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針對上述問題，南京師范大學(xué)萬密密、毛春等人設(shè)計了一種口服人工線粒體納米機器人（AMNs），用于修復(fù)受損細(xì)胞的能量供應(yīng)系統(tǒng)，直接提供ATP。該納米平臺由兩性離子單體MAPCr（含運動和能量產(chǎn)生單元）和PFA（屏障穿越單元）制備而成。在IHD模型中，AMNs的PCr部分可與細(xì)胞質(zhì)中的ADP反應(yīng)生成ATP，修復(fù)能量供應(yīng)系統(tǒng)。其PFA部分可穿透腸黏液屏障進(jìn)入血流，L-精氨酸部分則靶向受損線粒體。到達(dá)受損心臟后，AMNs能快速產(chǎn)生ATP，減輕線粒體負(fù)擔(dān)，恢復(fù)細(xì)胞活性，同時與ROS反應(yīng)生成NO，減輕炎癥并促進(jìn)線粒體活性。該文章于2025年4月14日以《Artificial Mitochondrial Nanorobots Deliver Energy In Vivo by Oral Administration》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202500495）。

（1）PFMACr AMNs 的制備和表征

選擇兩性離子N-甲基丙烯?；?L-精氨酸-磷酸肌酸（MAPCr）和丙烯酸十五烷基氯辛酯（PFA）作為單體制備PFMACr AMN（圖1A）。在IHD模型中，AMNs的PCr部分可與細(xì)胞質(zhì)中的ADP反應(yīng)生成ATP，修復(fù)PCr-CK供能系統(tǒng)（圖1B）?？诜螅琍FMACr AMN的PFA部分可穿透腸黏液屏障進(jìn)入血流（圖1C）。TEM結(jié)果顯示納米顆粒呈均勻球形（圖1D），DLS測量其流體動力學(xué)直徑約為150 nm（圖1E），添加PFA的樣品ζ電位降低（圖1F）。共聚焦圖像和DLS結(jié)果表明PFMACr AMN表面無蛋白質(zhì)粘附（圖1G，H）。處理后，損傷心肌細(xì)胞中ROS水平恢復(fù)正常，NO水平增加至正常心肌細(xì)胞的2.8倍（圖1I-K），這可能是由于MAPCr組分消耗ROS并產(chǎn)生NO。PFMACr AMNs在10 mM GSH的模擬生理環(huán)境中12小時內(nèi)迅速降解后保持穩(wěn)定（圖1L），表明其可在細(xì)胞環(huán)境中降解并暴露活性位點。與僅維持3小時ATP合成能力的純PCr相比，PFMACr AMN可使受損心肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平持續(xù)增加至少12小時（圖1M）。400 μg AMNs在10?受損心肌細(xì)胞中的ATP生產(chǎn)能力與10?天然線粒體相當(dāng)（圖1N）。

圖1 PFMACrAMN的制備、口服給藥及基本性質(zhì)。（a）PFMACrAMN的制備方法；（b）PFMACrAMNs產(chǎn)生NO促進(jìn)受損線粒體生物合成，并提供PCr促進(jìn)ATP產(chǎn)生；（c）PFMACrAMN口服給藥的體內(nèi)遞送及治療途徑；（d）不同樣品的TEM圖像（比例尺：200 nm）；（e，f）分散在PBS中的樣品的水合粒度和電位（I：PML，II：PFML，III：PFMA，IV：PMACr，V：PFMACr）；（g）Cy5標(biāo)記的PFMACrAMN（紅色）和FITC標(biāo)記的BSA（綠色）混合溶液在37℃孵育4 h后的熒光圖像（比例尺：10 μm）；（h）37℃孵育4 h后PFMACrAMN（1 mg/mL）和BSA（500 mg/mL）的DLS結(jié)果；（i，j）PFMACrAMN處理的缺氧損傷H9c2細(xì)胞中ROS（i）和NO（j）水平的CLSM圖像（比例尺：50 μm）；（k）i和j的歸一化熒光強度；（l）PFMACrAMNs在PBS或10 mM GSH中降解48 h的相對濁度；（m）PFMACrAMN在缺氧損傷H9c2細(xì)胞中產(chǎn)生ATP的能力；（n）PFMACrAMN與天然線粒體在缺氧損傷H9c2細(xì)胞中產(chǎn)生ATP能力的比較（n=3-4）

