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針對(duì)上述問(wèn)題，重慶大學(xué)的羅忠等團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種基于水凝膠的生物活性合成皮膚（HBSS），該敷料材料由生物相容性組分構(gòu)成，用于燒傷創(chuàng)面的治療，能夠在局部介導(dǎo)硫化氫（H2S）的釋放，以刺激組織再生，同時(shí)抑制細(xì)菌感染和過(guò)度炎癥反應(yīng)。具體而言，H2S供體——N-(苯甲酰巰基)苯甲酰胺首先與巰基酮（TK）連接的多巴胺二聚體共同組裝形成納米結(jié)構(gòu)（DDNs），隨后將其整合進(jìn)以希夫堿為交聯(lián)方式的透明質(zhì)酸-羧甲基殼聚糖水凝膠中。在燒傷創(chuàng)面中升高的酸性環(huán)境可誘導(dǎo)水凝膠降解，釋放出DDNs；隨后，在活性氧（ROS）誘導(dǎo)下，TK連接鍵斷裂，釋放出H2S氣體，同時(shí)以自我消耗方式降低局部ROS應(yīng)激水平。該過(guò)程可通過(guò)激活A(yù)MPK與RAS-MAPK-AP1等促愈合信號(hào)通路，促進(jìn)局部血管生成和組織再生，同時(shí)通過(guò)激活ERK1/2與NRF2信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型的免疫重編程。此外，水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的殼聚糖組分可有效抑制創(chuàng)面部位的細(xì)菌定植，從而防止局部感染。這些特性協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)了快速而穩(wěn)健的燒傷創(chuàng)面愈合，為臨床燒傷治療提供了一種新的思路和策略。該文章于2025年4月10日以《Hydrogel-Based Bioactive Synthetic Skin Stimulates Regenerative Gas Signaling and Eliminates Interfacial Pathogens to Promote Burn Wound Healing》為題發(fā)表于《ACS NANO》（DOI：10.1021/acsnano.5c01134）。

研究示意圖

(1) DDNs和HBSS的制備與表征

透射電子顯微鏡（TEM）分析顯示，生成的DDNs具有均勻的球形形態(tài)和高單分散性（圖1A）。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）分析表明，NSHD的加入使納米粒子的尺寸從200 ± 5 nm略微增加至220 ± 7 nm，但對(duì)納米粒子的單分散性沒(méi)有明顯影響（圖1B）。ζ電位分析顯示，DDNs的表面電荷約為?33.1 mV，與原始PDA納米粒子的電荷（約?31.2 mV）相當(dāng)（圖1C）。能量色散X射線譜（EDS）結(jié)果表明，硫信號(hào)均勻分布在納米粒子中，證實(shí)了NSHD成功加載到PDA基體中（圖1D）。通過(guò)紫外吸收法的定量分析，NSHD在最終納米粒子中的加載比率約為11.2%。這些數(shù)據(jù)共同確認(rèn)了DDNs的高均一性和NSHD加載的簡(jiǎn)便合成。本研究中使用的HBSS是通過(guò)透明質(zhì)酸（HA）和羧甲基殼聚糖（CMC）在希夫堿交聯(lián)作用下合成的。研究人員觀察到，OHA與CMC混合后5分鐘內(nèi)即形成水凝膠（圖1E）。掃描電子顯微鏡（SEM）成像顯示，OHA-CMC水凝膠具有高度多孔和互聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，典型的水凝膠生物材料特性，提供了豐富的空間用于DDN的負(fù)載（圖1F）。環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）結(jié)果顯示，DDNs能夠輕松地結(jié)合到OHA-CMC水凝膠基體中，最終納米粒子負(fù)載量約為85%（圖1G）。此外，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析驗(yàn)證了通過(guò)希夫堿交聯(lián)形成水凝膠，并成功集成了DDNs（圖1H）。

圖1.（A）DDN的TEM圖像。（B）通過(guò)DLS測(cè)量的DDN的粒度和分布。(C)DDN的Zeta電位。（D）DDN的EDS結(jié)果。（E）水凝膠形成過(guò)程的照片說(shuō)明。（F）生成的水凝膠的SEM圖像。（G）HBSS樣品的SEM圖像。（H）HA、OHA、CMC、OHA-CMC和HBSS的FTIR光譜

