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針對上述問題，上海交大張琴團隊研究開發(fā)了一種注射型溫敏水凝膠平臺，結(jié)合藍藻與高原子序元素氧化鑭（La?O?）納米粒。水凝膠局部釋放治療成分，通過三重機制協(xié)同增強放療：①藍藻光合作用產(chǎn)氧，緩解腫瘤缺氧，提高放療敏感性；②La?O?納米粒通過光電效應增強局部輻射劑量，產(chǎn)生活性氧，加重DNA損傷；③聯(lián)合激活GSDMD和GSDME介導的焦亡，突破傳統(tǒng)凋亡耐受。該策略融合“產(chǎn)氧增敏–焦亡誘導”，顯著提升放療效果。該文章于2025年04月26日以《Microbial Photosynthetic Oxygenation and Radiotherapeutic Sensitization Enables Pyroptosis Induction for Combinatorial Cancer Therapy》為題發(fā)表于《AM》上。（DOI: org/10.1002/adma.202503138）

圖1 放射增敏La?O? NPs-藍藻-溫敏水凝膠的合成過程及治療途徑示意圖。（a）放射增敏La?O? NPs-藍藻-溫敏水凝膠的合成過程；（b）放射增敏La?O? NPs-藍藻-溫敏水凝膠對癌細胞死亡的治療途徑

（1）細胞焦亡相關(guān)基因與臨床腫瘤大小的相關(guān)性

焦亡與腫瘤發(fā)展的關(guān)系復雜，既有促進也有抑制作用，具體效果取決于腫瘤類型及微環(huán)境。研究表明，在直腸腺癌（READ）中，GSDMD作為抑癌因子，其高表達與良好預后相關(guān)。GSDME也能抑制結(jié)腸癌細胞生長，但在腫瘤組織中常因啟動子甲基化（65%）而下調(diào)表達。相反，GSDMC在結(jié)腸癌中上調(diào)，促進細胞增殖與腫瘤形成。本研究將臨床結(jié)直腸癌樣本按5 cm大小分組，通過單細胞RNA測序和UMAP降維（圖2a）發(fā)現(xiàn)，小腫瘤中GSDMB、GSDMD、IL-18、CASP11、CASP3及NFKB1等焦亡相關(guān)基因表達顯著高于大腫瘤。此外，炎癥趨化因子CXCL1在小腫瘤中也上升。這些結(jié)果提示焦亡在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中可能具有抑制作用。

圖2 臨床腫瘤差異評估及La?O? NPs與藍藻的表征。（a）不同結(jié)直腸腫瘤樣本中細胞焦亡相關(guān)基因表達譜的UMAP圖；（b）藍藻細胞負染色的Bio-TEM圖像及放大圖像（比例尺：原始圖像5 μm，放大圖像1 μm）；（c）La?O? NPs的暗場TEM圖像；（d）La?O? NPs的明場TEM圖像（比例尺25 nm）；（e）La?O? NPs的La元素映射圖像；（f）C元素映射圖像；（g）O元素映射圖像（比例尺25 nm）；（h）La?O? NPs的SAED圖樣（比例尺2 1/nm）；（i）La?O? NPs的HRTEM圖像及放大圖像（比例尺：原始圖像5 nm，放大圖像1 nm）；（j）La?O? NPs的X射線衍射圖；（k）La?O? NPs的寬掃描、La 3d和O 1s的XPS光譜

（2）藍藻和La?O? NPs-Gel 的制備與表征

通過生物透射電鏡（bio-TEM）結(jié)合負染觀察（圖2b），發(fā)現(xiàn)藍藻呈桿狀，表面有由胞外粘性物質(zhì)（如多糖和蛋白質(zhì)）形成的膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部可見類囊體堆疊。La?O?納米粒子（NPs）通過固相反應法合成，具有形貌均一的特點（圖2c,d），動態(tài)光散射分析顯示粒徑約為145.17 ± 58.49 nm。元素分析確認其包含La、C、O（圖2e–g），SAED圖呈現(xiàn)清晰的六方晶系（圖2h），高分辨率電鏡（HRTEM）顯示0.22 nm的晶面間距，對應 La 的（012）晶面（圖2i）。X射線衍射進一步確認了其晶體結(jié)構(gòu)（圖2j），XPS分析揭示La和O的化學狀態(tài)（圖2k）。為便于加載至可注射熱敏水凝膠中，合成過程中用聚乙二醇修飾La?O? NPs。凍干后的水凝膠呈多孔結(jié)構(gòu)（圖3a），能量色散光譜顯示其含有C、O、Cl、Na元素（圖3b–f）。流變學測試表明，空白水凝膠與La?O? NPs-Gel的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度分別為31.72°C和32.23°C（圖3g,h），在室溫（25°C）下為液態(tài)（圖3i,j），可實現(xiàn)體內(nèi)快速成膠。FTIR證實了水凝膠中殼聚糖的特征峰（1636 cm?1）（圖3k）。體外釋放實驗表明，在pH 5.5下，La?O? NPs釋放更快（圖3l），說明該體系可在腫瘤微酸環(huán)境中實現(xiàn)控釋，減少系統(tǒng)毒性。

