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針對上述問題，南昌大學羅軍研究團隊受到藍藻光合作用供氧特性及其在生物醫(yī)學領域的潛在應用啟發(fā)，開發(fā)了一種工程化免疫調(diào)節(jié)藍藻囊（siRNA@Cyanzyme），用于脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱功能障礙的綜合治療。該系統(tǒng)通過光合作用持續(xù)供氧，逆轉(zhuǎn)M1型小膠質(zhì)細胞極化，減少促炎因子釋放，并通過MnO2@ZIF-8納米酶清除過量活性氧，降低氧化應激。同時，該系統(tǒng)顯著提高了siRNA-ACSL4的遞送效率，抑制神經(jīng)元鐵死亡，恢復抑制性與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的平衡，從而改善膀胱功能障礙。實驗結(jié)果表明，siRNA@Cyanzyme能夠有效調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，抑制炎癥反應，減少神經(jīng)元損傷，并通過單細胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示了其在微膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元相互作用中的核心調(diào)控機制。該研究為脊髓損傷引發(fā)的神經(jīng)源性膀胱功能障礙提供了一種創(chuàng)新的治療策略，相關(guān)成果于2025年3月21日以《Effect of Engineered Cyanobacterial Capsules on a Neurogenic Bladder after Spinal Cord Injury》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c14140）。

圖1 工程化藍藻膠囊的結(jié)構(gòu)和功能示意圖

（1）脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱患者的鐵死亡

為了進一步闡明脊髓損傷后神源性膀胱的發(fā)生和發(fā)展機制，該研究收集了符合納入和排除標準的脊髓損傷患者和對照受試者的血清樣本，并分析了分離出的血清外泌體的組成和遺傳特征。在從兩組受試者采集血液后，通過超速離心提取外泌體（圖2a）。TEM用于觀察外泌體的粒徑（大約80-100 nm）和形態(tài)（圖2b）。小RNA測序和分析顯示，與對照組相比，共有9個miRNA表達下調(diào)，22個miRNA表達增加（圖2c）。KEGG通路富集分析表明，谷胱甘肽代謝、神經(jīng)凋亡、與神經(jīng)免疫微環(huán)境相關(guān)的通路以及與神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的通路（如GABA通路）的活性發(fā)生了顯著變化（圖2d）。因此，作者預測調(diào)節(jié)鐵死亡可能對SCI后的神經(jīng)源性膀胱具有治療潛力，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫微環(huán)境來影響GABA通路可能在SCI后的神經(jīng)源性膀胱中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，作者構(gòu)建了一個攜帶siRNA-ACSL4的工程化免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，siRNA-ACSL4是鐵死亡的一個關(guān)鍵貢獻者和調(diào)節(jié)者，以確定調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫微環(huán)境的機制，并有效減少神經(jīng)細胞的鐵死亡，以解決SCI后的神經(jīng)源性膀胱問題。

圖2 臨床樣本分析。（a）外泌體收集及小 RNA 測序和分析示意圖。（b）外泌體的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。標尺=100 納米。（c）小 RNA 的測序和聚類分析。（d）血清外泌體的 KEGG 富集分析（n≥3）

（2）siRNA@Cyanzyme 的合成與表征

采用水熱法合成了ZIF-8納米顆粒。圖3a中的TEM圖像顯示，MnO₂ NPs均勻分布在整個ZIF-8殼層基質(zhì)中。通過XPS（圖3b）進一步驗證了MnO2的存在。MnO₂@ZIF-8的EDS映射圖像也證明了成功制備（圖3c,d）。海洋藍藻PCC7942，一種淡水光合微生物，具有光合作用和良好的生物相容性。通過強多價金屬-酚類復合物與藍藻表面的NPs結(jié)合，阻止MnO₂@ZIF-8的內(nèi)化，從而形成納米酶外骨骼封裝的藍藻Cyanzyme。最后通過熒光標記的MnO₂@ZIF-8的共聚焦掃描激光顯微鏡和瓊脂糖凝膠電泳（圖3f）進一步證實了siRNA@Cyanzyme的成功制備。