（2）趨化運動行為

PFMACr AMNs中的L-Arg組分能夠響應(yīng)損傷心肌細(xì)胞中高表達(dá)的iNOS，誘導(dǎo)其在損傷細(xì)胞中的趨化運動。在靜態(tài)Y形微流體通道模型中，正常H9c2細(xì)胞環(huán)境中，PFML NPs和PFMACr AMNs呈典型布朗運動；而在LPS預(yù)刺激損傷的H9c2細(xì)胞中，PFML NPs仍保持布朗運動軌跡（速度小于1 μm/s），PFMACr AMNs的運動速度則顯著提高至5.2 μm/s（圖2A、B）。在靜態(tài)模型中，將含有正常和預(yù)刺激H9c2細(xì)胞裂解物的瓊脂糖凝膠填充到通道中，PFML NPs在室II和室III的熒光強度無顯著差異（圖2C、D、E），而PFMACr AMNs在室III的熒光強度顯著高于室II，且60分鐘時差異最大，室III熒光強度是室II的6.7倍（圖2F、G），表明PFMACr AMNs能夠感知高濃度iNOS并沿其濃度梯度擴(kuò)散。在動態(tài)“Y”型微流體模型中，當(dāng)兩側(cè)通道均填充正常H9c2細(xì)胞裂解物時，PFML NPs和PFMACr AMNs均未表現(xiàn)出趨化行為（圖2H、I、J）；而當(dāng)一側(cè)通道填充預(yù)刺激H9c2細(xì)胞裂解物時，PFMACr AMNs的紅色熒光向預(yù)刺激側(cè)移動，移動距離為1095.3 μm，而PFML NPs未表現(xiàn)出趨化行為（圖2K、L）。

圖2 PFMACr AMNs在模擬IHD微環(huán)境中的運動行為。（a，b）PFML NP（a）和PFMACr AMN（b）在預(yù)刺激H9c2細(xì)胞中的軌跡和速度分布（20 s，n=10）；（c）靜態(tài)Y形通道示意圖；（d，e）PFML NP添加后不同時間室II和室III的熒光圖像（60分鐘）（d）及歸一化熒光強度（e）（比例尺：500 μm）；（f，g）PFMACr AMNs添加后不同時間室II和室IV的熒光圖像（60分鐘）（f）及歸一化熒光強度（g）（比例尺：500 μm）；（h）動態(tài)微流控裝置示意圖；（i，j）在兩個通道中應(yīng)用正常H9c2細(xì)胞裂解物的微流體裝置中PFML NP和PFMACr AMN的代表性熒光圖像（i）及標(biāo)準(zhǔn)化熒光強度（j）（比例尺：500 μm）；（k，l）施加正常H9c2細(xì)胞裂解物和預(yù)刺激H9c2細(xì)胞裂解物的微流體裝置中PFML NP和PFMACr AMN的代表性熒光圖像（k）及歸一化熒光強度（l）（比例尺：500 μm）

（3）損傷細(xì)胞對PFMACr AMNs的細(xì)胞攝取行為

PFMACr AMNs能夠有效穿透血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障并被受損心肌細(xì)胞攝取。在2D Transwell模型中，PMACr NM的穿透能力優(yōu)于PML NP，而PFMACr AMNs的穿透能力最強（圖3A-C）。在缺氧損傷的H9c2細(xì)胞中，PFMACr AMNs的攝取表現(xiàn)為更突出的紅色熒光信號（圖3D，E）。攝取抑制劑實驗表明，PFMACr AMNs進(jìn)入心肌細(xì)胞主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的途徑和能量依賴的內(nèi)吞途徑。細(xì)胞器定位實驗顯示，PFMACr AMNs聚集在線粒體附近，可能是因為線粒體損傷時釋放大量ROS，而PFMACr AMNs傾向于聚集在ROS濃度高的區(qū)域以轉(zhuǎn)化為NO。此外，其修飾有助于通過疏水相互作用與膜脂質(zhì)融合，并通過疏脂性誘導(dǎo)快速跨膜擴(kuò)散，增強溶酶體逃逸功能（圖3F，G）。