圖3 La?O? NPs-Gel的表征。（a）溫敏水凝膠的SEM圖像（比例尺100 μm）及元素映射圖像：（b）C、（c）O、（d）Cl、（e）Na（比例尺100 μm）；（f）溫敏水凝膠中元素比重分布；（g）溫敏水凝膠和（h）La?O? NPs-Gel的儲能模量和損耗模量的溫度依賴性；（i）溫敏水凝膠和（j）La?O? NPs-Gel的儲能模量和損耗模量的時間依賴性；（k）殼聚糖、La?O? NPs、溫敏水凝膠和La?O? NPs-Gel的FTIR光譜；（l）不同pH值下La?O? NPs-Gel中La?O? NPs的釋放比例隨時間變化（數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，n = 3）

（3）藍藻的光合氧合能力

為改善缺氧的腫瘤微環(huán)境并增強放療敏感性，利用便攜式溶解氧（DO）電極測定純藍藻懸液在660 nm激光照射下的溶解氧變化（圖4a）。在20 mW cm?2激光強度下，20分鐘內(nèi)DO濃度最高增加了37 μmol L?1（圖4b）。隨著激光功率從10到30 mW cm?2增加，藍藻的光合產(chǎn)氧能力也增強，在30 mW cm?2時，20分鐘內(nèi)DO上升49 μmol L?1，而在5×10? cells mL?1濃度下，20 mW cm?2激光照射20分鐘，DO上升56 μmol L?1（圖4c）。進一步通過細胞內(nèi)缺氧探針[Ru(dpp)?]Cl?驗證藍藻緩解CT26細胞缺氧的效果。將藍藻懸液和CT26細胞分別在暗處和1% O?低氧艙中處理以排除殘余氧氣后，共孵育并進行激光照射（圖4d）。結(jié)果顯示，僅在藍藻+激光組，[Ru(dpp)?]Cl?紅色熒光顯著降低，與常氧（21% O?）條件下相近（圖4e）。而單獨激光或單獨藍藻處理組仍保持強烈紅色熒光，說明缺氧未緩解。結(jié)果表明，藍藻可通過激光激活的光合產(chǎn)氧有效改善細胞缺氧。

圖4 體外光合放氧。（a）溶解氧水平檢測示意圖；（b）不同激光功率強度下，660 nm激光輻照溶液溶解氧水平變化；（c）不同藍藻濃度下，660 nm激光輻照溶液溶解氧水平變化；（d）不同處理后，[Ru(dpp)?]Cl?染色的CT26細胞的CLSM圖像（比例尺20 μm）；（e）不同處理后，[Ru(dpp)?]Cl?染色的CT26細胞的半定量分析；（f）不同處理后，DCFH-DA染色的CT26細胞的半定量分析（I：對照組，II：La?O? NPs，III：RT組，IV：La?O? NPs + RT組，V：缺氧對照組，VI：缺氧La?O? NPs + RT組，VII：缺氧La?O? NPs + RT + 青色）；（g）不同處理后CT26細胞的ROS水平CLSM圖像（比例尺100 μm）。數(shù)據(jù)以平均值±SD（n = 3）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）分析（**p < 0.01，***p < 0.001）

