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研究背景：

針對上述問題，北京大學(xué)第三醫(yī)院韓洪斌團隊基于由聚合物PC6AB與磷酸錳離子聚合物（MnP）組成的有機-無機共聚物，開發(fā)了一種腫瘤微環(huán)境（TME）響應(yīng)性納米激動劑。納米激動劑在酸性TME中的降解使其能夠分別向腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞進行時空控制遞送。具有膜溶解活性的PC6AB選擇性地與腫瘤細(xì)胞膜相互作用以誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡，而錳金屬可以激活免疫細(xì)胞中的STING通路并觸發(fā)下游免疫刺激信號。納米激動劑在腦細(xì)胞外空間（ECS）局部注射后可以刺激強大的抗腫瘤免疫，在鼠膠質(zhì)瘤中顯示出顯著的治療效果。納米激動劑能夠響應(yīng)TME并實現(xiàn)STING激活的時空協(xié)調(diào)，增強對“冷”實體瘤的免疫反應(yīng)，為臨床免疫治療提供了一種有前景的方法。該文章于2025年4月29日以《Smart Organic–Inorganic Copolymer Nanoparticles Distinguish Between Microglia and Cancer Cells for Synergistic Immunotherapy in Glioma》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202500882）。

研究示意圖

（1）納米配體的構(gòu)建與表征

MnP通過將錳離子和磷酸溶解在乙醇中，使用三甲胺（TEA）作為端帽劑制備，形成離子寡聚物而非磷酸錳結(jié)晶（圖1a）。MnP的電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）顯示其以聚合狀態(tài)存在（圖1c）。粉末X射線衍射（XRD）表明MnP為非晶態(tài)（圖1d）。MnP可與有機聚合物共聚形成復(fù)合材料，提高負(fù)載效率和穩(wěn)定性，減少毒性。

PC6AB聚合物由聚（環(huán)氧乙烷）（PEO）片段和含有C6A、Bn和氨基乙基（AMA）甲基丙烯酸酯單體合成，其氨基可通過氫鍵與MnP偶聯(lián)（圖S5）。PC6AB-MnP的雜化通過將MnP加入PC6AB溶液中實現(xiàn)（圖1e）。凝膠滲透色譜法（GPC）測得PC6AB-MnP的重量平均分子量為25.1 kDa。ATR-FTIR顯示PC6AB與MnP間形成氫鍵（圖1f）。拉曼光譜進一步確認(rèn)了這種氫鍵介導(dǎo)的相互作用（圖1g）。粉末XRD和差示掃描量熱法（DSC）分析表明形成了新的配位復(fù)合物（圖1h、圖1i）。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示了無機寡聚物和有機聚合物的融合（圖1j）。

通過自組裝制備兩種納米顆粒：NP（純PC6AB聚合物）和NP-MnP（與MnP偶聯(lián)的PC6AB聚合物）。ICP-OES測得NP-MnP中MnP的包封效率為86.1%（圖1k）。元素映射證實了NP-MnP中存在錳、氮和氧元素（圖1l）。透射電子顯微鏡（TEM）顯示NP-MnP和NP在pH 7.4時具有球形形態(tài)。納米顆粒在低pH下降解導(dǎo)致熒光發(fā)射顯著增加，不同pH下溶液的近紅外一區(qū)（NIRI）顯示出明顯的熒光轉(zhuǎn)變（圖1m）。MnP作為T1加權(quán)MRI的造影劑，最佳成像濃度約為0.25–1.00 mm（圖1n）。圖1o顯示MnP-NP的MRI具有pH依賴性，隨著pH值降低，信號強度增加。體外MRI和NIRI研究證實了納米顆粒的酸響應(yīng)特性，MnP-NP可用作酸增強熒光/磁性成像探針。

