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研究背景：

針對(duì)上述問題，中科院長春應(yīng)化所林君通過一步共生法合成了透明質(zhì)酸修飾的鋅銅雙金屬過氧化物（ZCPO@HA）納米顆粒，所得到的納米顆粒展現(xiàn)出了誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡和銅死亡的能力，同時(shí)還能激活環(huán)鳥苷單磷酸-腺苷單磷酸合成酶-干擾素基因刺激因子（cGAS-STING）通路，并與免疫檢查點(diǎn)抑制劑（抗PD-1）協(xié)同增強(qiáng)免疫治療效果。當(dāng)ZCPO@HA納米顆粒被腫瘤細(xì)胞特異性識(shí)別并內(nèi)吞，它們能釋放大量的Zn²⁺和Cu²⁺，并在弱酸性環(huán)境中產(chǎn)生過氧化氫（H₂O₂）。由鐵死亡和銅死亡誘導(dǎo)的免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）能夠釋放大量損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），有效刺激抗腫瘤適應(yīng)性免疫反應(yīng)。此外，過量的Zn²⁺和大量的?OH會(huì)造成線粒體損傷，導(dǎo)致大量線粒體脫氧核糖核酸（mtDNA）的釋放，顯著激活cGAS-STING通路，并促進(jìn)抗腫瘤天然免疫反應(yīng)。簡而言之，通過簡便的一步共生法制備的鋅銅雙金屬過氧化物納米顆粒具有同時(shí)激活天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)以損傷腫瘤的強(qiáng)大能力，實(shí)現(xiàn)了顯著的抗腫瘤免疫治療效果。該文章于2025年4月3日以《One-Step Symbiosis of Bimetallic Peroxides Nanoparticles to Induce Ferroptosis/Cuproptosis and Activate cGAS-STING Pathway for Enhanced Tumor Immunotherapy》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202500337）。

研究示意圖

（1）ZCPO@HA納米顆粒的構(gòu)建與表征

由圖1 a、b的透射電子顯微鏡（TEM）圖像所示，與過氧化鋅（ZnO₂）納米顆粒（約40 nm）相比，鋅銅雙金屬過氧化物（ZCPO）納米顆粒尺寸更大（約60 nm），且更趨向于球形。從高角度環(huán)形暗場(chǎng)掃描透射電子顯微鏡（HAADF-STEM）圖像和元素映射可看出，ZCPO納米顆粒中鋅（Zn）、銅（Cu）、氧（O）、氮（N）和碳（C）分布均勻（圖 1c）.不同mZn/mCu比例的產(chǎn)物的X射線衍射（XRD）和X射線光電子能譜（XPS）圖譜如圖 1d、e所示。隨著mZn/mCu比例降低，（200）晶面與（111）晶面的衍射峰強(qiáng)度比（I (200)/I (111)）下降，鋅與銅的原子含量比（AZn/ACu）也相應(yīng)降低（圖 1f）。隨后，通過用透明質(zhì)酸鈉（NaHA）修飾獲得透明質(zhì)酸修飾的ZCPO（ZCPO@HA）納米顆粒，對(duì)納米顆粒進(jìn)行透明質(zhì)酸（HA）表面修飾不僅能提高其分散性和生物相容性，還賦予其靶向腫瘤細(xì)胞的能力。如圖 1g所示，銅元素主要以一價(jià)和二價(jià)狀態(tài)存在于ZCPO@HA納米顆粒中，分別占比47%和53%。此外，在氧1s的XPS光譜中，兩個(gè)分別歸屬于C═O（531.9 eV）和O-O（533.5 eV）的峰表明HA和過氧基團(tuán)的存在（圖 1h）。圖 1i中HA修飾前后的熱重分析（TGA）曲線顯示，ZCPO@HA納米顆粒表面HA含量為6.0%（w/w）。這些結(jié)果表明通過上述方法成功制備了ZCPO@HA納米顆粒。

圖1（a）過氧化鋅（ZnO?）納米顆粒和（b）鋅銅雙金屬過氧化物（ZCPO）納米顆粒的TEM圖像；（c）ZCPO納米顆粒的HAADF-STEM圖像及元素映射；（d）ZnO?納米顆粒、不同鋅銅質(zhì)量比的ZCPO納米顆粒及CuO?納米顆粒的XRD圖譜和（e）全XPS圖譜；（f）（200）晶面與（110）晶面的衍射峰強(qiáng)度比及鋅銅原子比的表格；（g）ZCPO@HA納米顆粒的銅2p XPS光譜和（h）氧1s XPS光譜；（i）不同樣品的TGA曲線

