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針對上述問題，溫州醫(yī)科大學沈建良團隊開發(fā)一種免疫調(diào)節(jié)水凝膠（RGH2），其由釕修飾的異黑素納米顆粒（Ru@allomelanin）、苯硼酸修飾的甲基丙烯酸化明膠（GelMA-PBA）和硝基苯接枝的透明質(zhì)酸（HANB）組成。不僅能夠清除ROS，還能通過類過氧化氫酶活性將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣，從而同時實現(xiàn)ROS清除和供氧功能。此外，RGH2通過葡萄糖敏感的硼酸酯鍵和紫外線觸發(fā)的亞胺鍵增強了對復雜糖尿病傷口環(huán)境的響應性。在動物實驗中，RGH2顯著促進了巨噬細胞向M2表型的極化，有效治療了糖尿病慢性傷口。該文章于2025年3月31日以《Hyperthermia-enhanced immunoregulation hydrogel for oxygenation and ROS neutralization in diabetic foot ulcers》為題發(fā)表于《CellBiomaterials》（DOI：10.1016/j.celbio.2025.100020。

研究示意圖

（1）RU@Allomelanin納米顆粒的分析

采用自聚合法制備異黑素納米球，用于螯合和還原三氯化釕，實現(xiàn)釕納米材料的原位固定。掃描電子顯微鏡（SEM）分析（圖1A和1B）顯示異黑素球呈均勻球形，直徑約200納米，Ru納米點均勻分布。透射電子顯微鏡（TEM，圖1C）和元素映射（圖1D）證實O、C和Ru元素均勻存在，表明合成成功。研究發(fā)現(xiàn)，Ru@異黑素納米粒子在近紅外光下具有顯著光熱效應（圖1E-1H）：不同濃度下暴露于0.5 W/cm2的808 nm激光10分鐘，溫度分別升至37.7°C、43.4°C和47.4°C（圖1E）；1 mg/mL濃度下，溫度隨NIR功率增加而升高（圖1F）；光熱轉(zhuǎn)換效率為43.1%（圖1G），且在多次循環(huán)中表現(xiàn)出優(yōu)異穩(wěn)定性（圖1H）。紅外攝像機圖像（圖1I）顯示其升溫明顯高于磷酸鹽緩沖溶液。此外，Ru@異黑素納米粒子可作為納米酶，催化H?O?分解釋放氧氣（圖1J），且在NIR照射下產(chǎn)氧能力增強（圖1K和1L）。在ROS清除實驗中，光誘導微熱處理顯著提高了自由基清除效率（圖1M-1O）。

圖1 RU@Allomelanin納米顆粒的分析。（A, B）Allomelanin（A）和 Ru@Allomelanin（B）的 SEM 圖像；（C）Ru@Allomelanin 的 TEM 圖像；（D）Ru@Allomelanin 中 C、O 和 Ru 的元素分布；（E）不同濃度 Ru@Allomelanin 的溫度變化曲線；（F）不同 NIR 條件下 Ru@Allomelanin（1 mg/mL）的熱成像；（G）計算 PCE 時 RGH? 水凝膠的溫度變化；（H）Ru@Allomelanin（1 mg/mL）在 808 nm NIR 下的光穩(wěn)定性測試（1 W/cm2，4 個周期）；（I）不同濃度 PBS 和 Ru@Allomelanin 的熱成像；（J）氧氣生成過程示意圖；（K）在 0.5 W/cm2 808 nm NIR 激光下 O? 氣泡生成（白色箭頭）；（L）在黑暗和激光條件下（H?O? 濃度 1 mM）Ru@Allomelanin（1 mg/mL）產(chǎn)生的 O? 濃度；（M-O）光熱處理時對 ABTS（M）、DPPH（N）和 PTIO（O）自由基的抗氧化活性測試（有無 Ru@Allomelanin 納米顆粒）

