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針對(duì)上述問(wèn)題，來(lái)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院沈彬的研究團(tuán)隊(duì)提出了一種多重Pickering乳液模板法來(lái)制備多孔、小尺寸的微凝膠。該微凝膠由HA和PSBMA組成，通過(guò)多重Pickering乳液法制備，具高載藥量、良好注射性和優(yōu)異潤(rùn)滑性能。表面接枝軟骨特異性肽SP，實(shí)現(xiàn)靶向遞送miR-140，克服其穩(wěn)定性和非靶向性問(wèn)題，展現(xiàn)出潤(rùn)滑與控釋的協(xié)同治療潛力，為新一代OA載藥系統(tǒng)提供新思路。該文章于2025年5月5日以《Advanced Injectable Microgels: Porous, Small-Sized, and Lubricated Systems for Targeted Synergistic Therapy in Osteoarthritis》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202418951）。

圖1 miR-140@HS-SP微凝膠的制備原理及制備示意圖

（1）利用噬菌體展示技術(shù)篩選軟骨靶向肽

根據(jù)噬菌體篩選原理，先將噬菌體庫(kù)與軟骨細(xì)胞共孵育，去除非特異性結(jié)合后，用甘氨酸洗脫特異性結(jié)合的噬菌體并擴(kuò)增，隨后重復(fù)篩選三輪以富集高親和力噬菌體（圖2a）。每輪噬菌體回收量遞增，第二輪較第一輪富集約20倍，第三輪趨于飽和，篩選結(jié)束。從第三輪中隨機(jī)挑選20個(gè)藍(lán)斑噬菌體測(cè)序，獲得15條插入序列，推導(dǎo)出4種氨基酸序列（表1），其中HPTISGPANPAFGGG（HP）頻率最高（8次）。ELISA結(jié)果顯示，HP和SPSLIYFPKSIYGGG（SP）序列噬菌體對(duì)軟骨細(xì)胞親和力最高（圖2c），因此選用HP和SP用于后續(xù)研究。

圖2（a）噬菌體展示技術(shù)示意圖；（b）藍(lán)色噬菌體斑塊插入的DNA序列；（c）陽(yáng)性噬菌體與軟骨細(xì)胞的ELISA檢測(cè)；（d）熒光光譜、（e）流式細(xì)胞術(shù)、（f）流式定量分析不同肽段與軟骨細(xì)胞的親和力；（g）熒光光譜、（h）流式細(xì)胞術(shù)、（j）流式定量分析SP肽段與不同細(xì)胞的親和力（比例尺200 μm）

（2）HS-SP 多孔微凝膠的制備與表征

為實(shí)現(xiàn)可注射、高效負(fù)載和持續(xù)釋放 miR-140，采用多重 Pickering 乳液模板法制備小尺寸多孔微凝膠。將 HA、SBMA、Laponite 和光引發(fā)劑溶于水作為連續(xù)相，液體石蠟為分散相，形成粒徑均一的穩(wěn)定 O/W 初乳。再次加入石蠟制備 O/W/O 乳液，呈現(xiàn)獨(dú)特多相結(jié)構(gòu)（圖 3a），優(yōu)于傳統(tǒng) W/O 乳液（圖 3b）。在紫外光照下，SBMA 交聯(lián)生成粒徑約 20 μm、分布均勻的多孔 HS 微凝膠（圖 3c、d），而 W/O 所得微凝膠結(jié)構(gòu)不均（圖 3e）。隨后將軟骨靶向肽 SP 接枝至微凝膠表面，形成 HS-SP，熒光顯微鏡和 EDS 證實(shí)接枝成功（圖 3f、g）。

