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針對(duì)上述問(wèn)題，南方醫(yī)科大學(xué)楊斌/劉強(qiáng)團(tuán)隊(duì)制備了具有良好生物相容性的天然甘草酸（GA）和氧化苦參堿（OMT）合成的生物活性離子液體（ILs），并優(yōu)化了GA-OMT（GAO）的組分比和內(nèi)在形成機(jī)理。隨后，制備了裝載棕櫚酰五肽-4（PAL-4）的GAO自組裝膠束（GAO/PAL-4-SM），構(gòu)建了一種創(chuàng)新性的遞送載體。在細(xì)胞和動(dòng)物光老化實(shí)驗(yàn)中，GAO/PAL-4-SM具有顯著的促進(jìn)膠原和透明質(zhì)酸再生、減輕炎癥和細(xì)胞凋亡、加速巨噬細(xì)胞M2極化，從而減輕皮膚皺紋和平衡皮膚彈性的能力。不僅解決了信號(hào)肽在經(jīng)皮遞送中的穩(wěn)定性和滲透性問(wèn)題，還為光老化的治療提供了一種高效、可行的新策略。該文章于2025年1月9日以《Bioactive Glycyrrhizic Acid Ionic Liquid Self-Assembled Nanomicelles for Enhanced Transdermal Delivery of Anti-Photoaging Signal Peptides 》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI: 10.1002/advs.202412581）。

研究示意圖

（1）GAO離子液體的合成及形成機(jī)理

OMT上存在N?-O?配位鍵和C=O鍵（圖1a），GAO的制造過(guò)程如圖1a所示。GA和OMT以1：3摩爾比混合。1H NMR譜顯示，與純GA相比，混合后GAO的-COOH氫原子峰（12-13 ppm）消失，連接-COOH的氫原子峰（4-6 ppm）也消失（圖1b）。OMT的氫原子在位置9、11和22（2.8-3.6 ppm）的峰消失或位移，表明N?-O?上的氫原子振動(dòng)明顯。同時(shí)，連接C=O的氫原子峰消失（圖1b），表明-COOH質(zhì)子已轉(zhuǎn)移。FTIR分析中，與純OMT相比，GAO的N?-O?峰（2988.74 cm?1）消失（圖1c），表明N?-O?是與GA連接的重要位點(diǎn)。DSC曲線顯示，185°C時(shí)出現(xiàn)吸熱峰，表明GAO離子液體發(fā)生相變并產(chǎn)生熱效應(yīng)。Tg曲線顯示，100°C下GAO質(zhì)量損失小于2.5%，證明其穩(wěn)定性（圖1d）。HPLC-MS結(jié)果表明，形成IL過(guò)程中未產(chǎn)生新物質(zhì)（圖1e），說(shuō)明GA和OMT主要通過(guò)物理交聯(lián)相互作用。GA含量增加未顯著改變C=O基團(tuán)位置和強(qiáng)度（圖1f）。GA和OMT的反應(yīng)機(jī)制和相互作用行為如圖1g所示。

圖1.GAO離子液體的合成、表征及形成機(jī)理。（a）GAO的制備過(guò)程及外觀（GA/OMT比例為1:3）；（b）GA、OMT和GAO離子液體的1H NMR譜；（c）GA、OMT、物理混合物和GAO離子液體的紅外光譜；（d）GAO的DSC-Tg熱分析圖；（e）GAO離子液體的HPLC-MS分析；（f）不同GA/OMT比例（1:3、2:3、3:3、4:3）的GAO的1H NMR譜；（g）GAO的反應(yīng)機(jī)理

