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針對上述問題，溫州醫(yī)科大學(xué)肖健/李正林聯(lián)合黑龍江大學(xué)李卓合作開發(fā)了一種具有分級釋放特性的愈合相自適應(yīng)水凝膠（F/R gel），用于慢性感染傷口的程序化調(diào)節(jié)。該水凝膠由ε-聚賴氨酸（εPL）與醛基透明質(zhì)酸（HA-CHO）通過席夫堿反應(yīng)制備，包裹εPL修飾的缺氧納米二氧化鈰（εPL-CeO_v）與共載堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）和c-Jun siRNA的PLGA微膠囊（F/R MCs）。在弱酸性傷口環(huán)境中，水凝膠快速降解，優(yōu)先釋放εPL和εPL-CeO_v，實現(xiàn)抗菌和ROS清除，緩解局部炎癥。后續(xù)階段，F(xiàn)/R MCs逐步釋放bFGF促進(jìn)血管生成與細(xì)胞增殖，同時c-Jun siRNA抑制c-Jun過表達(dá)，調(diào)控成纖維細(xì)胞亞型，進(jìn)而實現(xiàn)無瘢痕皮膚再生。該水凝膠還具備良好的粘附性和自修復(fù)能力，可適應(yīng)復(fù)雜創(chuàng)面。動物模型實驗表明，F(xiàn)/R gel可顯著加速慢性感染傷口的愈合過程，并有效減少瘢痕形成，展現(xiàn)出良好的治療潛力。本研究提供了一種有前景的再生策略，強(qiáng)調(diào)免疫調(diào)節(jié)和成纖維細(xì)胞亞型的調(diào)控，以實現(xiàn)無疤痕傷口修復(fù)。該文章于2025年4月20日以《A dynamically phase-adaptive regulating hydrogel promotes ultrafast anti-fibrotic wound healing》為題發(fā)表于《Nature Communication》上（DOI：10.1038/s41467-025-58987-w）。

（1）F/R 凝膠的制備與表征

F/R凝膠通過陽離子抗菌肽ε-聚賴氨酸（εPL）與醛基透明質(zhì)酸（HA-CHO）之間的可逆席夫堿反應(yīng)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，CeOv納米酶和負(fù)載bFGF/c-Jun siRNA的PLGA微膠囊（F/R MCs）均勻分布其中（圖1a）。F/R MCs經(jīng)W/O/W雙乳液法制備，平均粒徑為6.23?±?2.70?μm，表面光滑（圖1d），bFGF與c-Jun siRNA成功封裝（圖1e）。體外藥物釋放曲線表現(xiàn)為持續(xù)釋放（圖2k）。免疫熒光結(jié)果證實F/R MCs可有效下調(diào)成纖維細(xì)胞中c-Jun蛋白表達(dá)（圖1f）。

圖1 F/R凝膠的制備及表征。（a）F/R凝膠制備示意圖；（b）CeOv納米粒子的TEM圖像；（c）CeOv納米粒子的HRTEM圖像及晶格分析；（d）F/R MCs的SEM圖像；（e）F/R MCs的CLSM圖像，顯示FITC標(biāo)記的bFGF和FAM標(biāo)記的siRNA（綠色）裝入尼羅紅標(biāo)記的PLGA微囊（紅色）；（f）熒光染色3T3細(xì)胞中c-Jun的表達(dá)（綠色）

HA-CHO中的醛基與εPL鏈（自由εPL或εPL-CeOv）中的氨基可迅速發(fā)生席夫堿反應(yīng)，數(shù)秒內(nèi)形成F/R水凝膠（圖2a）。Ce元素均勻分布于網(wǎng)絡(luò)中（圖2b）。流變學(xué)數(shù)據(jù)顯示約3秒形成穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)（圖2c）。在0%–1000%剪切應(yīng)變范圍內(nèi)，儲能模量（G’）與損耗模量（G”）隨應(yīng)變升高而下降，G”與G’的交點在770%左右，表現(xiàn)出剪切變稀特性（圖2d）。當(dāng)應(yīng)變恢復(fù)至1%時，凝膠回復(fù)至彈性主導(dǎo)狀態(tài)，且該過程可反復(fù)循環(huán)，表現(xiàn)出良好的注射性和自愈合性能（圖2e, f）。凝膠可穩(wěn)定黏附于皮膚及不同類型的小鼠新鮮傷口表面（圖2g），并具備良好拉伸性能（圖2h–j）。