（4）安全性評價和細胞毒作用

基于藍藻獨特可靠的產(chǎn)氧能力，進一步在CT26小鼠腫瘤細胞中評估藍藻聯(lián)合La?O?納米顆粒（La?O? NPs）與放療的治療效果。首先，通過CCK-8檢測藍藻（最高至3×10? mL?1）和La?O? NPs（最高至400 μg mL?1）的細胞相容性。結(jié)果顯示，低濃度藍藻毒性較低，而La?O? NPs呈劑量依賴性毒性。共聚焦顯微鏡觀察到Cy5.5標記的La?O? NPs被CT26細胞逐步攝取，8 h達峰值。隨后，體外通過CCK-8檢測治療效果。CT26細胞經(jīng)藍藻處理（1×10? mL?1）、激光照射（660 nm, 20 mW cm?2, 15 min）并暴露于La?O? NPs（50 μg mL?1）。常氧下，放療導致細胞活性依時間下降，24 h死亡率21.3%，72 h為47.0%；聯(lián)合La?O? NPs后死亡率顯著上升。相比之下，缺氧細胞放療耐受性強，僅31.5%死亡。藍藻光合產(chǎn)氧聯(lián)合放療在缺氧下顯著提高死亡率至45.2%，加用La?O? NPs后72 h死亡率達79.7%，顯示出出色的放療增敏和殺瘤潛力。

（5）體外ROS生成

活性氧（ROS）可導致細胞內(nèi)DNA氧化損傷，引發(fā)DNA鏈斷裂，進而誘導細胞凋亡、焦亡和壞死等不同形式的細胞死亡。為探究藍藻–La?O? NPs體系的放療增敏機制，使用綠色熒光探針DCFH-DA檢測ROS生成（圖4f、3g）。在常氧條件下，La?O? NPs組的熒光強度低于放療（RT）組，但聯(lián)合RT后，ROS水平較單獨La?O? NPs組提升了3.5倍。其機制可能是：La?O? NPs因高原子序數(shù)增強局部能量沉積，輻射則破壞線粒體功能，共同促進ROS大量生成。然而，在缺氧條件下，RT+La?O? NPs組幾乎失去ROS生成能力，說明氧氣對ROS產(chǎn)生至關(guān)重要。引入藍藻光合產(chǎn)氧后，即使在缺氧環(huán)境下，也能恢復ROS水平至常氧下的程度（圖4f）。結(jié)果表明，藍藻產(chǎn)氧有效緩解腫瘤缺氧，重建ROS介導的放療增敏，為克服缺氧導致的治療抗性提供了新策略。

（6）體外放射治療增敏

利用克隆形成實驗進一步評估輻射引起的細胞損傷，在常氧與低氧（1% O?）條件下培養(yǎng)CT26細胞（圖5a）。低氧組的存活率（SF）明顯高于常氧組，表明缺氧降低了細胞對放療（RT）的敏感性（圖5b）。即使在低濃度（12.5 μg mL?1）下，La?O? NPs也能顯著減少克隆形成，抑制細胞增殖，展現(xiàn)出強放療增敏效果。La?O? NPs與藍藻聯(lián)用時，2 Gy劑量下的SF降至對照組一半，隨放療劑量增加，殺傷效果進一步增強，優(yōu)于單獨La?O? NPs組。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ROS可能通過促進DNA損傷發(fā)揮增敏作用。通過γ-H2AX標記和彗星實驗檢測DNA雙鏈斷裂。常氧下，La?O? NPs+RT組的DNA損傷顯著增加（圖5d）；低氧雖抑制此效應，但藍藻產(chǎn)氧可顯著恢復DNA斷裂（圖5e）。彗星實驗亦顯示了不同氧環(huán)境下DNA損傷的差異（圖5f、4g）。結(jié)果驗證了La?O? NPs的增敏效果及藍藻緩解缺氧的能力。

圖5 體外放射治療療效評估。（a）不同處理后CT26細胞集落形成實驗；（b）不同處理（2、4和6 Gy）后存活分數(shù)；（c）集落形成檢測示意圖；（d）不同處理后γ-H2AX染色的CT26細胞CLSM圖像（比例尺50 μm）；（e）不同處理后γ-H2AX熒光強度的半定量分析（I：對照，II：La?O? NPs，III：RT，IV：La?O? NPs + RT，V：缺氧對照，VI：缺氧La?O? NPs + RT，VII：缺氧La?O? NPs + RT + Cyan）；（f）不同處理后彗星實驗的CLSM圖像（原始圖像比例尺200 μm，放大圖像比例尺50 μm）；（g）不同處理后彗星實驗尾部DNA百分比的半定量分析（I：對照組，II：La?O? NPs，III：RT，IV：La?O? NPs + RT，V：缺氧對照組，VI：缺氧La?O? NPs + RT，VII：缺氧La?O? NPs + RT + 青色）。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（每組n = 3；彗星實驗n = 3生物學重復，每個重復3技術(shù)重復），采用單因素方差分析（ANOVA）分析（*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001）