（2）ZCPO@HA納米顆粒的分解能力

通過ICP-OES測(cè)定ZCPO@HA納米顆粒在不同pH值溶液中Zn2?和Cu2?的釋放行為。結(jié)果表明，Zn2?和Cu2?在弱酸性溶液（pH=5.5）中釋放顯著且呈時(shí)間依賴性，而在中性溶液（pH=7.4）中幾乎無釋放。與ZCPO納米顆粒相比，ZCPO@HA納米顆粒因HA包覆，釋放量較少，顯示出更好的穩(wěn)定性（圖2a、b）。此外，ZCPO@HA納米顆粒在弱酸性溶液（pH=6.5）中可逐漸產(chǎn)生H?O?，且在pH=5.5時(shí)H?O?釋放量顯著增加（圖2c）。隨著ZCPO@HA納米顆粒濃度增加，GSH含量降低，表明其可有效消耗GSH（圖2e）。ZCPO@HA納米顆粒釋放的Cu2?可催化H?O?生成?OH，TMB在650 nm處的吸光度增強(qiáng)，OPD的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間延長而增強(qiáng)（圖2g、h）。ESR光譜檢測(cè)到在弱酸性溶液（pH=5.5）中處理的ZCPO@HA納米顆粒呈現(xiàn)出最明顯的?OH信號(hào)（圖2i）。TEM圖像顯示，ZCPO@HA納米顆粒在酸性溶液中逐漸崩解，12小時(shí)后幾乎完全分解，而在中性溶液中無明顯變化，進(jìn)一步證明其在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性（圖2j）。

圖2（a）不同樣品在不同pH值溶液中鋅離子（Zn2?）的釋放情況；（b）不同樣品在不同pH值溶液中銅離子（Cu2?）的釋放情況；（c）ZCPO@HA與硫酸鈦（Ti(SO?)?）溶液混合后在410 nm處吸光度隨時(shí)間變化；（d）DTNB與谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)機(jī)制；（e）不同濃度ZCPO@HA消耗GSH的能力；（f）TMB和OPD檢測(cè)羥基自由基（?OH）機(jī)制；（g）ZCPO@HA與TMB溶液混合后在650 nm處吸光度隨時(shí)間變化；（h）弱酸性溶液（pH=5.5）中處理不同時(shí)間后，ZCPO@HA與OPD混合的紫外-可見吸收光譜；（i）不同條件下DMPO與ZCPO@HA混合后的ESR光譜；（j）不同處理下ZCPO@HA隨時(shí)間變化的TEM圖像

（3）ZCPO@HA納米顆粒誘導(dǎo)鐵死亡與銅死亡

利用小鼠乳腺癌（4T1）細(xì)胞評(píng)估了ZCPO@HA納米顆粒的細(xì)胞攝取情況。如圖 3a、b所示，隨著ZCPO@HA納米顆粒與4T1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)Zn²⁺和Cu²⁺的含量逐漸上升。然而，經(jīng)HA預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)的金屬離子含量顯著降低，這表明HA修飾使ZCPO@HA納米顆粒能夠靶向腫瘤細(xì)胞，并促進(jìn)細(xì)胞吞噬。同時(shí)，與ZnO₂和CuO₂相比，ZCPO@HA納米顆粒對(duì)4T1細(xì)胞表現(xiàn)出更顯著的細(xì)胞毒性（圖 3c）。接下來，探究了 ZCPO@HA納米顆粒殺傷腫瘤細(xì)胞的具體機(jī)制，如圖 3d、e所示，由于大量Cu²⁺的釋放以及H₂O₂自補(bǔ)償效應(yīng)，ZCPO@HA納米顆粒比ZnO₂和CuO₂納米顆粒具有更強(qiáng)的谷胱甘肽（GSH）消耗能力。相應(yīng)地，根據(jù)谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的熒光染色圖像以及蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）條帶的灰度值結(jié)果（圖 3f、g），ZCPO@HA納米顆粒有效抑制了GPX4的表達(dá)。在所有實(shí)驗(yàn)組中，經(jīng)ZCPO@HA納米顆粒處理后的4T1細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物（LPO）含量最高，表現(xiàn)出最明顯的鐵死亡效應(yīng)（圖 3h）。細(xì)胞內(nèi)Cu²⁺的積累會(huì)影響線粒體中的三羧酸（TCA）循環(huán)過程，導(dǎo)致二氫硫辛酸S-乙酰轉(zhuǎn)移酶（DLAT）聚集以及鐵硫蛋白（如脂酰合酶（LIAS））減少，最終引發(fā)銅死亡（圖 3i）。如圖 3j所示，與不同實(shí)驗(yàn)組相比，在與含有相同濃度Cu²⁺的CuO2納米顆粒和ZCPO@HA納米顆粒共培養(yǎng)后，WB條帶的灰度結(jié)果表明鐵氧還蛋白-1（FDX1）的表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，DLAT出現(xiàn)明顯聚集，LIAS的表達(dá)也受到顯著抑制。DLAT低聚物的熒光成像進(jìn)一步證實(shí)了這一現(xiàn)象（圖 3k）。因此，ZCPO@HA納米顆?？赏ㄟ^在細(xì)胞內(nèi)響應(yīng)性釋放大量Cu²⁺誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生銅死亡。