圖1 NP-MnP的表征。（a）MnP寡聚物封端策略及反應(yīng)條件示意圖；（b）MnP的TEM圖像，展示形態(tài)細(xì)節(jié)；（c）MnP的質(zhì)量光譜；（d）MnP和Mn?(PO?)?的XRD圖譜；（e）PC6AB-MnP雜化分子結(jié)構(gòu)示意圖；（f）MnP、PC6AB和PC6AB-MnP的ATR-FTIR光譜；（g）MnP、PC6AB和PC6AB-MnP的拉曼光譜；（h）MnP、PC6AB和PC6AB-MnP的XRD圖譜；（i）MnP、PC6AB和PC6AB-MnP的DSC圖譜；（j）MnP、PC6AB和PC6AB-MnP的SEM圖像，紅色圓圈標(biāo)示聚集的MnP；（k）MnP、NP和MnP-NP的zeta電位，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）；（l）NP-MnP的元素分布圖；（m）NP-MnP在pH 6.4、6.8、7.0、7.2和7.4時的近紅外光譜；（n）MnP在不同濃度下的T1加權(quán)MRI；（o）NP-MnP在pH 6.4、6.8、7.0、7.2和7.4下的T1加權(quán)MRI

（2）pH依賴性納米激動劑的膜溶解選擇性

PC6AB可在酸性腫瘤微環(huán)境中選擇性破壞質(zhì)膜，在正常組織中毒性小。在生理pH環(huán)境中，PC6AB自組裝成中性納米顆粒，膜裂解模塊被屏蔽，膜溶解活性?。ā癘FF”狀態(tài)）。在酸性腫瘤微環(huán)境中，NP-MnP通過質(zhì)子化激活膜裂解模塊，與腫瘤細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的特異性識別。實驗表明，在pH 7.4時，NP-MnP對GL261細(xì)胞和BV2細(xì)胞毒性小（圖2a,b）。在pH 6.8時，NP-MnP對GL261細(xì)胞毒性顯著高于BV2細(xì)胞，表現(xiàn)出劑量和時間依賴性（圖2c,d）。SEM和TEM結(jié)果顯示，在pH 6.8時，NP-MnP使GL261細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞和細(xì)胞內(nèi)容物釋放，而BV2細(xì)胞膜無明顯變化（圖2e,f）。CLSM觀察到，在pH 6.8時，NP-MnP-Cy5使GL261細(xì)胞腫脹、膜完整性受損，而BV2細(xì)胞形態(tài)和膜完整性不受影響（圖2g,h）。脂質(zhì)體實驗表明，在pH 6.8時，模擬腫瘤細(xì)胞膜的脂質(zhì)體與NP-MnP孵育后熒光斑點顯著減少，表明膜破裂和染料泄漏，而模擬正常細(xì)胞膜的脂質(zhì)體無明顯變化（圖2i-k）。這些結(jié)果證實了NP-MnP對腫瘤細(xì)胞膜的靶向破壞和膜溶解選擇性。

圖2 NP-MnP的pH依賴性膜溶解選擇性。（a）NP-MnP對GL261細(xì)胞和BV2細(xì)胞在pH 7.4下孵育1小時后的濃度依賴性細(xì)胞毒性；（b）NP-MnP對GL261細(xì)胞和BV2細(xì)胞在pH 7.4、濃度為25μg mL?1下的時間依賴性細(xì)胞毒性；（c）NP-MnP對GL261細(xì)胞和BV2細(xì)胞在pH 6.8下孵育1小時后的濃度依賴性細(xì)胞毒性；（d）NP-MnP對GL261細(xì)胞和BV2細(xì)胞在pH 6.8、濃度為25μg mL?1下的時間依賴性細(xì)胞毒性；（e）GL261細(xì)胞和BV2細(xì)胞在pH 7.4或6.8、用NP-MnP（50μg mL?1）處理1小時后的SEM圖像；（f）GL261細(xì)胞和BV2細(xì)胞在pH 7.4或6.8、用NP-MnP（50μg mL?1）處理1小時后的TEM圖像；（g）GL261細(xì)胞在pH 6.8、用NP-MnP-Cy5（50μg mL?1）在不同時間點（0和1小時）處理后的圖像；（h）BV2細(xì)胞在pH 6.8、用NP-MnP-Cy5（50μg mL?1）在不同時間點（0和1小時）處理后的圖像；（i）用于模擬不同細(xì)胞膜的脂質(zhì)體模型示意圖，NP-MnP的膜溶解活性通過觀察脂質(zhì)體在添加NP-MnP前后的熒光變化來評估；（j）在pH 7.4或6.8條件下添加NP-MnP后，正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜模擬脂質(zhì)體的圖像；（k）確定每個視野的斑點計數(shù)并用于統(tǒng)計分析（n=3個視野）