（2）GAO的流變性能和離子間相互作用

GA/OMT摩爾比為1：3的GAO表現(xiàn)出顯著的粘度特性。其剪切粘度隨剪切速率的增加而顯著降低（圖2a），并且隨著溫度的升高而降低（圖2b）。在三種不同摩爾比條件下，剪切應(yīng)力與剪切速率均呈良好的線性關(guān)系，表現(xiàn)為典型的牛頓流體（圖2b）。GA/OMT摩爾比為1：3的GAO的剪切粘度高于2：3和1：6的GAO，表明其分子間相互作用更強(qiáng)（圖2c）。分子動(dòng)力學(xué)模擬（MDS）分析表明，GA/OMT摩爾比為1：3的GAO的內(nèi)聚能密度（CED）值最高（5.26 × 10? Kcal mol?1），高于2：3（5.10 × 10? Kcal mol?1）和1：6（5.07 × 10? Kcal mol?1），說(shuō)明其分子間纏結(jié)和內(nèi)聚力更強(qiáng)（圖2d）。徑向分布函數(shù)（RDF）分析顯示，N?-O?或C=O與-COOH之間的RDF峰均集中在<4 ?區(qū)域，表明存在氫鍵相互作用，且N?-O?-H（-COOH）的RDF峰高度顯著高于C=O-H（-COOH），進(jìn)一步證明N?-O?是OMT中與-COOH結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)（圖2e）。密度泛函理論（DFT）計(jì)算表明，GAO的集中靜電勢(shì)（ESP）接近零，范圍較低，表明其低極性和高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（圖2f，g）。獨(dú)立梯度模型（IGMH）分析顯示GA和OMT之間存在豐富的氫鍵（綠色區(qū)域），而范德華力（藍(lán)點(diǎn)）較少，與RDF分析結(jié)果一致（圖2h）。分子中原子（AIM）分析表明GAO具有吸引力的離子相互作用，適用于滲透增強(qiáng)劑（圖2i）。

圖2.GAO離子液體的流變性能和離子相互作用研究。（a）GAO離子液體的剪切粘度；（b）剪切應(yīng)力隨剪切速率變化（25℃、35℃、45℃）；（c）不同GA/OMT比例（1:3、2:3、1:6）的GAO剪切應(yīng)力隨剪切速率變化；（d）不同GA-OMT二元體系的分子動(dòng)力學(xué)模擬（MDS）快照及CED值；（e）GA中-COOH的H原子與OMT的N?-O?或C中的O原子的距離分布函數(shù)（RDF）；（f）ESP分析；（g）IGMH分析；（h）AIM分析（GA/OMT摩爾比為1:3）

（3）GAO的生物相容性、導(dǎo)電性和抗凋亡作用

CCK-8試驗(yàn)顯示所有組細(xì)胞存活率超過(guò)100%（圖3a），25-800 μg/mL濃度的GAO顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖3a）。Live&Dead染色表明所有組細(xì)胞活性良好，呈亮綠色且無(wú)紅色（圖3b）。當(dāng)GA濃度低于800 μg/mL時(shí)，HSF細(xì)胞存活率超過(guò)100%，表明OMT制成GAO后細(xì)胞毒性降低。豚鼠皮膚組織學(xué)切片（圖3c）顯示，GAO處理后皮膚無(wú)明顯病理變化，表皮和真皮未見壞死、糜爛、潰瘍或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。GAO離子液體在5%-80%水稀釋范圍內(nèi)均勻分散，呈透明液體狀。電導(dǎo)率測(cè)試表明，GAO含量為20%時(shí)電導(dǎo)率最高，5%或10%時(shí)電導(dǎo)率未顯著降低，但高于40%時(shí)電導(dǎo)率顯著降低（圖3d），說(shuō)明水含量低于80%時(shí)GAO水溶液達(dá)到臨界點(diǎn)，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)未被破壞。細(xì)胞凋亡試驗(yàn)中，4.7%的HSF細(xì)胞處于壞死狀態(tài)，對(duì)照組中26.85%的細(xì)胞處于晚期凋亡區(qū)（圖3e）。25 μg/mL和100 μg/mL的GAO可誘導(dǎo)晚期凋亡細(xì)胞向正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且呈量效關(guān)系；400 μg/mL的GAO主要將晚期凋亡細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為早期凋亡細(xì)胞（圖3e），表明其具有抑制細(xì)胞凋亡的潛力，有利于抗光老化。

圖3.GAO離子液體的生物相容性、導(dǎo)電性和抗凋亡特性。（a）GAO（6.25-1600 μg/mL）孵育24小時(shí)后HSF細(xì)胞活力（n=6）；（b）25、100、400 μg/mL GAO處理的HSF細(xì)胞活/死染色；（c）GAO-SM和GAO/PAL-4-SM對(duì)豚鼠背部皮膚的刺激特性（比例尺=400 μm）；（d）不同含水量下GAO離子液體的電導(dǎo)率（n=3）；（e）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)25、100、400 μg/mL GAO處理的HSF細(xì)胞凋亡