（7）RNA轉(zhuǎn)錄組分析

為探究La?O? NPs-藍藻平臺在缺氧環(huán)境下的抗癌機制，進行了轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示，La?O? NPs + RT + Cyan組有2298個差異表達基因（DEGs），包括1398個下調(diào)和900個上調(diào)（圖6a-c）。GO分析顯示，該組合上調(diào)了氧化應激相關(guān)通路，抑制了缺氧響應通路，表明藍藻產(chǎn)氧改善了細胞氧合狀態(tài)（圖6d）。此外，炎癥相關(guān)通路如NF-κB信號通路也被顯著激活，提示ROS通過激活NLRP3炎癥小體，促進caspase-1活化，誘導細胞焦亡（圖6e-g）。GSEA分析進一步驗證了炎癥反應增強（圖6e,f），并觀察到與細胞焦亡相關(guān)的基因（如caspase-1、caspase-3、GSDMD、GSDME）明顯上調(diào)（圖6h）?？傮w結(jié)果表明，La?O? NPs + RT + Cyan平臺通過ROS激活NOD樣受體和NF-κB通路，誘導GSDMD/GSDME裂解，形成膜孔并釋放IL-1β，最終引發(fā)腫瘤細胞焦亡。

圖6 不同處理后CT26細胞RNA-seq轉(zhuǎn)錄分析。（a）熱圖、（b）火山圖、（c）直方圖揭示缺氧條件下RT+La?O?NPs+Cyan和PBS處理的CT26細胞中上調(diào)或下調(diào)的基因；（d）缺氧條件下RT+La?O?NPs+Cyan和PBS處理的CT26細胞中差異表達基因的GO分析（BP和MF類別）；（e）差異表達基因的基因集富集分析；（f）典型NF-κB信號轉(zhuǎn)導的GSEA富集圖；（g）基于功能基因交叉的環(huán)形數(shù)值熱圖（A–C：缺氧對照組；D–F：缺氧RT+La?O?NPs+青色組）；（h）功能基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡

（8）體外細胞焦亡

為了進一步明確La?O? NPs + RT + Cyan平臺在缺氧環(huán)境下誘導焦亡的機制，采用Annexin-V/PI染色結(jié)合共聚焦顯微鏡明場成像（圖7a）區(qū)分壞死、凋亡與焦亡。La?O? NPs組細胞出現(xiàn)典型焦亡特征，如細胞腫脹和膜起泡。在常氧下，La?O? NPs + RT組焦亡顯著，而缺氧抑制了該過程，加入藍藻氧合后焦亡恢復接近常氧水平。通過Western blot檢測不同條件下GSDMD與GSDME及其剪切片段（圖7b），發(fā)現(xiàn)La?O? NPs濃度升高促進GSDMD剪切，且放療可增強該效應（圖7c）。高濃度La?O? NPs還促進了GSDME剪切（圖7d），表明平臺可激活經(jīng)典與非經(jīng)典焦亡路徑。進一步分析表明，缺氧降低N-GSDMD與N-GSDME水平（圖7f,g），而藍藻系統(tǒng)可逆轉(zhuǎn)該抑制。NLRP3表達趨勢也支持La?O? NPs經(jīng)ROS-NLRP3-GSDMD途徑誘導焦亡。流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示，La?O? NPs + RT + Cyan組焦亡率達9.6%（圖7i,j），并伴隨凋亡增加，表明藍藻氧合有助于增強細胞死亡與治療效果。

圖7 體外細胞焦亡。（a）CT26細胞放療（6 Gy）72小時后Annexin-V&PI染色的CLSM圖像（粉色箭頭：大氣泡；比例尺：原始圖像100 μm，放大圖像10 μm）；（b）放療后72小時，不同La?O?濃度下GSDMD和GSDME全長及N端片段表達；（c）N-GSDMD和（d）N-GSDME的半定量分析；（e）不同處理后72小時，GSDMD和GSDME表達；（f）N-GSDMD和（g）N-GSDME的半定量分析（I：對照，II：La?O? NPs，III：RT，IV：La?O? NPs + RT，V：缺氧對照，VI：缺氧La?O? NPs + RT，VII：缺氧La?O? NPs + RT + 青色）；（h）RT-La?O? NPs誘導的細胞焦亡形態(tài)示意圖；（i）不同處理后Annexin V-FITC&PI染色的細胞死亡流式分析；（j）細胞焦亡百分比。數(shù)據(jù)以平均值±SD（n = 3）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）分析（**p < 0.01，****p < 0.0001）