（3）體外激活STING通路

免疫療法改變了癌癥治療，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤因免疫功能受損而高度免疫抑制。由錳和STING激動劑組成的納米激動劑可提高膠質(zhì)瘤抗腫瘤療效，解決STING激動劑的降解和脫靶毒性問題。錳是cGAS-STING途徑的激活劑。實驗表明，MnP比MnCl?更能上調(diào)P-TBK1、P-IRF3和P-STING的表達(dá)水平，且STING表達(dá)下降表明其磷酸化（圖3a）。免疫熒光觀察到MnP比MnCl?更強地激活STING途徑（圖3b）。細(xì)胞毒性實驗顯示MnP在有效濃度范圍內(nèi)對GL261細(xì)胞和BV2細(xì)胞無明顯毒性（圖3c）。全基因組RNA測序分析顯示，MnP處理的細(xì)胞與對照組相比有492個差異表達(dá)基因，其中229個上調(diào)，263個下調(diào)（圖3d）。熱圖顯示MnP處理的細(xì)胞中Ifnb1、Isg15和Cxcl10等基因上調(diào)（圖3e），表明MnP通過誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生刺激免疫激活。

圖3.MnP激活了cGAS-STING通路，并在體外促進了納米激動劑的細(xì)胞內(nèi)攝取。（a）經(jīng)MnCl?或MnP處理后，STING通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的濃度依賴性變化，通過蛋白質(zhì)印跡分析確定；（b）治療后P-STING表達(dá)的CLSM圖像；（c）MnP對GL261細(xì)胞和BV2細(xì)胞的濃度依賴性細(xì)胞毒性，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3），統(tǒng)計分析采用雙因素方差分析，P值大于0.05表示無顯著差異；（d）火山圖顯示PBS處理組和MnP處理組之間的差異表達(dá)基因；（e）PBS和MnP處理細(xì)胞的基因表達(dá)熱圖；（f）在pH 7.4條件下，NP-MnP或NP+MnP在孵育1小時后的濃度依賴性細(xì)胞毒性（NP-MnP：由共聚化的PC6AB-MnP自組裝形成的納米顆粒，NP+MnP：由PC6AB自組裝形成的納米顆粒，添加等量的MnP）；（g）NP-MnP-Cy5在BV2細(xì)胞中濃度依賴性攝取的代表性流式細(xì)胞術(shù)圖譜；（h）NP-MnP-Cy5在BV2細(xì)胞中濃度依賴性攝取的半定量；（i）BV2細(xì)胞與NP-MnP-Cy5孵育的代表性CLSM圖像；（j）通過ICP-MS測量了用NP-MnP（10、25和50μg mL?1）處理的GL261和BV2細(xì)胞內(nèi)的錳（Mn）攝取量