（4）體外治療效果

PFMACr AMNs的MAPCr可與H?O?反應(yīng)產(chǎn)生NO。缺氧損傷的H9c2細(xì)胞中H?O?含量是正常細(xì)胞的2.3倍（圖3H）。PFML NPs處理后H?O?未減少，而非氟PMACr NMs和PFMACr AMNs能消耗缺氧細(xì)胞中的H?O?，使O??和MDA降至空白組水平（圖3I）。氧化應(yīng)激緩解后，損傷相關(guān)分子模式釋放減少，促炎基因表達(dá)和炎性細(xì)胞因子分泌被抑制，TNF-α和IL-6水平回到空白組水平（圖3J）。PFMACr AMNs通過NO降低細(xì)胞質(zhì)Ca2?水平，緩解線粒體鈣超載，經(jīng)Fluo-4 AM標(biāo)記后，缺氧細(xì)胞經(jīng)PFMACr AMNs處理的Ca2?水平恢復(fù)正常（圖3K，L）。JC-1標(biāo)記顯示，PMACr NM和PFMACr AMN處理可使線粒體膜電位恢復(fù)（圖3M，N）。NO還可上調(diào)PGC-1α水平，刺激線粒體生物合成（圖3O）。PFMACr AMNs參與PCr-CK能量穿梭快速合成ATP，與缺氧損傷的H9c2細(xì)胞共孵育后，ATP合成可持續(xù)12小時，使缺氧損傷細(xì)胞中ATP水平與正常細(xì)胞相當(dāng)（5.6和5.2 μm）（圖3P）。此外，PFMACr AMNs還能恢復(fù)細(xì)胞活力，48小時內(nèi)可將缺氧損傷的H9c2細(xì)胞活性維持在91%（圖3Q）。

圖3 PFMACr AMNs的細(xì)胞攝取、選擇性胞吐和體外治療作用。（a）模擬體外HUVEC的PFMACr AMNs滲透Transwell的示意圖；（b，c）缺氧損傷的H9c2細(xì)胞（Transwell下室）的CLSM圖像（b）和歸一化熒光強度（c）（比例尺：50 μm）；（d，e）缺氧損傷的H9c2細(xì)胞中不同樣品的攝取CLSM圖像（d）和歸一化熒光強度（e）（比例尺：50 μm）；（f，g）缺氧損傷的H9c2細(xì)胞線粒體中PML NP（f）和PFMACr AMN（g）的CLSM圖像及共定位結(jié)果（比例尺：50 μm）；（h-j）不同樣品處理后缺氧損傷的H9c2細(xì)胞中H?O?（h）、O??和MDA（i）以及炎癥水平（j）；（k，l）不同樣品處理后缺氧損傷的H9c2細(xì)胞中Ca2?水平和線粒體狀態(tài)的歸一化定量結(jié)果（k）及CLSM圖像（l）（比例尺：50 μm）；（m，n）不同樣品處理后缺氧損傷的H9c2細(xì)胞線粒體狀態(tài)的CLSM圖像（m）和標(biāo)準(zhǔn)化定量結(jié)果（n）（比例尺：50 μm）；（o）PFMACr MNs處理后缺氧損傷的H9c2細(xì)胞中PGC-1α濃度結(jié)果；（p）PFMACr AMNs處理后缺氧損傷的H9c2細(xì)胞中ATP水平變化；（q）PFMACr AMNs處理后缺氧損傷的H9c2細(xì)胞活性

（5）評價 PFMACr AMNs 在體外和體內(nèi)突破多重屏障并靶向受損心臟的能力

PFMACr AMNs在胃腸道環(huán)境中保持穩(wěn)定，其粒徑在pH 1.2和pH 6.8條件下24小時內(nèi)不變（圖4A、B）。酸堿處理后的PFMACr AMNs與缺氧損傷的H9c2細(xì)胞共培養(yǎng)，仍能顯著提升細(xì)胞ATP水平（圖4C），并將NO水平恢復(fù)至正常（圖4D）。其PFA組分可防止粘蛋白吸附，使其在小鼠腸黏液中的擴(kuò)散位移和速度高于PMACr NP。Transwell和離體小腸組織實驗證明PFMACr AMNs能非破壞性地穿透腸屏障。離體器官成像顯示，口服PFMACr AMNs后，其在大鼠腸組織中的熒光強度0.5小時達(dá)高峰，3小時內(nèi)腸系膜微血管熒光強度是PML NPs處理的2.6倍（圖4E-I）。

在小鼠皮下腫瘤模型中，PFMACr AMNs靜脈注射后10分鐘即可突破血管內(nèi)皮屏障，出現(xiàn)在病變組織中（圖4J、K）。在正常小鼠心臟中，PFMACr AMNs主要停留在血管內(nèi)，而在受傷心臟模型中，其可在口服給藥12小時后積聚于心臟組織。與健康大鼠口服PFMACr AMNs（I組）、IHD大鼠口服PML NPs（II組）相比，IHD大鼠靜脈注射（III組）和口服（IV組）PFMACr AMNs后，在受損心臟中熒光信號更強（圖4N）。口服給藥的PFMACr AMNs在IHD損傷心臟中的靶向效率是靜脈內(nèi)給藥的16.3%，而靜脈內(nèi)給藥的靶向效率是口服給藥的135%（圖4O，P）。在健康心臟近端區(qū)域，III組和IV組PFMACr AMNs的熒光強度分別是I組的3.9倍和2.0倍；在iNOS富集的心臟中部和遠(yuǎn)端區(qū)域，III組PFMACr AMNs的熒光累積分別是I組健康心臟遠(yuǎn)端區(qū)域的10.6倍和8.8倍。研究表明，AMNs在心臟損傷部位的蓄積量大于健康部位，且IV組口服PFMACr AMNs顯著增強了其浸潤損傷心臟的能力（圖4Q，R）。