（2）RGH2水凝膠的開發(fā)與分析

研究人員開發(fā)了一種用于糖尿病傷口愈合的RGH?水凝膠，由GelMA-PBA、HANB改性的HA和Ru@allomelanin納米粒子組成。通過將Ru@allomelanin分散在GelMA-PBA和HANB混合物中，加入光引發(fā)劑LAP后暴露于紫外線（365 nm，5 W/cm2）30秒，制備出一體式水凝膠貼劑。化學組成通過1H NMR和FTIR驗證（圖2A-2C）：GelMA-PBA和HANB的特征峰表明合成成功，Ru@allomelanin的紅外光譜中–OH峰降低，證實Ru金屬沉積。水凝膠的剪切強度測試顯示，10% GelMA-PBA加1% HANB配方的應力水平最高，達到32.6 kPa（圖2D）。流變行為評估表明，水凝膠在約20%應變處G"和G'交集，表明網(wǎng)絡(luò)凝聚力轉(zhuǎn)變（圖2E）；在1%應變時模量穩(wěn)定，而在400%應變下G'下降、G"上升，顯示高變形后的結(jié)構(gòu)恢復能力（圖2F）。RGH?的自修復能力在10分鐘內(nèi)實現(xiàn)分離部分的重新連接（圖2G），其粘彈性在0.1至10 Hz范圍內(nèi)G'超過G"（圖2H）。粘度隨剪切速率增加而下降（圖2I），支持其注射應用的可行性。凍干水凝膠的吸水性能在360分鐘趨于穩(wěn)定，且RGH?的持液能力優(yōu)于RGH?（圖2J、2L）。SEM分析顯示，RGH?和RGH?均具有三維多孔基質(zhì)，RGH?因Ru@allomelanin的存在而更粗糙（圖2K、2M）。

圖2 表征 RGH? 水凝膠特性。（A）明膠、GelMA 和 GelMA-PBA 的1H NMR 光譜；（B）HA 和 HANB 的1H NMR 光譜；（C）凝膠前體的 FTIR 光譜；（D）豬皮膚試驗中粘合劑的應力-應變曲線；（E）1 Hz 時不同應變下 G′和 G″的變化；（F）步進應變測試時的水凝膠行為；（G）RGH? 的自修復照片；（H）1% 應變下 G′和 G″隨時間的變化；（I）RGH? 和 RGH? 在不同剪切速率下的粘度流變分析；（J, L）RGH? 和 RGH? 的吸水量（J）和保留量（L）比較；（K, M）SEM 圖像展示不同放大倍數(shù)下的 RGH?（K）和 RGH?（M）

（3）RGH2水凝膠的毒性、光熱和自由基清除性能評估

本研究通過細胞-水凝膠共培養(yǎng)法驗證了RGH?水凝膠的生物相容性。將RS1細胞和RAW264.7細胞與水凝膠共孵育48小時后，細胞活/死染色（圖3A）顯示大多數(shù)細胞存活，表明水凝膠支持細胞附著和增殖。隨后，通過CCK-8檢測細胞活力（圖3B和3C），結(jié)果顯示水凝膠與對照組之間無顯著差異，證實其無毒特性。水凝膠的光熱特性通過改變Ru@allomelanin含量或NIR密度進行評估。不同濃度的Ru@allomelanin水凝膠在808 nm NIR照射下溫度上升與濃度成正比（圖3D），例如RGH?溫度可達44.6°C（圖3E）。此外，RGH?水凝膠的加熱性能隨NIR功率密度增加而升高（0.5 W/cm2至2 W/cm2，溫度從44.6°C升至81.9°C，圖3F），其光熱轉(zhuǎn)換效率（PCE）也進行了評估（圖3G），且在多次激光切換周期中表現(xiàn)出優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性（圖3H）。水凝膠的ROS清除能力通過ABTS、DPPH和PTIO檢測。ABTS測試（圖3I）顯示，RGH?在NIR照射下清除效率顯著高于RGH?，達到89.4%。DPPH測試（圖3J）中，RGH?的清除效果是RGH?的2倍。PTIO測試（圖3K）也證實了RGH?在清除ROS方面表現(xiàn)出卓越的潛力。