Mn2?可在磷酸鹽溶液中刺激免疫反應(yīng)，但在生理鹽水中無效，且易聚集沉淀失去佐劑活性。為解決此問題，用Mn2?、磷酸鹽和TEA合成了MnP，TEA的加入穩(wěn)定了磷酸錳，增強了其激活STING通路的有效性，且MnP的納米顆粒結(jié)構(gòu)提高了細(xì)胞攝取效率，與MnCl?相比，STING通路激活更有效。實驗顯示，添加MnP的納米顆粒細(xì)胞毒性更高（圖3f），而MnP與有機聚合物聚合形成的納米顆粒在生理環(huán)境下包封在疏水核中，表現(xiàn)出低毒性。

納米激動劑在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞上的細(xì)胞內(nèi)遞送和免疫刺激作用研究表明，BV2細(xì)胞對NP-MnP-Cy5的攝取呈濃度依賴性（圖3g,h）。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）監(jiān)測到顯著的細(xì)胞內(nèi)內(nèi)化（圖3i）。電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測量結(jié)果顯示，BV2細(xì)胞比GL261細(xì)胞吸收了更多的錳，且隨時間趨勢更明顯（圖3j）。分析認(rèn)為，BV2細(xì)胞中錳含量較高是PC6AB治療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的結(jié)果，而非MnP對免疫細(xì)胞的固有特異性。腫瘤細(xì)胞死亡后，免疫細(xì)胞被招募到腫瘤部位攝取MnP以增強免疫激活，且腫瘤細(xì)胞對MnP的攝取也可觸發(fā)免疫激活反應(yīng)，P-STING蛋白水平上調(diào)表明MnP激活了腫瘤細(xì)胞中的STING通路。

開環(huán)-無機共聚反應(yīng)制備的含有錳和STING激動劑ADU-S100的納米顆粒（NP-MnP-ADU）與免疫細(xì)胞中的cGAS形成復(fù)合物，產(chǎn)生強烈的抗癌免疫反應(yīng)（圖4a）。免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡觀察到與NP-MnP-ADU共培養(yǎng)的細(xì)胞中P-TBK1、P-IRF3和P-STING的上調(diào)表達(dá)（圖4b）。Western blot數(shù)據(jù)顯示，NP-MnP-ADU處理的BV2細(xì)胞中cGAS-STING通路的主要成分表達(dá)水平上調(diào)（圖4c）。NP-MnP-ADU在腫瘤微環(huán)境中解體，PC6AB特異性裂解GL261細(xì)胞膜產(chǎn)生免疫原性，協(xié)同MnP和ADU激活BV2細(xì)胞的STING通路，產(chǎn)生顯著的免疫激活效應(yīng)。

圖4 納米激動劑在體外刺激cGAS-STING通路介導(dǎo)的免疫激活。（a）納米激動劑激活STING通路的機制示意圖；（b）不同處理后BV2細(xì)胞中P-STING免疫熒光的CLSM圖像；（c）不同處理后用GL261細(xì)胞上清液處理的BV2細(xì)胞中STING、P-STING、TBK1、P-TBK1、IRF3和P-IRF3表達(dá)水平的Western blot分析；（d-f）上述共培養(yǎng)體系中不同處理后免疫刺激細(xì)胞因子（包括IFN-β（d）、IFN-γ（e）和TNF-α（f））的分泌水平；（g-i）不同處理后與GL261細(xì)胞共孵育的BV2細(xì)胞中CD80+/CD86+（g）、CD3+/CD4+（h）和CD3+/CD8+（i）表達(dá)水平的代表性流式細(xì)胞術(shù)圖像，不同處理包括：（I）對照組，（II）NP，（III）MnP，（IV）NP-MnP，（V）ADU和（VI）NP-MnP-ADU，所有流式細(xì)胞術(shù)實驗均獨立重復(fù)三次，結(jié)果相似；（j）用NP-MnP-ADU和PBS處理的細(xì)胞中基因表達(dá)的heat map；（k）對比NP-MnP-ADU處理組和PBS處理組細(xì)胞的差異表達(dá)基因進行KEGG分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示