F/R凝膠網(wǎng)絡(luò)主要由席夫堿鍵和靜電作用形成，可在微酸性環(huán)境下優(yōu)先解離，快速釋放小分子εPL和超小εPL-CeOv，實現(xiàn)抗菌與免疫調(diào)節(jié)功能。相比之下，PLGA微膠囊（F/R MCs）因粒徑大、降解慢，其載藥（bFGF/siRNA）釋放延后，用于后續(xù)組織再生（圖2k）。在中性PBS中，εPL-CeOv于前6天釋放量達(dá)91.13%；bFGF與siRNA分別在第7天累積釋放至約85%和74.48%。酸性環(huán)境（pH=4.5）可加速εPL-CeOv釋放，符合席夫堿鍵的酸敏特性。

該凝膠體系具有分級遞藥特性：①抗菌組分（自由εPL和εPL-CeOv）優(yōu)先釋放用于抑菌；②CeOv納米酶隨后釋放，清除ROS并調(diào)節(jié)炎癥；③bFGF與c-Jun siRNA在后期釋放，促進(jìn)血管新生、細(xì)胞增殖，并調(diào)控成纖維細(xì)胞亞型，實現(xiàn)對不同創(chuàng)傷愈合階段的按需精準(zhǔn)治療，有望實現(xiàn)快速抗瘢痕愈合（圖2l）。

圖2 F/R凝膠的表征。（a）凝膠制備示意圖；（b）F/R凝膠的SEM圖像及元素分布；（c）時間掃描流變圖；（d）交變階躍應(yīng)變從1%切換到800%時的流變變化；（f）凝膠的自愈合過程；（g）粘附性；（h）可拉伸性；（i）使用豬皮的代表性圖片；（j）拉伸應(yīng)變測試；（k）F/R凝膠組分在中性PBS（pH=7.4）和酸性PBS（pH=4.5）中的體外釋放特性；（l）無疤痕傷口愈合過程中F/R凝膠動態(tài)相位適應(yīng)性調(diào)節(jié)功能的示意圖

（2）F/R 凝膠的抗菌和抗生物膜活性

F/R凝膠對耐藥菌感染傷口具有顯著抗菌效果。以大腸桿菌（E. coli）、金黃色葡萄球菌（S. aureus）及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）為模型菌株，環(huán)丙沙星（CIP）作為陽性對照，通過菌落計數(shù)及活死細(xì)菌染色評估其殺菌能力。εPL-CeOv、空白Gel及F/R凝膠均顯著降低菌落數(shù)，效果與CIP相當(dāng)（圖3a, b），其中空白Gel的抑菌效果源于基質(zhì)中的εPL。F/R凝膠對革蘭陰性菌和陽性菌均有抑制作用，對E. coli與S. aureus的抑菌率達(dá)89%，對MRSA的殺滅率近95%?；钏谰旧炞C其可迅速誘導(dǎo)細(xì)菌死亡（圖3a, b）。生物掃描電鏡（Bio-SEM）觀察到細(xì)菌形態(tài)破壞，如變形、表面皺縮及破裂（圖3c）。

F/R凝膠可有效抑制生物被膜形成并破壞成熟生物被膜（圖3d）。結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，F(xiàn)/R凝膠對E. coli、S. aureus和MRSA生物被膜的抑制率分別為約95.08%、87.10%和87.89%。此外，凝膠對成熟生物被膜也具有破壞能力，破壞率分別為約82.53%、81.38%和71.35%（圖3e），活死菌染色進(jìn)一步證實其強(qiáng)分散能力（圖3e）。對生物被膜厚度、總量、粗糙度及熒光強(qiáng)度的多參數(shù)分析顯示，F(xiàn)/R凝膠破壞能力優(yōu)于CIP（圖3f, g）。F/R凝膠與空白Gel在破膜效率上無顯著差異，說明其抗生物被膜活性主要源自εPL與εPL-CeOv，F(xiàn)/R MCs的加入未削弱該功能。