圖3 Cyanzyme的制備和表征。（a）MnO₂@ZIF-8的TEM圖像。刻度尺=150 nm?？潭瘸?40 nm。（b）MnO₂@ZIF-8的XPS 光譜。（c）MnO₂@ZIF-8的EDS光譜。（d）MnO₂@ZIF-8的元素映射?？潭瘸?100 nm。（e）Cyanzyme的SEM圖像。刻度尺=1 μm。（f）siRNA@Cyanzyme 的CLSM圖像?？潭瘸?60 μm。（g）Cyanzyme氧光合作用示意圖。（h）Cyanzyme、藍藻和H₂O的氧氣釋放曲線。（i）Cyanzyme活性（紅色=光照，白色=黑暗處理）。（j）Cyanzyme的ROS清除活性示意圖。（k）Cyanzyme和藍藻的SOD樣活性。（l）Cyanzyme的OH、O^2–和H₂O₂清除能力的ESR光譜分析

（3）氧光合作用和氰酶的CAT/SOD樣催化活性

圖3g展示了氰酶進行氧光合作用示意圖。隨后通過便攜式溶解氧儀分析了氰酶的氧釋放情況（圖3h）。在光照條件下，氰酶組表現(xiàn)出強烈的光合作用活性，其活性與原始藍藻相似。確認了藍藻囊在紅光（660 nm）照射和黑暗條件下的活性，并監(jiān)測了溶解氧的濃度（圖3i）。SCI后過量ROS的產(chǎn)生會導致神經(jīng)元死亡，阻礙神經(jīng)功能的恢復。因此，清除ROS對于SCI后的恢復至關(guān)重要。圖3j展示了ROS清除過程的示意圖。與NBT孵育后，對照組混合溶液的吸光度顯著高于藍藻囊組（圖3k）。隨后評估了Cyanzyme組中催化H₂O₂轉(zhuǎn)化為H₂O和O₂的CAT活性。藍藻產(chǎn)生的CAT活性可能應對觀察到的CAT類催化活性。在ESR光譜中，對應Cyanzyme組的峰強度顯著降低（圖3m）。值得注意的是，沒有觀察到羥基自由基的峰，這表明·OH的產(chǎn)生可以忽略不計。

（4）工程藍藻膠囊在體外保護細胞的能力

小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間的相互作用對于脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的機制至關(guān)重要（圖4a）。以大鼠小膠質(zhì)細胞（RM）、大鼠嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）評估Cyanzyme的影響，發(fā)現(xiàn)Cyanzyme表現(xiàn)出良好的安全性（圖4b）。藍藻對免疫細胞中的促炎表型具有抑制作用（圖4c）。流式細胞術(shù)細胞免疫熒光均表明，藍藻在光照條件下促進了從M1到M2的轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為M1標記物減少和M2標記物CD206表達增加（圖4d,e）。發(fā)現(xiàn)MnO₂@ZIF-8消除了ROS并抑制了細胞凋亡，而包裹MnO₂@ZIF-8的Cyanzyme效果更佳（圖4f）。

建立了不同的組別，并向 PC12 細胞中遞送siRNA-ACSL4或siRNA@Cyanzyme，以通過共聚焦顯微鏡分析siRNA-ACSL4遞送的效果。六小時后，與單siRNA組相比，siRNA@Cyanzyme組中大部分紅色點出現(xiàn)在細胞質(zhì)中，一些出現(xiàn)在細胞核中。siRNA@Cyanzyme組的熒光強度在第12小時增加（圖4i,j）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，H₂O₂刺激誘導細胞發(fā)生鐵死亡，導致鐵死亡標記物谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）減少和ACSL4表達增加。用siRNA@Cyanzyme處理的組別ACSL4表達顯著降低，同時GPX4水平升高（圖4g）。此外，PCR結(jié)果證實了Cyanzyme的高遞送效率，降低了ACSL4的表達（圖4h）。

圖4 siRNA@Cyanzyme系統(tǒng)介導的巨噬細胞與神經(jīng)元相互作用。（a）小膠質(zhì)細胞誘導神經(jīng)細胞發(fā)生鐵死亡的示意圖。（b）不同濃度Cyanzyme對RM、PC12細胞和HUVECs細胞活力的定量分析。（c）小膠質(zhì)細胞形態(tài)的普通顯微鏡示意圖。（d）流式細胞術(shù)分析炎癥相關(guān)因子，并定量分析炎癥因子陽性細胞的相對數(shù)量。（e）免疫熒光染色顯示iNOS表達情況。細胞核 = 藍色，iNOS = 紅色。（f）PC12細胞的ROS和凋亡檢測。ROS=綠色，細胞核=藍色，凋亡=紅色。（g）WB分析鐵死亡因子（包括ACSL4和GPX4）的表達，并定量分析各組鐵死亡因子陽性細胞的相對數(shù)量。（h）通過PCR檢測ACSL4的mRNA表達。（i,j）免疫熒光用于評估siRNA在多個時間點的遞送過程。細胞核=藍色，siRNA=紅色