（2）HBSS的力學(xué)性能、藥物釋放、抗氧化能力和抗菌性能

皮膚組織常受機(jī)械應(yīng)力影響，這對(duì)燒傷創(chuàng)面敷料的機(jī)械穩(wěn)定性構(gòu)成挑戰(zhàn)。研究人員通過(guò)分析HBSS的壓縮和膨脹性能，研究了其在燒傷創(chuàng)面環(huán)境中的穩(wěn)定性。在OHA:CMC比例為3:1時(shí)，OHA-CMC水凝膠和HBSS的膨脹率分別為278%和267%（圖2A），有助于排出創(chuàng)面滲出液并保持濕潤(rùn)環(huán)境，且HBSS的抗壓強(qiáng)度達(dá)到97.4 KPa（圖2B）。流變學(xué)測(cè)試表明，HBSS具有較高的儲(chǔ)能模量，適合作為燒傷創(chuàng)面敷料（圖2C）。HBSS在模擬燒傷創(chuàng)面滲出液中（500 μM H2O2，pH 6.5）孵育后，顯示出良好的降解性能，7天內(nèi)完全降解，剩余重量降至20%（圖2D, 2E）。DDNs在相同條件下處理2天后，TEM顯示其平均水動(dòng)力學(xué)尺寸減少至120 ± 5 nm（圖2F），支持HBSS在創(chuàng)面環(huán)境中的降解釋放治療性載荷。H2S生成測(cè)試表明，酸性環(huán)境和H2O2能促進(jìn)HBSS釋放H2S，4天后H2S釋放量達(dá)到32.5 μM（圖2G）。此外，DDNs具有顯著的抗氧化效果，能夠清除DPPH（圖2H, 2I），進(jìn)一步證實(shí)HBSS能夠有效清除創(chuàng)面過(guò)量ROS，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。研究人員測(cè)試了CMC整合的HBSS對(duì)常見(jiàn)燒傷創(chuàng)面感染病原菌（銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）的抗菌效果。結(jié)果顯示，HBSS組的殺菌效率分別為60.3%、59.3%和67.8%，高于OHA-CMC組（圖2J?K）。細(xì)菌處理后的掃描電鏡（SEM）圖像顯示，細(xì)菌壁塌陷，證實(shí)了HBSS通過(guò)殼聚糖的抗菌作用有效消除附著細(xì)菌，防止創(chuàng)面感染（圖2L）。

圖2.（A）具有不同組成的水凝膠基樣品的溶脹特性。（B）具有不同組成的水凝膠基樣品的壓縮性能。（C）HBSS和OHA-CMC樣品之間生物力學(xué)性能的比較分析。（D）水凝膠基樣品隨時(shí)間降解的照片說(shuō)明。（E）水凝膠基樣品的降解率。（F）H2O2引發(fā)降解前后DDN尺寸的比較。（G）不同條件下HBSS隨時(shí)間的H2S釋放曲線。（H）不同濃度下DDN的DPPH清除能力。（I）無(wú)DDN的OHA-CMC水凝膠和HBSS的DPPH清除能力。（K）不同水凝膠基樣品的抗菌活性的統(tǒng)計(jì)分析。（L）不同處理后金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的SEM圖像

（3）HBSS的體外生物相容性

為了研究HBSS在臨床相關(guān)條件下的安全性，研究人員首先通過(guò)CCK-8法在跨腔培養(yǎng)系統(tǒng)中測(cè)試了其對(duì)皮膚細(xì)胞群體的生物相容性（圖3A），其中水凝膠放置在上室，細(xì)胞接種在下室。測(cè)試的細(xì)胞系包括HUVECs、L929s和RAW 264.7。結(jié)果表明，HUVECs、L929s和RAW 264.7細(xì)胞在與HBSS孵育3天后，細(xì)胞活力未出現(xiàn)明顯下降（圖3B、C）。這些結(jié)果也通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）進(jìn)一步驗(yàn)證（圖3E）。這些觀察結(jié)果表明，由于選用了生物相容性生物聚合物成分，HBSS無(wú)毒。為確保足夠的ROS清除效果，使用ROS反應(yīng)性熒光探針DCFH-DA進(jìn)行的熒光成像顯示，HBSS處理能有效清除細(xì)胞內(nèi)的ROS（圖3D），再次驗(yàn)證了HBSS衍生的巰基化多巴胺單元對(duì)ROS清除的貢獻(xiàn)（圖3F）。有趣的是，WB分析顯示，HBSS處理顯著激活了巨噬細(xì)胞群體中的Nrf2信號(hào)通路（圖3G?I），這是一種在活細(xì)胞中已知的抗氧化機(jī)制，可能有助于清除燒傷創(chuàng)面引發(fā)的皮膚細(xì)胞中的ROS。Nrf2和血紅素加氧酶-1（HO-1）的相對(duì)表達(dá)分別比對(duì)照組高出108%和92%?？傮w而言，HBSS能夠高效減輕生物環(huán)境中的ROS應(yīng)激，且具有較高的安全性，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖3.（A）transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖。（B）與不同樣品孵育3天后的L929存活率（。（C）與不同樣品孵育3天后的HUVEC存活率。（D）響應(yīng)于不同處理的L929細(xì)胞和HUVEC中ROS的相對(duì)含量。（E）顯示不同處理后L929細(xì)胞和HUVEC增殖的熒光圖像（（F）不同樣品減輕皮膚相關(guān)細(xì)胞中氧化應(yīng)激的能力。（G）用不同樣品處理后巨噬細(xì)胞中Nrf 2和HO-1蛋白的表達(dá)水平。（H）不同處理后巨噬細(xì)胞中Nrf 2蛋白的相對(duì)表達(dá)。（I）HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)。處理組的設(shè)置：NaSH、對(duì)照（PBS）、OHA-CMC水凝膠、水凝膠-PDA NP復(fù)合物（HPN）和負(fù)載NSHD的水凝膠（HN）組