圖3（a）4T1細(xì)胞與ZCPO@HA孵育不同時(shí)間（對(duì)照組、1 h、2 h、4 h及4 h加額外HA）的Zn2?和Cu2?熒光圖像；（b）熒光強(qiáng)度定量統(tǒng)計(jì)；（c）不同條件下4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性；（d）不同條件下孵育的4T1細(xì)胞的各類熒光圖像；（e）熒光強(qiáng)度（I：對(duì)照組；II：ZnO?；III：CuO?；IV：ZCPO@HA）；（f）不同樣品對(duì)4T1細(xì)胞中GPX4表達(dá)影響的WB分析；（g）條帶相對(duì)灰度值；（h）ZCPO@HA介導(dǎo)的鐵死亡分子機(jī)制；（i）ZCPO@HA介導(dǎo)的銅死亡分子機(jī)制；（j）對(duì)FDX1、DLAT和LIAS表達(dá)的WB分析及條帶相對(duì)灰度值；（k）不同條件下孵育的4T1細(xì)胞中DLAT低聚物的熒光圖像

（4）ZCPO@HA納米顆粒誘導(dǎo)線粒體損傷激活cGAS-STING信號(hào)通路

ZCPO@HA納米顆粒處理4T1細(xì)胞后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸破壞，線粒體損傷加劇，6小時(shí)后細(xì)胞幾乎完全碎片化（圖4a）。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)顯示，ZCPO@HA處理組的4T1細(xì)胞中線粒體損傷最嚴(yán)重，mtDNA釋放量最高（圖4b）。WB分析顯示，ZCPO@HA處理組中pTBK1和pIRF3表達(dá)顯著，表明cGAS-STING信號(hào)通路被激活（圖4c、d）。此外，ZCPO@HA處理的4T1細(xì)胞中CRT暴露量最大，HMGB1幾乎全部遷移至細(xì)胞外，ATP分泌水平最高（圖4e、f），表明其可誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）。Transwell模型實(shí)驗(yàn)表明，ZCPO@HA處理組中36.4%的DC2.4細(xì)胞成熟，顯著高于其他對(duì)照組（圖4g、h）。ELISA檢測(cè)顯示，ZCPO@HA處理組中TNF-α和IL-6分泌量約為對(duì)照組的五倍（圖4i、j）。這些結(jié)果表明，ZCPO@HA納米顆?？烧T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡和銅死亡，激活cGAS-STING信號(hào)通路，引發(fā)天然免疫和適應(yīng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖4（a）經(jīng)ZCPO@HA處理不同時(shí)間的4T1細(xì)胞的Bio-TEM圖像；（b）不同處理后4T1細(xì)胞中mtDNA的定量統(tǒng)計(jì)（I：對(duì)照組；II：ZnO?；III：CuO?；IV：ZCPO@HA）（n=5）；（c）ZCPO@HA介導(dǎo)的cGAS-STING通路激活的分子機(jī)制；（d）pTBK1和pIRF3表達(dá)的WB分析；（e）4T1細(xì)胞中CRT和HMGB1的熒光圖像；（f）4T1細(xì)胞的細(xì)胞外ATP水平；（g）Transwell模型示意圖；（h）通過流式細(xì)胞術(shù)分析CD80/CD86表達(dá)檢測(cè)DC成熟度；（i）TNF-α和（j）IL-6的ELISA結(jié)果