圖3 F/R凝膠的體外抗菌和抗生物膜活性。（a）不同處理后細(xì)菌菌落及活/死染色檢測的代表性圖像；（b）菌落總數(shù)和活/死細(xì)菌的統(tǒng)計分析；（c）F/R凝膠處理前后細(xì)菌的掃描電鏡圖像（紅色箭頭表示細(xì)胞壁破裂變化）；（d）F/R凝膠破壞生物膜效果的實驗圖解；（e）不同處理后成熟生物膜的結(jié)晶紫染色和活菌/死菌染色圖像；（f）成熟生物膜的生物膜評估值；（g）從（e）中CLSM平面量化的綠色熒光強(qiáng)度與生物膜深度的關(guān)系

（3）F/R 凝膠的抗氧化和抗炎活性

F/R凝膠中主要清除ROS的成分為εPL-CeOv，其通過Ce3?/Ce??的快速氧化還原循環(huán)實現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移（圖4a）。Blank Gel與F/R凝膠的ROS清除效率與純εPL-CeOv相當(dāng)，而F/R MCs幾乎無清除能力（圖4b–f），說明εPL-CeOv與HA-CHO交聯(lián)未影響其抗氧化性能，且其在凝膠中均勻分布保障了整體抗氧化能力。

為揭示CeOv納米酶的原子級催化機(jī)制，進(jìn)行了密度泛函理論（DFT）計算。熱分解法合成的超小CeOv表面具有豐富的氧空位（圖4g），并伴隨Ce3?/Ce??可逆氧化還原對。電荷密度圖顯示氧空位導(dǎo)致電子重新分布并降低鄰近Ce的價態(tài)（圖4h）；Bader電荷分析表明CeOv的Ce價態(tài)較完美CeO?表面降低約0.47?e?。CeOv (111)晶面對五種自由基的吸附能分別為：ABTS+?（?3.87?eV）、DPPH?（?3.97?eV）、H?O?（?4.83?eV）、?OH（?6.46?eV）、?O??（?7.46?eV），顯著高于CeO?（圖4i），表明其更強(qiáng)的吸附與催化活性。進(jìn)一步模擬了?O??歧化反應(yīng)和H?O?分解的關(guān)鍵中間體與反應(yīng)路徑，揭示其具備類似SOD和CAT的仿酶機(jī)制（圖4j）。

圖4 體外抗氧化活性和DFT計算。（a）F/R凝膠清除ROS能力示意圖；（b）對ABTS自由基的清除測試；（c）對DPPH自由基的清除測試；（d）對過氧化氫的清除測試；（e）對羥基自由基的清除測試；（f）對超氧陰離子的清除測試（n=3個獨立樣品）；（g）缺氧CeOv納米酶的粒子模型及單胞構(gòu)型；（h）CeO2和CeOv的模擬電子密度圖，紅色虛線圓圈表示表面氧空位；（i）CeOv（111）面上吸附的ABTS??、DPPH?、H?O?、-OH和-O??自由基的優(yōu)化結(jié)構(gòu)俯視圖；（j）CeOv（111）面上模擬SOD類和CAT類催化過程的反應(yīng)能量曲線

過量ROS積累可誘發(fā)氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，M1型巨噬細(xì)胞過度分泌炎癥因子又會進(jìn)一步促進(jìn)ROS產(chǎn)生，形成持續(xù)性炎癥–ROS正反饋循環(huán)，導(dǎo)致異常傷口愈合。F/R凝膠在細(xì)胞水平被驗證具有中斷該循環(huán)的能力，包括清除細(xì)胞內(nèi)ROS、減少ROS損傷及抑制M1型極化（圖5a）。在tBHP誘導(dǎo)的3T3和HUVEC氧化應(yīng)激模型中，F(xiàn)/R凝膠組細(xì)胞內(nèi)ROS強(qiáng)度較tBHP組分別降低超過6倍和2倍（圖5b, c）。熒光圖像顯示，tBHP處理后ROS信號增強(qiáng)，而F/R凝膠處理后ROS水平幾乎不可檢測（圖5d, e）。HPF染色進(jìn)一步證實其細(xì)胞內(nèi)ROS清除作用，并顯著提升細(xì)胞活力（圖5d）。F MCs與F/R MCs組間無顯著差異，表明bFGF具備增殖促進(jìn)作用；而F/R凝膠中εPL-CeOv同時清除氧化應(yīng)激，為細(xì)胞增殖提供良好微環(huán)境。