圖3 RGH? 水凝膠的毒性、光熱效應和自由基清除能力。（A）不同處理條件下 48 小時后 RS1 和 RAW264.7 細胞的鈣黃綠素-AM/PI 染色；（B, C）CCK-8 法評估 RGH? 和 RGH? 水凝膠對 RS1 和 RAW264.7 細胞的細胞毒性；（D）不同處理水凝膠的熱成像照片；（E）不同水凝膠的溫度升高曲線；（F）RGH? 水凝膠溫度隨 NIR 激光功率變化的曲線；（G）用于 PCE 計算的 RGH? 水凝膠溫度變化曲線；（H）光穩(wěn)定性測試示意圖；（I-K）有光或無光條件下，RGH? 水凝膠對 ABTS（I）、DPPH（J）和 PTIO（K）自由基的清除能力

(4) 評估RGH2水凝膠的抗氧化特性、細胞遷移、血管生成和缺氧調(diào)節(jié)

圖4A和4B顯示，H?O?處理顯著抑制了RS1細胞和RAW264.7巨噬細胞的增殖，而水凝膠預處理5小時后，細胞存活率顯著提高。共聚焦熒光成像（圖4C）表明，水凝膠處理降低了H?O?誘導的細胞內(nèi)ROS水平。劃痕試驗（圖4D）顯示，RGH?組在12小時時的劃痕愈合率達到55.96%，顯著優(yōu)于H?O?組（8.08%）。此外，水凝膠顯著增強了人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的血管生成能力，分支點數(shù)量是H?O?組的2倍（圖4E）。免疫熒光（圖4F）和蛋白質(zhì)印跡分析（圖4G）表明，水凝膠通過Ru@allomelanin納米顆粒催化H?O?分解為氧氣，有效減輕了細胞缺氧并降低了HIF-1α表達。

圖4 RGH? 水凝膠體外對 ROS 中和、血管生成及緩解缺氧的影響。（A, B）RS1（A）和 RAW264.7（B）細胞在含水凝膠和 H?O? 溶液中的存活率；（C）通過 DCFH-DA 評估水凝膠清除細胞內(nèi) ROS 的能力；（D）劃痕實驗中 RS1 細胞遷移的延時照片（劃痕前后 24 小時）；（E）不同治療方法下的血管形成圖像；（F）通過免疫熒光染色評估 HIF-1α 表達；（G）通過蛋白質(zhì)印跡分析定量巨噬細胞中的 HIF-1α 蛋白

（5）RGH2水凝膠對巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究

巨噬細胞通常會分化為修復性M2表型或促炎性M1表型，本研究以脂多糖(LPS)和干擾素-γ(IFN-γ)作為比較基準，評估了RGH2水凝膠對RAW264.7細胞的影響。首先，通過用異硫氰酸熒光素修飾的鬼筆環(huán)肽染色F-肌動蛋白來追蹤處理后細胞形態(tài)的變化，同時分別使用CD86/CD206標記物檢測M1和M2巨噬細胞。如圖5A所示，在24小時內(nèi)，M1群中的RAW264.7巨噬細胞呈現(xiàn)出類似偽足的延伸，而M2群中的巨噬細胞則呈現(xiàn)圓形形態(tài)，這表明細胞向M2表型極化轉(zhuǎn)變。在炎癥環(huán)境下，CD206（M2型標記物）和CD86（M1型標記物）的免疫熒光標記證實了巨噬細胞的極化（圖5B）。流式細胞術(shù)分析（圖5C）顯示，與基準組相比，使用RGH2水凝膠治療后，CD206陽性（M2型）巨噬細胞顯著增加，而CD86陽性（M1型）巨噬細胞減少。此外，通過蛋白質(zhì)印跡法進行蛋白質(zhì)定量（圖5D-5G）顯示，CD206和CD86蛋白表達水平（治療前M1/M2比率為264.6%，治療后降至86.2%）與免疫熒光染色結(jié)果一致，證實了觀察到的趨勢。