（5）siRNA@Cyanzyme 降低脊髓損傷后的炎癥反應并恢復脊髓和膀胱的功能

建立了脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的體內(nèi)模型（圖5a）。使用小動物活體成像系統(tǒng)分析了熒光標記的siRNA-ACSL4在動物體內(nèi)的代謝情況（圖5b）。結(jié)果顯示，脊髓能夠在早期裝載siRNA，且siRNA@Cyanzyme組的熒光水平維持時間更長。為了進一步評估siRNA@Cyanzyme恢復脊髓功能的能力，使用Basso、Beattie和Bresnahan評分在治療期間評估脊髓功能，Basso鼠類量表（BMS）評分在第14天開始顯著不同，siRNA@Cyanzyme組表現(xiàn)出強烈的用腳掌站立的效果，運動時軀干穩(wěn)定（圖5c-d）。

為了評估siRNA@Cyanzyme對膀胱功能的恢復效果，隨后進行了膀胱超聲檢查。siRNA@Cyanzyme治療組的液體潴留量顯著減少，逼尿肌和外部括約肌之間的協(xié)同作用得到改善，排尿順暢，表明膀胱功能得到恢復（圖5e）。對膀胱進行了H&E染色病理分析，經(jīng)siRNA@Cyanzyme治療后，膀胱壁的炎癥逐漸減少，纖維化得到緩解（圖5f）。多重免疫熒光染色顯示siRNA@Cyanzyme治療顯著增加了抗炎標記物CD206的表達，并減少了促炎標記物iNOS的表達（圖5g）。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明siRNA@Cyanzyme治療調(diào)節(jié)了脊髓鐵死亡，誘導GABA能神經(jīng)元再生，恢復了興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)平衡，恢復了膀胱功能。

圖5 siRNA@Cyanzyme 系統(tǒng)在體內(nèi)的功能。（a）建立脊髓和膀胱模型的動物處理流程圖。（b）在不同時間點接受siRNA-ACSL4或siRNA@Cyanzyme處理的中小動物活體圖像（1=脊髓，2=心臟，3=肝臟，4=脾臟，5=肺臟，6=雙腎臟）。（c）比較各組之間的運動功能評分，包括BBB評分和BMS評分。（d）大鼠行為表達圖。（e）每組在不同時間點的膀胱超聲圖像。（f）膀胱的H&E染色。（g）脊髓的iNOS/CD206免疫熒光染色。CD206=綠色，iNOS=紅色

（6）siRNA@Cyanzyme 逆轉(zhuǎn)脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱介導的脊髓鐵死亡并促進GABA能神經(jīng)元功能恢復

通過臨床途徑富集和體外分析，驗證了siRNA@Cyanzyme是否能夠抑制SCI后的神經(jīng)元鐵死亡，從而促進膀胱功能的恢復。TEM結(jié)果顯示，與模型組相比，治療組的鐵死亡顯著減少（圖6a），這一結(jié)果與Western blot結(jié)果一致（圖6b,c）。GABA能神經(jīng)元功能障礙會導致抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)活性之間的失衡。siRNA@Cyanzyme通過增加GABA的表達恢復了膀胱功能。檢測了siRNA@Cyanzyme對脊髓神經(jīng)元中GABA相關(guān)蛋白表達的影響（圖6b,d）。通過多重組織免疫熒光進一步檢測了GAD2和vGLUT2的表達。結(jié)果表明，siRNA@Cyanzyme治療組GABA相關(guān)蛋白的表達增加（圖6e）。

圖6 siRNA@Cyanzyme 在體內(nèi)的初步機制。（a）各組的電子顯微鏡圖像。（b）鐵死亡因子和GABA相關(guān)表達的Western blot分析。（c）鐵死亡因子表達的量化。（d）GABA相關(guān)表達的量化。（e）GAD2的免疫熒光染色和GABA相關(guān)蛋白表達增加。目標蛋白（GAD2）=綠色，神經(jīng)元=紅色，DAPI（細胞核）=藍色