慢性傷口愈合早期，巨噬細(xì)胞易極化為促炎的M1型，分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子及自由基，導(dǎo)致炎癥持續(xù)并延緩修復(fù)。抑制過度M1型極化有助于緩解炎癥并加速愈合。LPS刺激下，巨噬細(xì)胞CD86（M1標(biāo)志物）熒光強(qiáng)度顯著升高，表明其極化為M1型（圖5f）；而F/R凝膠處理后CD86陽性率僅約2.56%，較LPS組下降約6.7倍（圖5g）。F/R凝膠中兩種成分協(xié)同抑制巨噬細(xì)胞活化：① bFGF可調(diào)控巨噬細(xì)胞表面受體表達(dá)及促炎因子產(chǎn)生，抑制NF-κB等信號通路；② 抗氧化的εPL-CeOv可清除細(xì)胞內(nèi)ROS，進(jìn)一步抑制M1極化。

圖5 F/R凝膠的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激消除、巨噬細(xì)胞極化效應(yīng)和生物相容性評估。（a）細(xì)胞實驗圖解；（b）3T3和HUVEC細(xì)胞的DCFH-DA熒光流式細(xì)胞儀檢測；（c）細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA熒光強(qiáng)度統(tǒng)計；（d）3T3細(xì)胞的DCFH-DA探針、HPF探針及活/死細(xì)胞染色熒光圖像；（e）相應(yīng)統(tǒng)計分析；（f）巨噬細(xì)胞上CD86標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)；（g）相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（h）紅細(xì)胞顯微圖像；（i）不同處理后的溶血率；（j）皮下植入試驗圖解；（k）F/R凝膠植入28天后皮膚組織的H&E染色圖像；（l）血常規(guī)和生化指標(biāo)

（4）F/R 凝膠的生物相容性評估

F/R凝膠具有良好生物相容性。溶血實驗顯示，F(xiàn)/R凝膠處理后紅細(xì)胞完整，離心上清液澄清透明，溶血率接近0%，與陰性對照相當(dāng)；而陽性對照（去離子水）組紅細(xì)胞破裂，溶血率接近100%（圖5h, i）。在小鼠皮下移植F/R凝膠30天后，H&E染色顯示皮膚及主要器官無炎癥反應(yīng)或組織損傷（圖5j, k）。血常規(guī)及血清生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)（圖5l）。

（5）F/R 凝膠促進(jìn)小鼠感染 MRSA 的慢性傷口快速愈合

為評估F/R凝膠在體內(nèi)促進(jìn)慢性感染創(chuàng)面愈合的效果，在C57BL/6小鼠背部建立MRSA感染的全層皮膚缺損模型（直徑6.0?mm），并分別給予PBS（Control）、貝復(fù)濟(jì)凝膠（Beifuji）、F/R MCs、空白Gel和F/R凝膠處理（圖6a）。F/R凝膠組在第4、7、14天的創(chuàng)面面積最小，顯示顯著加快的愈合速度（圖6b；圖6c）。F/R凝膠處理4天后未愈合面積降至約63.25%，第7天降至約32.56%，而對照組同期分別為約89.51%和84.22%。第14天F/R凝膠組創(chuàng)面幾乎完全愈合，最接近正常皮膚。整體上，F(xiàn)/R凝膠將愈合時間縮短約6–7天，總愈合周期減少近三分之一。分階段分析顯示，F(xiàn)/R凝膠在愈合早期（第0–7天）顯著加快愈合，而后期愈合速率趨緩，有助于避免過度增生。同時，第4和7天，Control、Beifuji及F/R MCs組出現(xiàn)明顯感染及生物被膜形成，而Gel與F/R凝膠組感染跡象較輕。培養(yǎng)皿菌落分析顯示，F(xiàn)/R凝膠組細(xì)菌數(shù)量最少，第7天幾乎無菌落（圖6d, e）。綜合數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)/R凝膠處理下創(chuàng)面可在第4–7天順利過渡至增殖期，而其他組仍處于感染或炎癥期。