為驗證納米激動劑能否增強腫瘤特異性免疫，設(shè)計了GL261腫瘤細(xì)胞和BV2免疫細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)模擬腫瘤微環(huán)境。ELISA測定顯示，與對照組相比，NP-MnP-ADU處理下IFN-β、IFN-γ和TNF-α水平顯著增加，表明STING通路被激活（圖4d,f）。NP-MnP-ADU處理使BV2細(xì)胞中CD80/CD86陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖4g），表明BV2細(xì)胞成熟度增強。共培養(yǎng)體系中，CD3+/CD4+T細(xì)胞和CD3+/CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖4h,i），表明BV2細(xì)胞采取類似抗原呈遞細(xì)胞的表型。RNA測序結(jié)果顯示，NP-MnP-ADU處理的細(xì)胞中Ifnb1、Cxcl2和Ccl5基因上調(diào)（圖4j），表明其誘導(dǎo)細(xì)胞因子和干擾素釋放。GO分析顯示，NP-MnP-ADU處理影響與IFN-β應(yīng)答、細(xì)胞因子產(chǎn)生調(diào)控和免疫反應(yīng)相關(guān)的通路中的基因表達(dá)（圖S17）。KEGG富集分析鑒定出TNF信號通路、細(xì)胞質(zhì)DNA傳感通路和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等關(guān)鍵生物學(xué)通路（圖4k），表明NP-MnP-ADU通過DNA傳感機制激活STING通路，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和干擾素釋放，發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。

（4）體內(nèi)抗腫瘤作用

納米激動劑NP-MnP-ADU在GL261原位膠質(zhì)瘤小鼠模型中的抗腫瘤療效得到進一步研究。該納米激動劑由具有膜溶解活性的PC6AB與MnP耦合而成，封裝了STING激動劑ADU。通過將GL261細(xì)胞植入小鼠尾狀核建立動物模型，腫瘤植入后五天，小鼠每五天接受PBS、NP、MnP、NP-MnP、ADU或NP-MnP-ADU的治療，共15天（圖5a）。納米激動劑通過腦內(nèi)注射（CED）以0.75 mg/kg的劑量遞送，有效跨越血腦屏障并顯示出高生物相容性。研究還全面監(jiān)測了納米激動劑在全身給藥后對接種GL261腫瘤的C57BL/6小鼠模型的毒性。結(jié)果顯示，各組小鼠的關(guān)鍵肝指標(biāo)（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，ALT和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST）和腎指標(biāo)（尿素和尿酸，UA）均在正常范圍內(nèi)，無顯著變化，表明納米激動劑未誘導(dǎo)肝或腎毒性（圖5b–e）。此外，不同組小鼠的體重變化微乎其微（圖5g），表明CED治療比腹腔注射更安全，且未檢測到可觀察的毒性。

圖5 局部腫瘤內(nèi)給予納米激動劑消除了已建立的腫瘤。（a）建立和治療小鼠模型的時序示意圖；（b-e）不同治療后48小時血清中ALT（b）、AST（c）、UREA（d）和UA（e）的濃度，以評估其肝毒性和腎毒性，不同處理包括：（I）對照組，（II）NP，（III）MnP，（IV）NP-MnP，（V）ADU和（VI）NP-MnP-ADU，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=4）表示，采用單因素方差分析法進行統(tǒng)計分析，P值大于0.05表示無顯著差異；（f）不同治療后小鼠的腫瘤生長抑制曲線；（g）治療期間小鼠的體重變化；（h）不同治療后荷瘤小鼠的腫瘤體積監(jiān)測；（i）通過CED單劑量給予NP-MnP-Cy5后健康和荷瘤小鼠的實時MRI圖像；（j）通過CED單劑量給予NP-MnP-Cy5后MRI信號強度的變化；（k）通過CED單劑量給予NP-MnP-Cy5后健康和荷瘤小鼠的實時熒光圖像；（l）通過CED單次給藥NP-MnP-Cy5后熒光信號強度變化；（m）不同處理后腦組織樣本的H&E染色結(jié)果，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=4）

