竭）分別指H?O?預(yù)處理和H?O?耗竭5天后的情況，釋放的PCeO?代表H?O?預(yù)處理和通過(guò)超濾離心去除Cur

（6）恢復(fù)AD小鼠模型的記憶障礙和認(rèn)知缺陷

選擇8個(gè)月大的APPswe/PSEN1dE9（C57BL/6）轉(zhuǎn)基因小鼠，存在認(rèn)知障礙和早期淀粉樣病變。動(dòng)物每3天靜脈注射給予APPCeO?/Cur（曲酸劑量5 mg/kg）、PCeO?和APPCeO?（相當(dāng)于CeO?濃度），持續(xù)4周（圖6A）。用莫里斯水迷宮（MWM）和筑巢行為實(shí)驗(yàn)評(píng)估空間學(xué)習(xí)和記憶性能改善效果。圖6B顯示，APPCeO?治療的AD小鼠逃避潛伏期時(shí)間比PCeO?治療小鼠減少26.84秒，目標(biāo)象限百分比時(shí)間和平臺(tái)穿越次數(shù)更多（圖6C），表明APPCeO?組裝體因高效BBB滲透和ROS清除改善動(dòng)物記憶和認(rèn)知。觀察AD小鼠筑巢行為評(píng)估海馬功能，圖6D顯示APPCeO?/Cur治療組AD小鼠筑巢能力積極，巢中有組織碎片。圖6E顯示，APPCeO?/Cur治療的AD小鼠得分略低于野生型小鼠，顯著高于生理鹽水治療的小鼠，進(jìn)一步證實(shí)APPCeO?/Cur可減輕AD小鼠模型中的認(rèn)知和記憶缺陷。

圖6 藥物給藥及治療效果評(píng)估。（a）藥物給藥時(shí)間進(jìn)程和治療效果評(píng)估；（b）野生型和阿爾茨海默病小鼠在注射生理鹽水、PCeO?、APPCeO?和APPCeO?/Cur后的逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留百分比和穿越平臺(tái)的次數(shù)（n=16）；（c）小鼠在Morris水迷宮中的典型路徑追蹤圖；（d）小鼠筑巢行為的典型圖像；（e）筑巢行為評(píng)分（n=16）

（7）恢復(fù)小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙和改善炎癥微環(huán)境，降低淀粉樣蛋白病理和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)

為證明APPCeO?/Cur組裝在小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)中的作用，分析了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)的免疫熒光圖像。圖7A顯示，APPCeO?/Cur處理時(shí)，CD80熒光強(qiáng)度減弱，CD206熒光強(qiáng)度升高（CD206陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞增加到45.4%），表明APPCeO?/Cur組裝可有效逆轉(zhuǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)。圖7B顯示，接受APPCeO?治療的AD小鼠中TNF-α和IL-1β水平下降，抗炎細(xì)胞因子變化較小。進(jìn)一步探索不同治療的AD小鼠中Aβ水平，結(jié)果表明AD組和PCeO?組Aβ水平相似（圖7C和D），APPCeO?組Aβ水平顯著降低。為闡明小膠質(zhì)細(xì)胞捕獲和Aβ降解過(guò)程，進(jìn)行了免疫熒光分析。圖7E和F顯示，與浸潤(rùn)在Aβ斑塊附近的小膠質(zhì)細(xì)胞（紅色）及APPCeO?處理小鼠中CD68吞噬體分布相比，APPCeO?/Cur治療顯著瓦解Aβ斑塊，通過(guò)上調(diào)CD68表達(dá)和改善小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙實(shí)現(xiàn)。結(jié)果表明，模擬APPCeO?/Cur組裝的apoA-I可同時(shí)釋放Cur和PCeO?治療元素，分別重新調(diào)整小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙和促進(jìn)Aβ清除，共同改善研究小鼠的AD病理。

圖7 小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)及Aβ水平的檢測(cè)。（A）不同配方處理后海馬中CD80和CD206的免疫染色，綠色為CD80或CD206抗體染色的Aβ激活或正常小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記，紅色為Iba-1染色的小膠質(zhì)細(xì)胞，藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核，標(biāo)尺100μm；（B）不同制劑處理的腦中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10和TGF-β水平由ELISA試劑盒測(cè)定（n=3）；（C）不同配方處理4周后小鼠海馬中Aβ斑塊的免疫染色，綠色為6E10抗體染色的Aβ，藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核，標(biāo)尺100μm；（D）不同配方處理下正常和AD小鼠腦中Aβ水平的免疫熒光染色定量分析（n=3）；（E）不同制劑處理后小膠質(zhì)細(xì)胞中Aβ吞噬的代表性圖像，綠色為CD68抗體染色的吞噬體，紅色為Iba-1染色的小膠質(zhì)細(xì)胞，紫色為6E10抗體染色的Aβ，標(biāo)尺20μm；（F）吞噬體定量（n=3）；（G）不同制劑處理后海馬區(qū)的HE和尼氏染色代表性圖像

（8）改善神經(jīng)元損傷

為評(píng)估各種制劑改善神經(jīng)元損傷的療效，進(jìn)行了尼氏染色和蘇木精 - 伊紅（HE）染色以監(jiān)測(cè)腦中受損神經(jīng)元。圖7G和圖S34、S35顯示，APPCeO?/Cur治療組受損神經(jīng)元有所改善，PPCeO?治療組未呈現(xiàn)明顯改善，表明Cur調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙對(duì)神經(jīng)疾病恢復(fù)和神經(jīng)損失至關(guān)重要。PPCeO?/Cur治療后，AD小鼠海馬體和皮質(zhì)中的神經(jīng)元萎縮、核固縮和細(xì)胞質(zhì)濃縮均顯著改善。