圖4 PFMACr AMN的穩(wěn)定性及其跨越多種生理屏障靶向缺血心臟的能力的表征。（a，b）PFMACr AMNs在pH 1.2（胃pH）（a）和pH 6.8（腸pH）（b）環(huán)境中的DLS監(jiān)測結(jié)果；（c，d）經(jīng)酸（2小時）-堿（6小時）處理的PFMACr AMNs在缺氧損傷的H9c2細(xì)胞中產(chǎn)生ATP（c）和NO（d）的能力，對照為未處理的PFMACr AMNs（I：空白，II：模型，III：未處理的PFMACr AMN，IV：處理的PFMACr AMN）；（e）樣品穿過腸屏障的觀察點示意圖；（f，g）口服施用不同cy5標(biāo)記樣品2小時后大鼠腸組織的離體圖像（f）和定量結(jié)果（g）；（h，i）口服施用不同cy5標(biāo)記樣品3小時后大鼠腸系膜微血管系統(tǒng)的圖像（h）和歸一化熒光強度（i）（比例尺：100 μm）；（j，k）健康C57BL/6小鼠口服施用PML NP（j）和PFMACr AMN（k）2小時后，基于共聚焦技術(shù)的體內(nèi)顯微鏡捕獲的小腸部位連續(xù)圖像（比例尺：100 μm）；（l，m）健康C57BL/6小鼠靜脈內(nèi)注射PFMACr AMNs（l）后10分鐘和心臟損傷C57BL/6小鼠口服施用PFMACr AMNs（m）后12小時，基于共聚焦技術(shù)的體內(nèi)顯微鏡捕獲的從血管釋放到心臟組織中的PFMACr AMNs的連續(xù)圖像（比例尺：100 μm）；（n-p）大鼠口服或靜脈內(nèi)施用12小時后心臟（n）和向心臟（o）及其他主要器官（p）的遞送效率的離體圖像；（q，r）大鼠經(jīng)口或靜脈給藥12小時后cy5標(biāo)記樣品在心臟梗死區(qū)分布的免疫熒光圖像（q）和相應(yīng)的歸一化熒光強度（r）（比例尺：200 μm）

（6）體內(nèi)治療效果

在心肌梗死（MI）模型中研究PFMACr AMNs的治療效果（圖5A）。第7天，靜脈內(nèi)施用的PFMACr AMNs（EF：87.7%）比口服的（EF：78.9%）更好地恢復(fù)心臟功能（圖5B-F），與靶向效率差異一致（圖4O）。增加口服給藥頻率（第VII組）后，IHD大鼠心臟功能持續(xù)改善，第7天EF達(dá)79.7%，但仍低于靜脈給藥組。靜脈注射組心臟功能在給藥周期結(jié)束后逐漸惡化，而持續(xù)口服組在整個28天期間保持穩(wěn)定，表明增加口服頻率可阻止心臟功能惡化。PFMACr AMNs的療效優(yōu)于臨床藥物BB（III組），可能因其直接合成ATP，優(yōu)化缺血心肌的能量代謝。給藥28天后，通過TTC染色觀察各組大鼠心臟損傷面積（圖5G），結(jié)果顯示，與對照組（38.8%）相比，PFMACr AMNs口服7天組（V組）、靜脈注射7天組（VI組）和口服28天組（VII組）均有效縮小梗死面積，左心室AOI比例分別降至14.9%、8.7%和10.5%（圖5H）。Masson染色（圖5I、J）顯示，V組、VI組和VII組纖維化程度顯著低于對照組和BB組。免疫組織化學(xué)CD31染色（圖5K、L）顯示，PFMACr AMNs治療顯著增加CD31陽性細(xì)胞數(shù)量（V組：11.8%，VI組：16.6%，VII組：15.9%），改善缺氧損傷區(qū)域血供。長期口服PFMACr AMNs能有效預(yù)防疾病進(jìn)展，但前7天治療效果低于靜脈給藥組（EF：87.7%）。為驗證是否與累積量差異有關(guān)，增加單次口服劑量（從10 mg/kg增至50 mg/kg），心臟靶向效率從6.3%變化至5.0%，絕對累積量從126 μg/g增加至500 μg/g（圖5M、N）。增加劑量后，第7天IHD大鼠心臟功能恢復(fù)（EF：85.9%）接近靜脈注射組，并在第28天保持穩(wěn)定，接近健康大鼠功能（圖5O、P）。