（7）神經(jīng)保護作用和抗炎作用的機制探索

使用DESeq2對SCI模型組和siRNA@Cyanzyme治療組之間的差異表達基因進行了分析。我們總結(jié)了數(shù)據(jù)，篩選標準為fold change（FC）大于2且p值小于0.05（圖7a）?；鹕綀D顯示了兩組之間差異表達基因的情況。熱圖顯示了siRNA@Cyanzyme治療后表達變化最大的35個基因（圖7b）。然后，我們對差異表達基因進行了GO通路和KEGG通路富集分析（圖7c,d）。結(jié)果表明，幾種炎癥通路（與神經(jīng)保護相關(guān)的；干細胞的多能性和干性；JAK/STAT3通路；NF-kappaB的負調(diào)節(jié)因子；脂質(zhì)代謝）的活性發(fā)生了顯著變化。JAK-STAT3通路是參與小膠質(zhì)細胞極化和免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)的經(jīng)典通路。

神經(jīng)保護基因表達增加（治療后Mapk10表達相對增加，Gabrg2表達相對增加，Slc32a1表達相對增加；圖7e）表明，siRNA@Cyanzyme治療激活了SCI區(qū)域與神經(jīng)保護相關(guān)的基因通路。與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因Slc17a7和Akr1b7表達減少，表明siRNA@Cyanzyme通過清除ROS和減少神經(jīng)元鐵死亡發(fā)揮治療作用（圖7f）。因此，siRNA@Cyanzyme可能通過JAK-STAT3通路抑制小膠質(zhì)細胞的M1型極化，從而調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，抑制鐵死亡，誘導神經(jīng)保護，并對SCI后的膀胱功能障礙發(fā)揮治療作用（圖7g）。

圖7 siRNA@Cyanzyme的機制探索。（a）基于全轉(zhuǎn)錄組RNA測序的差異表達基因火山圖（灰色：無顯著差異的基因；紅色：上調(diào)基因；藍色：下調(diào)基因）。（b）差異表達基因熱圖。（c、d）差異表達基因的GO通路和KEGG通路富集分析。（e、f）參與神經(jīng)保護和炎癥通路差異表達基因的分析。（g）siRNA@Cyanzyme 治療機制的示意圖

（8）工程化藍藻膠囊對巨噬細胞-神經(jīng)元相互作用的影響

為了研究siRNA@Cyanzyme對細胞相互作用的影響，該研究收集了接受不同治療的鼠脊髓樣本，并進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（圖8a）。圖8b和8c顯示了siRNA@Cyanzyme組和SCI組之間細胞簇的比例，發(fā)現(xiàn)簇1和簇3的比例增加，簇7在治療組中是獨特的（圖8d）。細胞內(nèi)鐵代謝可能與軸突再生過程協(xié)同作用（圖8e）。

隨后通過CellChat分析生成了整合的細胞間通訊網(wǎng)絡，以分析細胞類型之間的顯著配體-受體關(guān)系，從而確定小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間相互作用的強度。圖7f和7g顯示，siRNA@Cyanzyme組中小膠質(zhì)細胞簇7與多種神經(jīng)元類型的相互作用在數(shù)量和強度上均有所增加（圖8h）。在小膠質(zhì)細胞簇7的配體細胞與GABA能神經(jīng)元的受體細胞之間的通訊鏈接中，Negr1、Nrg4、NCAM1、Nrxn1、Nrxn2、Nrxn3和Cntn1在siRNA@Cyanzyme處理后表達上調(diào)（圖8i），基因與神經(jīng)元識別、軸突連接、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和突觸形成密切相關(guān)，揭示了這些11個基因可能是siRNA@Cyanzyme介導的小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間通訊的核心靶點。因此，siRNA@Cyanzyme可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間的相互作用，從而促進SCI引起的神經(jīng)源性膀胱的恢復。

圖8 單細胞轉(zhuǎn)錄組分析。（a）單細胞轉(zhuǎn)錄組測序示意圖。（b）siRNA@Cyanzyme組和SCI組之間整合的單細胞轉(zhuǎn)錄組的UMAP 表示。細胞按簇著色。（c）siRNA@Cyanzyme組和SCI組的總結(jié)圖。（d）按組拆分的微膠質(zhì)細胞簇圖。（e）siRNA@Cyanzyme和SCI組通過微膠質(zhì)細胞的GO術(shù)語。（f）CellChat 確定的差異交互數(shù)量。（g）微膠質(zhì)細胞和脊髓細胞之間的差異交互強度。（h）兩組中差異神經(jīng)元比例。（i）氣泡圖展示了 siRNA@Cyanzyme 介導的通信的核心靶點