(4) GAO/PAL-4-SM的自組裝

GAO/PAL-4-SM的制備過(guò)程如圖4a所示。PAL-4（1 mg/mL）在水中微溶，混合物呈渾濁不透明液體；而GAO可顯著溶解PAL-4，形成澄清黃色液體，最小溶解度為20 mg/mL（圖4b）。GAO/PAL-4在蒸餾水中稀釋5、10和20倍后仍保持澄清透明，PAL-4濃度為1 mg/mL（圖4b）。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量顯示，5% GAO/PAL-4-SM的納米直徑約為15.377 nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.265（圖4c）。10% GAO/PAL-4-SM的納米尺寸未顯著變化，但PDI值更低，粒徑分布更均勻集中，表明更穩(wěn)定的納米系統(tǒng)（圖4d）。而20% GAO/PAL-4-SM的直徑和PDI值顯著增加，未能實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定和均勻的納米系統(tǒng)（圖4e）。GAO-SM濃度為5%、10%和20%時(shí)，納米顆粒的zeta電位分別為?13.7 mV、?14.6 mV和?16.1 mV（圖4c-e）。透射電鏡觀察顯示三種膠束均為球形，粒徑與DLS結(jié)果一致（圖4f）。三種GAO/PAL-4-SM均表現(xiàn)出明顯的廷德爾光散射效應(yīng)（圖4c-e）。因此，選擇10% GAO/PAL-4-SM進(jìn)行臨界膠束濃度（CMC）、FTIR和X射線衍射分析。10% GAO/PAL-4-SM的CMC值為5 mg/g，驗(yàn)證了膠束納米結(jié)構(gòu)的存在（圖4g）。X射線衍射分析（圖4h）和FTIR（圖4i）結(jié)果表明PAL-4被很好地包封在GAO-SM中。

圖4.GAO/PAL-4-SM的自組裝。（a）GAO/PAL-4-SM的制備過(guò)程；（b）PAL-4在水和GAO-SM中的溶解度（5%、10%、20%）；（c）5% GAO/PAL-4-SM的粒徑、zeta電位、PDI、粒徑分布及丁達(dá)爾效應(yīng)；（d）10% GAO/PAL-4-SM的粒徑、zeta電位、PDI、粒徑分布及丁達(dá)爾效應(yīng)；（e）20% GAO/PAL-4-SM的粒徑、zeta電位、PDI、粒徑分布及丁達(dá)爾效應(yīng)；（f）不同膠束的TEM圖像（標(biāo)尺=50 nm）；（g）10% GAO-SM的CMC值；（h）PAL-4、10% GAO-SM和10% GAO/PAL-4-SM的X射線衍射；（i）PAL-4、10% GAO-SM和10% GAO/PAL-4-SM的FTIR曲線

（5）GAO-SM對(duì)PAL-4滲透的促進(jìn)作用

PAL-4的累積透過(guò)量在24小時(shí)內(nèi)隨GAO濃度增加而顯著增加。10% GAO-SM使PAL-4滲透量達(dá)到對(duì)照組的5.64倍，但20% GAO時(shí)滲透量顯著下降（圖5a）。不同濃度GAO-SM處理后，PAL-4在皮膚中的蓄積量呈相似的促進(jìn)趨勢(shì)，其中10% GAO對(duì)PAL-4保留的促進(jìn)作用最強(qiáng)（圖5b）。因此，選擇10% GAO-SM研究ILs-SM對(duì)PAL-4在不同皮膚層滯留的影響。與對(duì)照相比，10% GAO處理的皮下層中PAL-4保留量達(dá)到5.60倍（圖5c）。為了驗(yàn)證體外滲透結(jié)果，使用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記PAL-4，觀察其在有無(wú)10% GAO-SM時(shí)的動(dòng)態(tài)滲透。GAO/PAL-4-SM處理的皮膚平均熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照，尤其在6小時(shí)和9小時(shí)后（圖5d）。GA和OMT在皮膚中也有積累，10% GAO濃度下，SC層中GA和OMT的滲透率分別為45.5%和36.7%（圖5e、f、g）。這些成分在GAO與SC組分之間的相互作用中發(fā)揮了重要作用，促進(jìn)了松動(dòng)的SC屏障的形成。GAO-SM對(duì)PAL-4增強(qiáng)滲透作用的示意圖如圖5h所示。