NP-MnP-ADU在小鼠GL261腫瘤模型中顯示出顯著的抗腫瘤效果。PBS處理的小鼠腫瘤呈指數(shù)增長，20天后腫瘤大小增加到約32.6 mm3。NP、ADU和MnP治療中等程度地抑制了腫瘤進展，平均腫瘤大小約為13 mm3，三者之間腫瘤大小無顯著差異（圖5f）。相比之下，NP-MnP-ADU治療顯示出最顯著的腫瘤抑制效果，平均最終腫瘤大小約為3.42 mm3（圖5h）。H&E染色顯示納米激動劑治療期間癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的核碎片化和核溶解（圖5m），表明NP-MnP-ADU通過整合化療和免疫療法具有強大的抗腫瘤療效。

為監(jiān)測NP-MnP-ADU在腫瘤組織中的分布及其pH響應(yīng)成像，評估了CED單劑量注射NP-MnP-Cy5（3μL）后膠質(zhì)瘤小鼠的T1加權(quán)MRI和熒光圖像。T1加權(quán)MRI顯示，注射NP-MnP-Cy5后，GL261腫瘤模型小鼠的腫瘤實現(xiàn)了快速對比增強（圖5i），而健康小鼠的T1對比度未顯示任何增強，表明pH觸發(fā)的錳釋放對腫瘤探測至關(guān)重要。注射后，對比度在10分鐘內(nèi)迅速增加并維持約3小時，具有足夠的腫瘤特異性，而健康小鼠的信號幾乎未改變（圖5j）。熒光成像顯示，NP-MnP-Cy5在腫瘤部位的熒光信號強度顯著高于對照組，而健康小鼠中未出現(xiàn)明顯的NP-MnP-Cy5熒光信號（圖5k,l）。48小時后，處死小鼠并對切除的主要器官進行成像，以分析NP-MnP-Cy5的代謝途徑。 

（5）NP-MnP-ADU 激活抗腫瘤免疫

NP-MnP-ADU治療顯著增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，NP-MnP-ADU治療的GL261腫瘤小鼠中CD80+/CD86+表達(dá)是對照組的4.3倍（圖6a）。治療后，腫瘤中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖6b,c）。此外，NP-MnP-ADU治療增加了促炎M1巨噬細(xì)胞表型（圖6d），表明其可介導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞向M1表型極化，減輕免疫抑制。血清中IFN-β、IFN-γ和TNF-α水平顯著增加，而IL-10降低（圖6e–h），表明促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)了抗腫瘤免疫反應(yīng)。免疫熒光成像顯示腫瘤組織中P-STING、P-TBK1和P-IRF3蛋白過表達(dá)（圖6i），表明免疫反應(yīng)通過cGAS-STING通路激活。NP-MnP-ADU通過激活cGAS-STING通路、促進T細(xì)胞激活和增加M1巨噬細(xì)胞比例，增強免疫細(xì)胞反應(yīng)并抑制腫瘤生長。

圖6 納米激動劑激活cGAS-STING通路促進細(xì)胞因子釋放和免疫系統(tǒng)激活。（a-d）體內(nèi)治療后GL261腫瘤組織中CD80+/CD86+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+和F4/80/CD80+表達(dá)水平的代表性流式細(xì)胞術(shù)圖像；（e-h）不同治療后血清中IFN-β、IFN-γ、IL-10和TNF-α的分泌水平；（i）不同治療后腫瘤中P-STING表達(dá)水平的免疫熒光分析，黃色：P-STING，藍(lán)色：細(xì)胞核。不同處理包括：（I）對照，（II）NP，（III）MnP，（IV）NP-MnP，（V）ADU和（VI）NP-MnP-ADU。流式細(xì)胞術(shù)實驗獨立重復(fù)3次，結(jié)果相似，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示