圖5 RGH? 水凝膠體外免疫調(diào)節(jié)評價。（A）RAW264.7 巨噬細胞的顯微熒光圖像（細胞骨架：TRITC-鬼筆環(huán)肽，細胞核：DAPI）；（B）炎癥刺激 48 小時后，RAW264.7 細胞的 CD206（紅色）和 CD86（綠色）熒光標記圖像；（C）流式細胞術(shù)檢測 CD86? 和 CD206? 水平（48 小時炎癥刺激）；（D）通過蛋白質(zhì)印跡法評估巨噬細胞中的 iNOS、Arg-1 和 CD206 蛋白水平；（E-G）iNOS（E）、Arg-1（F）和 CD206（G）的蛋白表達水平

（6）RNA測序分析評估RGH2水凝膠中的免疫調(diào)節(jié)機制

為了鑒定對炎癥治療至關(guān)重要的基因，研究人員對RAW264.7細胞（歸類為RGH?和M1型）進行了RNA測序和轉(zhuǎn)錄組分析（圖6）。結(jié)果顯示，RGH?處理的細胞與M1型細胞之間存在顯著的基因表達差異。火山圖和熱圖顯示了968個差異表達基因（DEG），其中393個基因上調(diào)，575個基因下調(diào)（圖6A）。弦圖（圖6B）顯示，下調(diào)基因包括IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子。基因集富集分析（GSEA）表明，RGH?處理的細胞中NF-κB和TNF-α信號通路被抑制（圖6C）。基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析進一步揭示了與炎癥相關(guān)的潛在途徑（圖6D和6E）。GO分析顯示，基因表達差異與免疫系統(tǒng)活動、炎癥反應以及細胞對LPS、IL-4和IFN-2的反應密切相關(guān)（圖6E）。KEGG分析顯示，NF-κB、細胞因子-細胞因子受體相互作用、TNF-α、Toll樣和IL-17信號通路在RGH?處理后發(fā)生顯著變化，其中NF-κB和TNF-α通路顯著增強（圖6D）。這些結(jié)果表明，RGH?通過調(diào)節(jié)TNF通路緩解氧化應激和缺氧，促進巨噬細胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)變，為糖尿病足潰瘍（DFU）的治療提供了潛在策略。此外，研究還發(fā)現(xiàn)TNF-α在免疫系統(tǒng)中具有廣泛作用。TNF-α在感染、損傷或刺激下由免疫細胞分泌，激活TNFR1后整合NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，驅(qū)動炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。測序結(jié)果顯示，多個NF-κB相關(guān)基因（如Ptgs2、IL-1β、IL-6、IL-15、TNF、Ccl2、Ccl5、Cxcl1、Cxcl2和Cxcl3）在炎癥誘導下表達上調(diào)（圖6F）。

圖6 RGH? 水凝膠處理后 RAW264.7 細胞的轉(zhuǎn)錄組評估。（A）M1 與 RGH? 組差異基因表達的火山圖；（B）主要 10 個基因及其 GO 富集項的弦圖；（C）免疫系統(tǒng)相關(guān)基因集的 GSEA；（D）對照組與 RGH? 組 DEG 的 KEGG 通路分析；（E）RAW264.7 細胞中 DEG 的 GO 術(shù)語（點大小和顏色分別表示富集基因數(shù)量和 p 值分布）；（F）RGH? 通過 TNF 通路減少巨噬細胞炎癥的影響