（5）ZCPO@HA納米顆粒對(duì)腫瘤組織的殺傷效果

在小鼠雙側(cè)4T1腫瘤模型中，ZCPO@HA納米顆粒聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑（抗PD-1）對(duì)腫瘤生長、抗腫瘤免疫反應(yīng)及腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制效果進(jìn)行了驗(yàn)證（圖5a）。結(jié)果顯示，ZCPO@HA納米顆粒治療后原發(fā)腫瘤生長顯著受抑（圖5b、d、f），與抗PD-1聯(lián)合使用時(shí)，抑制效果更為顯著。H&E染色和TUNEL染色表明，ZCPO@HA納米顆粒與抗PD-1聯(lián)合治療可有效破壞腫瘤組織（圖5h）。免疫熒光染色顯示，ZCPO@HA納米顆粒誘導(dǎo)腫瘤組織發(fā)生鐵死亡和銅死亡，且聯(lián)合抗PD-1使用可增強(qiáng)免疫反應(yīng)，促進(jìn)CD8T細(xì)胞在腫瘤部位浸潤和富集（圖5c、e、g）。最終，聯(lián)合治療組中遠(yuǎn)處腫瘤生長受到最大程度抑制，部分遠(yuǎn)處腫瘤消失。

圖5（a）ZCPO@HA納米顆粒聯(lián)合抗PD-1在雙側(cè)4T1腫瘤模型上進(jìn)行免疫治療的實(shí)驗(yàn)安排示意圖；（b）不同處理后原發(fā)腫瘤的個(gè)體生長曲線；（c）不同處理后遠(yuǎn)處腫瘤的個(gè)體生長曲線；（d）不同處理后切除的原發(fā)腫瘤照片；（e）不同處理后切除的遠(yuǎn)處腫瘤照片；（f）不同處理后原發(fā)腫瘤的重量；（g）不同處理后遠(yuǎn)處腫瘤的重量；（h）不同處理后切除的原發(fā)腫瘤組織切片中H&E、TUNEL、GPX4、LIAS和CD8T細(xì)胞的免疫熒光圖像

（6）ZCPO@HA納米顆粒的抗腫瘤免疫反應(yīng)

ZCPO@HA納米顆粒處理后，脾臟和淋巴結(jié)中樹突狀細(xì)胞（DC）的成熟率更高（分別為28.2%和27.0%），與抗PD-1聯(lián)合使用后，成熟率進(jìn)一步提高至31.3%和31.9%（圖6a）。ZCPO@HA納米顆粒聯(lián)合抗PD-1治療后，血清中IFN-β、TNF-α、IL-6、IL-12和IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌水平最高（圖6b）。此外，該聯(lián)合治療組小鼠遠(yuǎn)處腫瘤部位CD4和CD8T細(xì)胞浸潤以及脾臟中記憶T細(xì)胞浸潤最為顯著（圖6c）。在肺轉(zhuǎn)移模型中，ZCPO@HA納米顆粒組和聯(lián)合抗PD-1組肺部幾乎無腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移（圖6d），且該聯(lián)合治療組小鼠存活時(shí)間最長，存活率在50天以上達(dá)到60%（圖6e）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，ZCPO@HA納米顆粒具有顯著生物相容性，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡和銅死亡，激活抗腫瘤適應(yīng)性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)cGAS-STING信號(hào)通路介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移并顯著延長生存期。

圖6（a）不同處理后荷瘤小鼠脾臟和淋巴結(jié)中樹突狀細(xì)胞（DC）成熟度的流式細(xì)胞術(shù)分析；（b）不同處理后荷瘤小鼠血清中IFN-β、TNF-α、IL-6、IL-12和IFN-γ細(xì)胞因子的ELISA結(jié)果；（c）體內(nèi)不同處理16天后，荷瘤小鼠遠(yuǎn)處腫瘤部位CD4/CD8T細(xì)胞及脾臟中記憶T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析；（d）不同處理后荷瘤小鼠肺組織切片的H&E染色結(jié)果；（e）不同處理后荷瘤小鼠的生存率