圖6 F/R凝膠對小鼠MRSA感染慢性傷口的體內(nèi)快速愈合效果。（a）小鼠全動物實驗過程；（b）第0~14天傷口閉合的光學(xué)照片及模擬圖；（c）14天內(nèi)傷口面積變化曲線；（d）第2~7天傷口滲出物的菌落計數(shù)檢測及（e）代表性圖像；（f）DHE、CD86、CD206、CD31、VEGF、Ki67和DAPI的免疫熒光染色、H&E染色及馬森染色圖像，紅色箭頭標(biāo)記新生毛囊；（g）CD86、iNOS、IL-1β、TNF-α、CD206、Arg1、IL-10和Ki67的相對mRNA表達(dá)量

為系統(tǒng)評估愈合質(zhì)量，第4、7、14天分別取組織樣本進(jìn)行免疫熒光與組織病理學(xué)分析。第4天，Control、Beifuji及F/R MCs組顯示明顯的ROS（DHE染色）和M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86熒光信號，而Gel與F/R凝膠組信號較弱或幾乎不可見；M2型標(biāo)志物CD206則呈相反趨勢（圖6f）。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步驗證上述趨勢（圖6g）。F/R凝膠通過抑菌、清除ROS、降低促炎因子，恢復(fù)創(chuàng)面氧化還原穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)炎癥期向增殖期過渡。第7天H&E染色顯示對照組炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，而F/R凝膠組炎癥輕微（圖6f）。在增殖期（第7天），F(xiàn)/R凝膠組創(chuàng)面CD31和VEGF表達(dá)顯著上升，提示血管新生活躍（圖6f）；同時Ki67表達(dá)最高，qRT-PCR顯示Ki67 mRNA表達(dá)較對照組提升近4倍，表明細(xì)胞增殖活躍，可能與bFGF釋放有關(guān)（圖6f, g）。值得注意的是，F(xiàn)/R凝膠組第14天再生皮膚中出現(xiàn)新生毛囊和皮脂腺，其他組幾乎未見（圖6f）。Masson染色進(jìn)一步顯示F/R凝膠組膠原沉積更成熟、排列更有序（圖6f）。

（6）F/R 凝膠可抑制小鼠受 MRSA 感染的慢性傷口疤痕的形成

在第28天外觀評估與組織病理學(xué)分析中，F(xiàn)/R凝膠組再生皮膚表現(xiàn)出更好彈性、色澤均勻、色素沉著減少、組織凹陷更少（圖7a）。對照組第21天瘢痕樣組織面積約為59.88%，第28天升至64.28%；而F/R凝膠組第21天為17.51%，第28天接近0%（圖7b）。色素評分結(jié)果顯示F/R凝膠組新生皮膚色調(diào)更接近正常（L值高，A值低）。

H&E染色分析表明F/R凝膠組表皮厚度（約20.54 μm）接近正常皮膚（約20.57 μm），而對照組厚度增至正常的6倍（圖7c, d）。薄表皮更有利于防止結(jié)痂或瘢痕形成，維持皮膚功能。F/R凝膠組還觀察到大量成熟皮膚附屬器形成，數(shù)量接近正常水平（圖7c, d）。免疫熒光標(biāo)記CK19進(jìn)一步證實毛囊生成（圖7d），同時再生組織中可見β3-Tubulin陽性的神經(jīng)束，提示F/R凝膠具有激活神經(jīng)修復(fù)潛力，促進(jìn)神經(jīng)重建。皮膚附屬結(jié)構(gòu)和神經(jīng)纖維的有序形成體現(xiàn)出F/R凝膠優(yōu)越的創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量。