（7）RGH2水凝膠對背部皮膚傷口的愈合作用

研究評估了RGH?水凝膠對糖尿病大鼠背部皮膚傷口的愈合能力（圖7）。實驗中，將RGH?水凝膠涂抹在圓形傷口上，分為PBS（陰性對照）、3M水凝膠（陽性對照）和RGH?+NIR組。結(jié)果顯示，接受RGH?和RGH?+NIR治療的傷口在第3天尺寸明顯減小，到第7天，RGH?+NIR組傷口尺寸減少量達其他組的20.68%。至第14天，PBS和3M組傷口面積仍擴大，而RGH?組傷口面積縮小至13.0%，RGH?+NIR組傷口面積縮小至10.8%（圖7B-7D）。組織學分析表明，RGH?+NIR治療的傷口愈合更全面，H&E染色顯示強健的肉芽組織和發(fā)育良好的表皮（圖7E）。Masson染色突出了膠原蛋白沉積（圖7F和7I），免疫組織化學染色顯示RGH?+NIR組IL-6水平顯著降低（圖7G和7J），CD34染色顯示該組新生血管形成最為顯著（圖7H和7K）。這些結(jié)果表明，RGH?+NIR治療顯著促進了傷口愈合和新生血管生成。

圖7 RGH? 對背部皮膚傷口愈合效果的評估。（A）傷口形成和愈合過程的示意圖；（B）不同藥物處理的糖尿病大鼠全層皮膚傷口圖像（PBS、3M、RGH? 和 RGH?+NIR）；（C）傷口愈合階段說明；（D）不同組糖尿病大鼠背部傷口大小的定量分析；（E）皮膚切片的 H&E 染色圖像；（F）第 14 天傷口區(qū)域的 Masson 染色；（G, H）患處大鼠皮膚組織的組織學分析（IL-6 染色：G，CD34 染色：H）；（I）糖尿病傷口中膠原蛋白積累的定量數(shù)據(jù)；（J, K）糖尿病傷口中 IL-6（J）和 CD34（K）的平均熒光強度評估

(8) RGH2水凝膠對DFU傷口的愈合作用

研究進一步評估了RGH?水凝膠對大鼠糖尿病足潰瘍（DFU）傷口愈合的影響（圖8）。實驗中，使用活檢穿刺器在大鼠足部制造直徑為5毫米的圓形傷口，并涂抹50毫克測試樣本。隨后對傷口部位進行808 nm NIR照射（0.5 W/cm2，5分鐘），溫度升至約44.6°C。結(jié)果顯示，接受RGH?和RGH?+NIR治療的組傷口愈合速度更快（圖8B）。到第7天，3M水凝膠組傷口面積為41.7%，PBS組為45.5%，而RGH?+NIR組傷口幾乎完全閉合，殘留傷口面積僅為15.6%（圖8C和8D）。

組織學分析表明，RGH?+NIR組的愈合效果顯著優(yōu)于對照組。H&E染色（圖8E）顯示，RGH?+NIR組再生皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，包括完全修復的上皮層和真皮層，且新血管增加。Masson染色（圖8F和8I）顯示，RGH?+NIR組膠原纖維排列密集且整齊，表明膠原沉積增強。IL-6免疫熒光染色（圖8G和8J）顯示，RGH?+NIR組炎癥期較短，IL-6表達降低。CD34染色（圖8H和8K）顯示，RGH?+NIR組新生血管增殖顯著高于其他組，有助于傷口愈合。

圖8 RGH? 水凝膠對糖尿病大鼠 DFU 創(chuàng)面愈合的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用。（A）傷口誘導及愈合軌跡示意圖；（B）不同治療組大鼠 DFU 進展圖像；（C）DFU 傷口愈合階段圖解（比例尺：5 mm）；（D）不同 DFU 類別傷口尺寸的數(shù)值評估；（E, F）第 21 天 DFU 患處的組織病理學檢查（H&E 染色：E，Masson 染色：F）；（G, H）DFU 傷口組織切片中 IL-6（G）和 CD34（H）的免疫熒光分析；（I）DFU 傷口中膠原蛋白積累的定量分析；（J, K）DFU 傷口中 IL-6（J）和 CD34（K）的平均熒光強度評估