圖5 PFMACr AMNs對缺血性心臟病大鼠的治療作用。（a）IHD大鼠治療方案示意圖，未治療的IHD大鼠作為對照組；（b）治療后IHD大鼠的M型超聲心動圖；（c，d）治療期間IHD大鼠的EF（c）和FS（d）曲線；（e，f）治療后IHD大鼠中EF（e）和FS（f）的定量結(jié)果；（g，h）梗塞區(qū)域以虛線圈出的代表性圖像（g）及IHD大鼠TTC染色心臟切片中LV的AOI定量（h）；（i，j）纖維化區(qū)域以虛線圈出的代表性圖像（i）及IHD大鼠Masson染色心臟切片中LV纖維化區(qū)域的定量（j）；（k，l）IHD大鼠CD31免疫染色心臟切片的血管密度（k）和CLSM圖像（l）的定量（比例尺：100 μm）；（m，n）大鼠口服或靜脈內(nèi)施用12小時后向心臟（m）和其他主要器官（n）的遞送效率；（o，p）PFMACr AMNs治療7天后大鼠EF（o）和FS（p）的定量結(jié)果（前7天每天兩次，第8-14天每天一次，第15-28天每周兩次）；（I：假手術(shù)大鼠；II：未處理的IHD大鼠；III：IHD大鼠靜脈內(nèi)給予PFMACr AMN，每次10 mg/kg bw；IV：IHD大鼠口服給予PFMACr AMN，每次10 mg/kg bw；V：IHD大鼠口服給予PFMACr AMN，每次50 mg/kg bw）

（7）治療后心臟組織的心臟多組學(xué)分析

對自然線粒體組（Mito組）和AMNs治療組（PFMACr組）的大鼠心臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析?；贕O和KEGG富集分析（圖6A），天然線粒體移植顯著上調(diào)與線粒體代謝和結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的基因，包括線粒體膜、基質(zhì)、內(nèi)膜、脂肪酸β-氧化、TCA循環(huán)和NADH代謝過程。AMNs治療組的基因測序結(jié)果也顯示類似上調(diào)基因（圖6B），表明AMNs可在基因水平上發(fā)揮與天然線粒體類似的功能。同時，下調(diào)基因分析顯示，天然線粒體處理后，與細(xì)胞凋亡、傷口愈合和缺氧反應(yīng)相關(guān)的基因顯著下調(diào)（圖6C），表明心肌細(xì)胞活力和適應(yīng)性增加；AMNs處理后，與炎癥、凋亡和纖維化相關(guān)的基因也顯著下調(diào)（圖6D），表明AMNs修復(fù)了心臟功能。天然和AMNs治療后心臟受損區(qū)域的基因分析顯示，兩者之間僅有262個DEG，且PFMACr對炎癥和免疫相關(guān)通路表現(xiàn)出調(diào)節(jié)作用（圖6E、F），包括上調(diào)白細(xì)胞介素-27信號通路和下調(diào)免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答?；蚣患治觯℅SEA）表明，與對照組相比，Mito組和PFMACr組中與氧化磷酸化和TCA循環(huán)相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，而與細(xì)胞纖維化相關(guān)的基因表達(dá)被抑制（圖6G）。

圖6 天然線粒體和PFMACr AMN處理的IHD大鼠的心臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)。（a-f）GO和KEGG富集分析顯示，與對照組相比，天然線粒體（Mito）組（a，b）和PFMACr組（c，d）中差異表達(dá)的基因，以及與Mito組相比，PFMACr組中差異表達(dá)的基因（e，f）。弦圖：右側(cè)反映分類組成，中間線表示分類和基因?qū)?yīng)關(guān)系，左邊圓圈為GO術(shù)語中的DEG；氣泡圖：氣泡大小表示差異表達(dá)基因數(shù)量；直方圖：GO條目名稱顯示在左側(cè)。（g）應(yīng)用GSEA比較Mito組和對照組之間以及PFMACr組和對照組之間參與氧化磷酸化、TCA循環(huán)和凋亡途徑的基因組