（9）體內(nèi)腫瘤放射治療

在動物實驗前，評估了La?O? NPs的溶血性，結(jié)果顯示Cyan + La?O? NPs系統(tǒng)具有良好生物相容性。急性與慢性毒性檢測表明，主要臟器及血液指標無異常。藥代動力學研究發(fā)現(xiàn)，溫敏水凝膠能有效將藥物局限于腫瘤區(qū)，注射8天后熒光強度仍保留41.1%（圖8a,b）。這種緩釋行為歸因于水凝膠的膨脹擴散機制和殼聚糖的可降解性，減少了系統(tǒng)暴露，延長了局部藥物作用時間。

圖8 藥物代謝分析。（a）BALB/c小鼠CT26腫瘤異種移植瘤瘤內(nèi)注射La?O?納米顆粒和La?O?納米顆粒-凝膠后的體內(nèi)熒光成像；（b）瘤內(nèi)注射藥物滯留率的半定量分析。數(shù)據(jù)以平均值±標準差（n=3）表示

在LLC和CT26移植瘤模型中評估了治療效果。各組小鼠體重穩(wěn)定（圖9b, 10b）。La?O? NPs-Gel單獨即可抑制腫瘤生長，聯(lián)合藍藻后進一步增強放療增敏作用，14天后腫瘤體積明顯縮?。▓D9c–e, 10c–e）。La?O? NPs-Gel + RT + Cyan組的抑瘤率分別達94.68%和95.48%，優(yōu)于其他組。肉眼觀察也驗證了藍藻光合作用緩解缺氧、提升增敏效果（圖9f, 10f）。

組織學分析顯示主要器官無明顯損傷（圖9g, 10g）。腫瘤切片Ki-67和TUNEL染色表明腫瘤增殖減少、凋亡增加（圖9h,k, 10h,k）。RT + Cyan + La?O? NPs-Gel組中N-GSDMD和N-GSDME表達上升，且IL-6、IL-1β釋放增加（圖9i–m, 10i–m），提示有效誘導焦亡。NLRP3上調(diào)進一步驗證了焦亡機制（圖9n, 10n）。綜合證實該系統(tǒng)通過雙重增敏增強抗腫瘤效果。

圖9 RT-藍藻-La?O? NPs-Gel體系體內(nèi)抗CT26腫瘤療效。（a）生物放射治療與抗腫瘤治療時間示意圖；（b）CT26腫瘤小鼠體重變化曲線（n=6）；（c）各組腫瘤平均重量（n=6）；（d）CT26腫瘤生長曲線（每2天記錄一次，n=6）；（e）不同治療后腫瘤生長曲線（PBS、La?O? NPs-Gel、RT、RT + La?O? NPs-Gel、RT + La?O? NPs-Gel + Cyan，n=6）；（f）各組解剖腫瘤照片（n=6）；（g）治療后第14天小鼠主要器官H&E染色（比例尺200 μm）；（h）Ki-67、（i）IL-1β、（j）IL-6免疫組織化學染色（比例尺50 μm，n=3）；（k）TUNEL、（l）N-GSDMD、（m）N-GSDME、（n）NLRP3免疫熒光染色（比例尺50 μm，n=3）。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，采用單向方差分析（ANOVA）分析（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）

圖10 RT-藍藻-La?O? NPs-Gel體系體內(nèi)抗LLC腫瘤療效。（a）生物放射治療與抗腫瘤治療時間示意圖；（b）LLC腫瘤小鼠體重變化曲線（n=6）；（c）各組腫瘤平均重量（n=6）；（d）LLC腫瘤生長曲線（每2天記錄一次，n=6）；（e）不同治療后腫瘤生長曲線（PBS、La?O? NPs-Gel、RT、RT + La?O? NPs-Gel、RT + La?O? NPs-Gel + Cyan，n=6）；（f）各組解剖腫瘤照片（n=6）；（g）治療后第14天小鼠主要器官H&E染色（比例尺200 μm，n=3）；（h）Ki-67、（i）IL-1β、（j）IL-6免疫組織化學染色（比例尺50 μm，n=3）；（k）TUNEL、（l）N-GSDMD、（m）N-GSDME、（n）NLRP3免疫熒光染色（比例尺50 μm，n=3）。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，采用單向方差分析（ANOVA）分析（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）