圖5.GAO-SM對(duì)PAL-4透皮吸收和皮下滯留的促進(jìn)作用（24 h）。（a）PAL-4在5%、10%和20% GAO-SM中的體外滲透曲線；（b）PAL-4在有無(wú)GAO-SM條件下的全皮膚累積滲透量；（c）10% GAO-SM對(duì)PAL-4在角質(zhì)層（SC）和皮下層滯留的影響；（d）動(dòng)態(tài)熒光圖像顯示3、6和9小時(shí)內(nèi)，有無(wú)10% GAO-SM的FITC標(biāo)記PAL-4的滲透特性；（e）不同濃度GAO ILs-SM中GA在全皮膚中的保留；（f）不同濃度GAO ILs-SM中OMT在全皮膚中的保留；（g）10% GAO-SM中GA和OMT在SC和皮下層的保留

圖6.GAO促進(jìn)PAL-4滲透的機(jī)制研究。（a）PAL-4或GAO/PAL-4-SM處理豬皮24 h的紅外光譜；（b）DSC熱分析圖；（c）角蛋白殘基與OMT的二維對(duì)接（黑色箭頭表示與角蛋白殘基形成氫鍵的N?-O鍵）；（d）GAO與Cer、FFA或CHO二元體系的最小能量三元構(gòu)象及混合能；（e）GAO與不同SC脂質(zhì)的混合能（條形圖表示平均值±SD，n=4，*p<0.0001）；（f）GA或OMT處理24 h的Cer的13C NMR譜，13C NMR分析中Cer的羰基碳原子變化；（g）不同SC組分與GA或OMT之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)

如圖7a所示，PAL-4在GAO存在時(shí)部分滲透穿過(guò)SC脂質(zhì)膜，其余部分在5000 ns后被捕獲在脂質(zhì)中；而在無(wú)GAO時(shí)，PAL-4分子在SC脂質(zhì)中積累或遠(yuǎn)離脂質(zhì)界面，與體外滲透研究結(jié)果一致（圖5）。GA和OMT將PAL-4分子拉至SC脂質(zhì)界面，并將其包裹成類似核-殼結(jié)構(gòu)的膠束，表明GAO通過(guò)提供拉動(dòng)效應(yīng)和納米膠束促進(jìn)PAL-4滲透（圖7b）。平均力勢(shì)（PMF）計(jì)算顯示，PAL-4在GAO/SC脂質(zhì)系統(tǒng)中穿透雙層脂質(zhì)屏障所需的拉力顯著低于純SC脂質(zhì)系統(tǒng)（圖7c）。Cer、CHO和FFA在GAO/脂質(zhì)體系中的密度分布顯示，CHO和Cer在脂質(zhì)層中間積累，而FFA分布均勻（圖7d），表明CHO和Cer為GAO結(jié)合提供了更多相互作用位點(diǎn)，導(dǎo)致更高的混合能（圖6d，e）。GA和OMT更集中在皮膚-屏障界面處，而不是保留在溶液中（圖7d），進(jìn)一步證明它們協(xié)同減弱界面阻力以增強(qiáng)PAL-4滲透。PAL-4在GAO/SC脂質(zhì)系統(tǒng)中與脂質(zhì)基質(zhì)的相互作用力顯著弱于純SC脂質(zhì)系統(tǒng)（圖7e），表明擴(kuò)散阻力降低。PAL-4與GAO之間的相互作用顯著低于GAO與皮膚之間的相互作用（圖7e），表明GAO的滲透促進(jìn)作用主要通過(guò)影響脂質(zhì)屏障實(shí)現(xiàn)。摻入GAO后，PAL-4與Cer和CHO的相互作用增加，而與FFA的相互作用降低（圖7f）。GA陰離子與其他成分的相互作用類似于OMT陽(yáng)離子（圖7g），驗(yàn)證了它們?cè)诟纳茲B透方面的同等顯著作用（圖4g）。GA陰離子和OMT陽(yáng)離子與CHO和Cer的相互作用強(qiáng)于FFA（圖7g），與分子對(duì)接研究一致（圖6d，e）。GAO IL的滲透增強(qiáng)機(jī)制歸因于GAO與脂質(zhì)屏障（Cer和CHO）的更強(qiáng)相互作用，這顯著減弱了PAL-4與SC脂質(zhì)的相互作用，并以核-殼膠束方式將PAL-4分子向前拉入SC中（圖7h）。