圖7 F/R凝膠可緩解小鼠受MRSA感染的慢性傷口纖維化疤痕的形成。（a）第21~28天疤痕面積變化的光學(xué)照片及模擬圖；（b）治療后疤痕變化曲線及顏色分析（L值越高顏色越白，A值越高顏色越紅）；（c）第28天表皮厚度和毛囊數(shù)量的H&E染色分析（n=6個獨立樣本）；（d）第21~28天傷口組織的H&E染色、Masson染色及COL I、COL III、TGF-β、c-Jun、CK19、β3-Tublin和DAPI的免疫熒光染色圖像；（e）基于組織切片分析的膠原體積比、分形維度值和裂隙度值（n=3個生物獨立樣本）；（f）第28天COL I、COL III和c-Jun的相對mRNA表達(dá)量（n=3個生物獨立樣本）

Masson染色結(jié)果顯示，F(xiàn)/R凝膠組膠原沉積更成熟，排列更有序且結(jié)構(gòu)更簡單（圖7d）。統(tǒng)計分析顯示F/R凝膠組膠原體積分?jǐn)?shù)（CFV）接近正常皮膚（約23.90% vs. 正常皮膚約20%），而對照組高達(dá)78.83%，提示其存在異常膠原沉積與嚴(yán)重纖維化（圖7e）。F/R凝膠組的空隙度（lacunarity）較高、分形維度較低，反映出多孔結(jié)構(gòu)及膠原排列均勻。膠原I主要維持組織結(jié)構(gòu)，膠原III與彈性相關(guān)。F/R凝膠組中膠原I表達(dá)顯著降低，膠原III表達(dá)上升（圖7d–f），表明其具有抑制纖維瘢痕形成的潛力。c-Jun表達(dá)在F/R凝膠組顯著降低，TGF-β也下調(diào)，表明siRNA干預(yù)c-Jun與TGF-β信號通路聯(lián)動抑制瘢痕形成。而F/R MCs組未能有效降低c-Jun表達(dá)，可能因自由微膠囊在愈合過程中迅速丟失，凸顯凝膠系統(tǒng)的重要性。

（7）熒光激活細(xì)胞分揀（FACS）和轉(zhuǎn)錄組測序分析

第7天FACS分析結(jié)果顯示，F(xiàn)/R凝膠組網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞比例顯著低于其他對照組，脂肪樣成纖維細(xì)胞比例則相反（圖8a, b）。網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞過多會導(dǎo)致過量膠原沉積和基質(zhì)重塑紊亂，引發(fā)瘢痕形成；而F/R凝膠通過調(diào)控愈合過程中成纖維細(xì)胞亞群比例，促使脂肪樣成纖維細(xì)胞增多，有利于無瘢痕修復(fù)（圖8c）。同時，F(xiàn)/R凝膠組α-SMA（促纖維化肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)保持在較低且穩(wěn)定水平，其他組則持續(xù)升高，提示真皮纖維化發(fā)展（圖8d, e）。盡管Sca-1（脂肪型成纖維細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)變化不如α-SMA顯著，但F/R凝膠組在所有時間點的Sca-1表達(dá)均較高，進(jìn)一步支持其對纖維化調(diào)控作用（圖8d, e）。

為進(jìn)一步探究F/R凝膠促進(jìn)無瘢痕愈合的潛在機(jī)制，對第14天創(chuàng)面組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。所有生物學(xué)重復(fù)樣本間的Pearson相關(guān)系數(shù)R2均大于0.92，表明數(shù)據(jù)可靠（圖8f）?；鹕綀D顯示F/R凝膠組共有318個差異表達(dá)基因，其中175個上調(diào)，143個下調(diào)（圖8g）。彈性蛋白編碼基因Eln在F/R凝膠組顯著上調(diào)，可能促進(jìn)創(chuàng)面彈性組織再生（圖8h）。此外，與血管再生（Myl7）、肌肉再生（Myog）、毛囊與附屬器再生（Sp6、Gsdma3、Elf5）相關(guān)的基因也顯著上調(diào)。與纖維化瘢痕形成相關(guān)的基因（如Ugt8a、Il-11、Gcgr、Tgfbr3l）顯著下調(diào)，c-Jun表達(dá)也因siRNA干預(yù)而降低。KEGG通路富集分析顯示差異基因主要涉及IL-17、NF-κB、JAK-STAT、HIF-1和TGF-β等信號通路，參與調(diào)控炎癥、免疫、增殖和纖維化等愈合相關(guān)過程（圖8i）。GO分析表明，這些基因主要富集于細(xì)胞對TGF-β刺激的響應(yīng)等生物過程（圖8j）。