圖3（a）由多種Pickering O/W/O乳液制備的微凝膠（比例尺100 μm）；（b）由多種Pickering W/O乳液制備的微凝膠（比例尺100 μm）；（c）使用O/W/O和W/O乳液制備的HS微凝膠的粒度分布；（d）由O/W/O乳液制備的HS微凝膠的SEM圖像（比例尺10 μm）；（e）由W/O乳液制備的HS微凝膠的SEM圖像（比例尺10 μm）；（f）HS-SP微凝膠的光學(xué)和熒光顯微鏡圖像（比例尺100 μm）；（g）HS-SP微凝膠的SEM圖像及EDS分析（比例尺10 μm）

與微流控相比，多重 Pickering 乳液法可制備粒徑小、結(jié)構(gòu)均勻、比表面積大的多孔微凝膠，顯著提升 miR-140 的負(fù)載能力（圖4a）。該微凝膠吸水率超4000%，溶脹速率快，優(yōu)于以往報(bào)道（圖4b）。通過(guò)噬菌體展示技術(shù)將 SP 肽接枝于表面，形成 HS-SP 微凝膠，熒光顯微鏡和 EDS 驗(yàn)證接枝成功。流變學(xué)與力學(xué)測(cè)試顯示接枝過(guò)程對(duì)微凝膠機(jī)械性能影響微弱，其較低強(qiáng)度有助于體內(nèi)降解和藥物釋放。冷凍干燥后，miR-140 可通過(guò)物理吸附方式負(fù)載至微凝膠中（miR-140@HS-SP），熒光圖像顯示其在微凝膠內(nèi)均勻分布（圖4c）。此外，HS-SP 微凝膠增強(qiáng)潤(rùn)滑性能，摩擦系數(shù)從 0.085 降至 0.073（圖4d），歸因于 HA 與 PSBMA 的水化層形成，即便磨損也能持續(xù)暴露潤(rùn)滑界面。為驗(yàn)證生物相容性，采用活/死染色與 CCK-8 分析 HS-SP 對(duì)軟骨細(xì)胞的影響。第1、3、5天檢測(cè)顯示細(xì)胞活性良好，形態(tài)正常，與對(duì)照組無(wú)顯著差異（圖4e-h）。細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增加，增殖速率正常，表明該微凝膠具備良好的生物相容性，適合多種生物應(yīng)用。

圖4（a）HS-SP微凝膠的溶脹性能；（b）不同微凝膠溶脹性能比較，數(shù)據(jù)點(diǎn)編號(hào)對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)編號(hào)；（c）miR-140@HS-SP微凝膠的熒光顯微鏡圖像（比例尺100 μm）；（d）HS-SP微凝膠的摩擦曲線(xiàn)；（e）共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞在第1、3和5天的活/死染色（比例尺200 μm）；（f）活/死染色定量熒光強(qiáng)度；（g）細(xì)胞活力；（h）CCK-8檢測(cè)第1、3和5天軟骨細(xì)胞活力結(jié)果，數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，n≥3，P值通過(guò)t檢驗(yàn)計(jì)算，ns表示p>0.05

（3）miR-140在軟骨細(xì)胞中的靶向遞送和細(xì)胞內(nèi)功能

炎癥和氧化應(yīng)激在OA發(fā)病中至關(guān)重要。本研究以IL-1β模擬炎癥微環(huán)境，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和線(xiàn)粒體損傷，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估m(xù)iR-140的抗凋亡和清除ROS的作用。結(jié)果顯示，IL-1β顯著提高ROS水平（FITC均值=136.3）并增加細(xì)胞凋亡比例（11.8%），表明模型構(gòu)建成功。miR-140顯著抑制ROS產(chǎn)生（MD = -53.13，p = 0.0004）并減少凋亡（MD = -5.8，p < 0.0001），顯示其具有抗氧化和細(xì)胞保護(hù)作用。此外，OA引發(fā)的線(xiàn)粒體功能障礙可促進(jìn)ROS過(guò)量生成，加劇細(xì)胞損傷。JC-1染色結(jié)果顯示，OA組線(xiàn)粒體膜電位降低（JC-1 Mono/Agg = 1.421），miR-140處理顯著恢復(fù)膜電位（MD = -0.61，p < 0.0001），提示其可改善線(xiàn)粒體功能、降低ROS水平并抑制凋亡，從而延緩OA進(jìn)程。