圖7.PAL-4從GAO水溶液滲透通過(guò)SC屏障的分子動(dòng)力學(xué)（MDS）分析。（a）PAL-4在S1模型中的滲透動(dòng)態(tài)快照及局部放大；（b）PAL-4在S2模型中的滲透動(dòng)態(tài)快照及局部放大；（c）在S1和S2模型中拉動(dòng)PAL-4穿過(guò)脂質(zhì)屏障所需的拉力；（d）S1和S2中FFA、Cer、CHO、GA、OMT和PAL-4在Z方向上的密度分布；（e）S1和S2中不同組分之間的總相互作用力；（f）PAL-4與FFA、CHO和Cer之間的相互作用能；（g）GA陰離子或OMT陽(yáng)離子與其他組分之間的相互作用；（h）GAO離子液體通過(guò)向前拉動(dòng)PAL-4將其遞送到更深的皮膚層，增強(qiáng)與皮膚及納米尺寸的相互作用

（7）GAO-SM對(duì)PAL-4抗細(xì)胞光老化作用的影響

GAO-SM顯著促進(jìn)HSF細(xì)胞對(duì)FITC標(biāo)記的PAL-4的攝取，細(xì)胞攝取量約為對(duì)照組的兩倍（圖8a）。PAL-4顯著提高HA含量，GAO-SM與PAL-4聯(lián)合使用時(shí)HA含量進(jìn)一步增加（圖8b）。GAO-SM單獨(dú)處理顯著提高Col-I含量，PAL-4表現(xiàn)出更高的增加Col-I能力，GAO增強(qiáng)PAL-4對(duì)Col-I產(chǎn)生的促進(jìn)作用（圖8c）。在紫外線誘導(dǎo)的光老化HSF細(xì)胞模型中，GAO/PAL-4-SM顯著恢復(fù)HA和Col-I含量（圖8d）。光老化細(xì)胞表現(xiàn)出更高的ROS和TNF-α水平，更低的SOD活性；GAO/PAL-4-SM顯著降低ROS（圖8e）和TNF-α（圖8g）水平，提高SOD活性（圖8f），而單獨(dú)的GAO-SM和PAL-4僅降低TNF-α水平。在紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，紫外線照射使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為晚期凋亡細(xì)胞（25.29%）和壞死細(xì)胞（33.57%）（圖8h）。PAL-4顯著降低晚期凋亡和壞死細(xì)胞比例，GAO-SM將晚期凋亡細(xì)胞轉(zhuǎn)化為早期凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞，但對(duì)壞死細(xì)胞無(wú)作用。GAO-SM與PAL-4聯(lián)合應(yīng)用在降低晚期凋亡和壞死細(xì)胞比例方面表現(xiàn)出最高的功效（圖8h）。

圖8.GAO-SM增強(qiáng)PAL-4對(duì)HSF細(xì)胞的抗光老化作用。（a）10% GAO-SM對(duì)FTIR標(biāo)記PAL-4在HSF細(xì)胞內(nèi)分布的影響；（b）GAO-SM、PAL-4或兩者處理后HA細(xì)胞內(nèi)水平；（c）GAO-SM、PAL-4或兩者處理后Col-1細(xì)胞內(nèi)水平；（d）UV暴露后GAO-SM、PAL-4或兩者處理的Col-1細(xì)胞內(nèi)水平；（e）UV暴露后GAO-SM、PAL-4或兩者處理的HSF細(xì)胞內(nèi)ROS水平；（f）UV暴露后GAO-SM、PAL-4或兩者處理的HSF細(xì)胞內(nèi)SOD水平；（g）UV暴露后GAO-SM、PAL-4或兩者處理的HSF細(xì)胞內(nèi)TNF水平；（h）GAO-SM、PAL-4或GAO/PAL-4-SM處理HSF細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡研究