圖8 通過FACS和轉(zhuǎn)錄組測序分析細(xì)胞分子水平的潛在調(diào)控機(jī)制。（a）傷口組織FACS實驗過程示意圖；（b）成纖維細(xì)胞亞型的熒光激活細(xì)胞分選結(jié)果；（c）c-Jun沉默策略調(diào)控的成纖維細(xì)胞亞型示意圖；（d）第7、14和28天傷口組織中α-SMA和Sca-1的免疫熒光染色圖像；（e）α-SMA和Sca-1信號的平均熒光強(qiáng)度（n=3個生物獨立樣本）；（f）測試樣本的皮爾遜相關(guān)系數(shù)矩陣熱圖；（g）第14天F/R凝膠組與對照組的火山圖；（h）篩選出的參與愈合過程的差異表達(dá)基因熱圖；（i）差異表達(dá)基因的KEGG富集分析；（j）差異表達(dá)基因的GO富集分析

（8）F/R 凝膠促進(jìn)兔耳傷口無疤痕愈合

在兔耳瘢痕模型中評估F/R凝膠的抗瘢痕愈合效果。該模型由于缺乏創(chuàng)面收縮，常出現(xiàn)延遲上皮化并形成可重復(fù)的增生性瘢痕。通過切除全層皮膚（直徑8 mm）并感染MRSA構(gòu)建感染性創(chuàng)面（圖9a）。結(jié)果表明，F(xiàn)/R凝膠不僅加快愈合速度，還顯著抑制瘢痕形成（圖9b）。第14天，F(xiàn)/R凝膠組愈合率達(dá)約87.66%，優(yōu)于所有對照組（圖9c）；第21天對照組出現(xiàn)明顯紅色增生性瘢痕，第28天仍未消退，瘢痕面積約為28.3 mm2，占初始創(chuàng)面的56.33%。F/R凝膠組再生組織在形態(tài)、色澤和觸感上均接近周圍正常皮膚。

超聲成像、H&E染色、Masson染色和瘢痕評價指標(biāo)分析（SEI、瘢痕厚度、隆起角度、色素沉著）進(jìn)一步確認(rèn)F/R凝膠組瘢痕最小（圖9d–f）。超聲與組織切片均顯示F/R凝膠組組織厚度接近正常皮膚，表皮厚度無明顯增厚。Masson染色中，對照組等顯現(xiàn)出粗大、紊亂、旋渦狀的膠原沉積特征，而F/R凝膠組膠原沉積較少且細(xì)胞密度較低，接近正常組織。在重塑期，膠原排列越集中有序，皮膚強(qiáng)度越高，愈合質(zhì)量越好。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)/R凝膠組膠原纖維排列方向集中，類正常組織，其他組則分散無序（圖9g）。綜上，F(xiàn)/R凝膠在兔耳感染性創(chuàng)傷模型中可顯著加速創(chuàng)面閉合并有效抑制纖維化瘢痕形成，展現(xiàn)出良好的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

圖9 F/R凝膠對兔耳增生傷口的無瘢痕愈合效果。（a）MRSA感染兔耳傷口建模及動物實驗示意圖；（b）第0~28天傷口愈合的光學(xué)照片、模擬圖及（c）統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（d）兔耳瘢痕效果評價指標(biāo)示意圖；（e）SEI、疤痕厚度、隆起角度和顏色測量的統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（f）兔耳傷口組織的超聲成像、H&E染色和馬森氏染色圖像；（g）基于馬森染色分析的膠原蛋白取向分布