圖5（a、b）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡；（c、d）軟骨細(xì)胞的活性氧（ROS）；（e）軟骨細(xì)胞線(xiàn)粒體的透射電子顯微鏡圖像；（f）JC-1法檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位；（g）JC-1單體/JC-1聚集體的定量分析（比例尺100 μm）。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，n≥3，P值通過(guò)t檢驗(yàn)計(jì)算，*** p < 0.001

盡管miR-140可通過(guò)清除ROS和改善線(xiàn)粒體功能延緩OA進(jìn)展，但其存在攝取率低、非靶向聚集、半衰期短等局限，因此需借助微凝膠進(jìn)行保護(hù)與緩釋。實(shí)驗(yàn)表明，微凝膠能實(shí)現(xiàn)miR-140的緩釋?zhuān)▓D6a），其中SP肽修飾賦予其靶向性。與miR-140和miR-140@HS相比，miR-140@HS-SP在軟骨細(xì)胞周?chē)憩F(xiàn)出更強(qiáng)的熒光聚集，顯示出更佳的遞送效率（圖6b）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)聚焦于miR-140@HS-SP組。OA破壞細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）平衡，影響Col2和Aggrecan等關(guān)鍵成分合成，并通過(guò)MMP13和ADAMTS5介導(dǎo)降解。miR-140@HS-SP與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，顯著上調(diào)Col2、Aggrecan表達(dá)，抑制MMP13和ADAMTS5（圖6c-j），表明其能增強(qiáng)合成代謝、抑制分解代謝，具有治療OA的潛力。

圖6（a）miR-140靶向轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的效果（比例尺200 μm）；（b）miR-140@HS-SP緩釋miR-140；（c~f）免疫熒光檢測(cè)軟骨細(xì)胞中聚集蛋白聚糖、Col2、ADAMTS5和MMP13的表達(dá)（比例尺200 μm）；（g~j）這些蛋白的積分熒光密度統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，n≥3，P值通過(guò)單因素方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)計(jì)算，ns p >0.05，* p <0.05，**** p <0.0001

（4）骨關(guān)節(jié)炎的體內(nèi)治療效果

通過(guò)DMM手術(shù)建立OA大鼠模型，術(shù)后第1周將動(dòng)物分為4組，每周進(jìn)行關(guān)節(jié)腔注射（OA、miR-140、HS-SP、miR-140@HS-SP）。第4和第8周步態(tài)分析顯示，miR-140@HS-SP組步行速度和步幅顯著提高，運(yùn)動(dòng)障礙系數(shù)降低，步態(tài)恢復(fù)接近正常。影像學(xué)分析表明，miR-140@HS-SP治療可維持較寬的關(guān)節(jié)間隙，減少游離體數(shù)量，并改善軟骨下骨結(jié)構(gòu)，包括骨密度升高、小梁數(shù)量與厚度增加、骨間隙減少。MRI進(jìn)一步證實(shí)其軟骨修復(fù)效果。結(jié)果表明，miR-140@HS-SP可有效減緩OA進(jìn)展，具有良好的軟骨保護(hù)和治療潛力。

圖7（a）步態(tài)分析；（b）步行周期、步行速度、步幅和運(yùn)動(dòng)不平衡系數(shù)的定量分析；（c）大鼠膝關(guān)節(jié)的3D CT重建；（d）膝關(guān)節(jié)骨贅和游離體的定量分析；（e）軟骨下骨的微觀結(jié)構(gòu)分析及熱圖；（f）骨密度的定量分析；（g）骨體積比例、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度和骨小梁間隙的定量分析。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，n≥3，P值通過(guò)單因素方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)計(jì)算，ns p >0.05，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001