（8）GAO-SM對(duì)PAL-4抗C57/BL 6小鼠光老化作用的影響

建立了C57/BL 6小鼠皮膚光老化模型，采用UVA和UVB聯(lián)合照射以評(píng)價(jià)GAO-SM對(duì)PAL-4體內(nèi)抗光老化作用的增強(qiáng)效果。與對(duì)照組相比，照射4周后，模型組皮膚出現(xiàn)明顯皺紋、脫皮、干燥、粗糙、色素沉著和皮革樣外觀（圖9b）。PAL-4組皮膚仍表現(xiàn)出脫屑、粗糙、色素沉著和革質(zhì)，表明其無(wú)法逆轉(zhuǎn)光老化皮膚，可能由于其皮膚滲透性較差。而GAO/PAL-4-SM組皮膚顯示出更少的皺紋和革質(zhì)，更保濕、光滑且有彈性，與正常組相似。各組背部皮膚縱切片用于HE染色（圖9c）和Masson三色染色（圖9d），以評(píng)估表皮厚度、炎性浸潤(rùn)和膠原再生。治療2周后測(cè)量各組真皮厚度。HE染色結(jié)果顯示，模型組表皮最厚，伴有過(guò)度角化（圖9e），導(dǎo)致皮膚粗糙和革質(zhì)。照射4周后，真皮內(nèi)出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。維生素C或GAO/PAL-4-SM治療組的皮膚表皮變薄，角質(zhì)化程度降低，炎癥浸潤(rùn)減少，更接近正常皮膚組織。純GAO-SM或PAL-4治療也能緩解這些癥狀，但效果不如GAO/PAL-4-SM顯著，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了它們的協(xié)同效應(yīng)。

圖9.GAO增強(qiáng)PAL-4對(duì)光老化皮膚的修復(fù)效果。（a）UV照射及藥物處理時(shí)間線；（b）不同時(shí)間點(diǎn)光老化皮膚的代表性圖像（綠色箭頭：脫屑；紅色箭頭：皺紋和皮革樣皮膚；粉色箭頭：色素沉著）；（c）H&E染色；（d）4周后光老化皮膚的Masson三色染色（黑色箭頭：表皮；標(biāo)尺=400 μm）；（e）表皮厚度測(cè)量（基于H&E染色）；（f）膠原蛋白相對(duì)含量（基于Masson染色）；（g）各組大鼠皮膚勻漿中Col-I、HYP、HA、GSH、MDA和SOD的含量測(cè)定

在免疫熒光檢查中，GAO/PAL-4-SM處理的背部皮膚中TNF-α水平顯著低于GAO-SM和純PAL-4（圖10a，f）。模型組膠原纖維含量減少、排列混亂且分布不均勻，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)皺紋和松弛（圖9d，f）。GAO/PAL-4-SM處理后，膠原纖維排列和含量恢復(fù)到正常水平，顯示出改善膠原含量損失的潛力。而純PAL-4和GAO-SM的改善能力較弱。天狼星紅染色顯示，GAO/PAL-4-SM顯著上調(diào)Col-I表達(dá)并降低膠原III比例，而PAL-4不能增加Col-I/膠原III比例（圖10b）。ELISA定量顯示GAO/PAL-4-SM顯著促進(jìn)Col-I含量（圖9g）。羥脯氨酸（HYP）作為Col-I的關(guān)鍵成分，其含量在GAO/PAL-4-SM處理后顯著增加（圖9h）。GAO/PAL-4-SM顯著提高透明質(zhì)酸（HA）的產(chǎn)生和更新能力，與維生素C相當(dāng)（圖9i）。氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)顯示，模型組MDA水平降低，SOD和谷胱甘肽水平增加（圖9j-l）。GAO/PAL-4-SM處理后，這些指標(biāo)恢復(fù)正常，而PAL-4僅對(duì)MDA水平有顯著效果（圖9j-l）。免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明，紫外線照射增加表皮中切割的caspase-3數(shù)量，而GAO/PAL-4-SM顯著抑制其表達(dá)（圖10c，g）。GAO/PAL-4-SM顯著降低CD11c陽(yáng)性巨噬細(xì)胞百分比，增加CD206陽(yáng)性巨噬細(xì)胞百分比，與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)（圖10d-i）。這些結(jié)果表明GAO/PAL-4-SM在促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化和抗光老化方面具有重要作用（圖10j）。

圖10.GAO增強(qiáng)PAL-4對(duì)紫外線誘導(dǎo)的C57/BL6光老化小鼠的抗光老化作用。（a）TNF-α免疫熒光染色（比例尺=250 μm）；（b）Col-I和III型膠原蛋白的天狼星紅染色（比例尺=50 μm，黃色至紅色代表Col-I，綠色代表III型膠原蛋白）；（c）裂解的caspase-3免疫組織化學(xué)染色（比例尺=250 μm）；（d）CD11c免疫熒光染色（比例尺=250 μm）；（e）CD206免疫熒光染色（比例尺=250 μm）；通過(guò)ImageJ軟件評(píng)估（f）TNF-α、（g）裂解的caspase-3、（h）CD11c和（i）CD206表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度；（j）GAO-SM增強(qiáng)PAL-4抗光老化作用的分子機(jī)制示意圖