除影像學(xué)外，采用H&E和番紅綠染色評(píng)估軟骨組織變化。正常組軟骨結(jié)構(gòu)完整，ECM染色均勻，而OA組軟骨嚴(yán)重?fù)p傷、結(jié)構(gòu)紊亂，染色減弱（圖8a、b）。OA組軟骨厚度顯著減少，OARSI評(píng)分升高；miR-140@HS-SP治療顯著改善軟骨形態(tài)，厚度增加，評(píng)分下降（圖8d）。免疫組織化學(xué)顯示，miR-140@HS-SP組Col2和Aggrecan表達(dá)水平升高（圖8e–h），提示ECM合成增強(qiáng)?；そM織染色結(jié)果還表明，治療組中M1型巨噬細(xì)胞減少，M2型增加，M1/M2比值下降，進(jìn)一步證明miR-140@HS-SP可有效減緩軟骨退變、抑制OA進(jìn)展。

圖8（a）H&E染色；（b）番紅O-固綠染色；（c）大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨厚度測(cè)量結(jié)果；（d）大鼠膝關(guān)節(jié)OARSI評(píng)分；（e）Col2免疫組化染色；（f）關(guān)節(jié)軟骨中Col2陽(yáng)性區(qū)域的定量分析；（g）Aggrecan免疫組化染色結(jié)果；（h）關(guān)節(jié)軟骨中Aggrecan陽(yáng)性區(qū)域的定量分析（比例尺250 μm）。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，n≥3，P值通過(guò)單因素方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)計(jì)算，ns p >0.05，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001

（5）通過(guò)比較差異表達(dá)的mRNA可以揭示骨關(guān)節(jié)炎治療的機(jī)制

轉(zhuǎn)錄組分析揭示 miR-140@HS-SP 在促進(jìn)軟骨再生和ECM合成中的作用。Pearson相關(guān)性和主成分分析確認(rèn)各組數(shù)據(jù)具有良好重復(fù)性（R2>0.95，n=3）。差異基因分析顯示，miR-140@HS-SP組與OA組相比，上調(diào)131個(gè)基因，下調(diào)1010個(gè)，表明其聯(lián)合效應(yīng)顯著（圖9a）。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，OA組下調(diào)基因主要涉及ECM合成、炎癥調(diào)節(jié)和細(xì)胞衰老（圖9bI）。miR-140組上調(diào)ECM相關(guān)和軟骨細(xì)胞增殖基因（圖9bII），HS-SP組影響透明質(zhì)酸合成及抗衰老通路（圖9bIII），miR-140@HS-SP組則同時(shí)抑制炎癥和衰老、促進(jìn)軟骨細(xì)胞功能（圖9bIV）。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和熱圖分析進(jìn)一步證實(shí)，miR-140@HS-SP通過(guò)協(xié)同作用調(diào)控ECM組織、細(xì)胞增殖、炎癥與衰老過(guò)程（圖9c）。盡管具體機(jī)制尚待驗(yàn)證，但已有數(shù)據(jù)支持其在OA治療中的潛力，后續(xù)研究將進(jìn)一步探究其分子機(jī)制。

圖9（a）miR-140@HS-SP治療OA的機(jī)制研究。OA組與正常組（I）、miR-140組與OA組（II）、HS-SP組與OA組（III）、miR-140@HS-SP組與OA組（IV）差異表達(dá)mRNA的火山圖（p值<0.05且|logFC|>1）；（b）OA組與正常組（I）、miR-140@HS-SP組與OA組（II）的下行GO富集項(xiàng)；miR-140組與OA組（III）、HS-SP組與OA組（IV）的上行GO富集項(xiàng)；（c）熱圖顯示各組中涉及ECM生成、細(xì)胞粘附和遷移、炎癥和細(xì)胞增殖的mRNA差異表達(dá)（I：OA與正常組；II：miR-140與OA組；III：HS-SP與OA組；IV：miR-140@HS-SP與OA組）