圖4. (A)不同處理后L929 s、HUVECs和RAW 264.7細(xì)胞中的H2S水平。（B）HUVECs的管形成效率。（C）血管分支數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析。（D）不同處理后血管長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)分析。（E）AMPK、p-AMPK、TXNIP、（F）不同處理后L929細(xì)胞的遷移能力。（G）不同處理后L929細(xì)胞中MEK 1、AP-1和RAS蛋白的表達(dá)

（5）HBSS的抗炎作用

為研究HBSS是否通過(guò)改變巨噬細(xì)胞組成來(lái)逆轉(zhuǎn)SBW的炎癥狀態(tài)，研究人員首先用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸1表型，并監(jiān)測(cè)其形態(tài)學(xué)變化。LPS處理后的RAW 264.7細(xì)胞表現(xiàn)為橢圓形和突觸形態(tài)，且iNOS表達(dá)顯著上調(diào)，表明成功誘導(dǎo)為促炎M1型表型。與此相比，HBSS處理后的LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞表現(xiàn)出從變形蟲形態(tài)到梭形形態(tài)的顯著變化，天線形成減少（圖5A），并伴隨M2特征標(biāo)記物CD206的上調(diào)。免疫熒光分析顯示，HBSS處理的巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)降低，而CD206表達(dá)增加（圖5B）。在巨噬細(xì)胞表型變化的基礎(chǔ)上，研究人員進(jìn)一步通過(guò)ELISA測(cè)試評(píng)估了培養(yǎng)體系中的細(xì)胞因子分泌情況。LPS誘導(dǎo)顯著降低抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10的分泌，同時(shí)增加了促炎細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1β的分泌，表明巨噬細(xì)胞的促炎潛力增強(qiáng)。與此不同，HBSS處理LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞顯著增加了IL-4和IL-10的分泌，同時(shí)減少了IL-1β和TNF-α的分泌（圖5C?F）。這些趨勢(shì)與q-PCR分析中相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平的結(jié)果一致，表明HBSS能夠?qū)1型巨噬細(xì)胞重新編程為M2型表型，從而抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)（圖5G?J）。進(jìn)一步分析HBSS處理后巨噬細(xì)胞的生化變化，證實(shí)了多巴胺單體和H?S通過(guò)清除創(chuàng)面微環(huán)境中的ROS，能夠阻斷相關(guān)的促炎信號(hào)事件，從而減輕局部炎癥。WB分析顯示，HBSS處理顯著激活了MAPK-Erk1/2-p38信號(hào)通路，這與H?S的抗炎作用一致（圖5K?M）。因此，這些作用協(xié)同介導(dǎo)了M1型巨噬細(xì)胞向M2型的高效重編程，并抑制了下游的炎癥反應(yīng)。

圖5. (A)各種處理后LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。（B）用樣品處理后LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中CD 206和iNOS的表達(dá)。（C-F）用不同樣品處理后不同巨噬細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10的表達(dá)水平。（G-J）用不同樣品處理后不同巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的表達(dá)。（K）WB檢測(cè)不同樣品處理后巨噬細(xì)胞中p-p38和p-Erk 1/2蛋白的表達(dá);（L）不同樣品處理后巨噬細(xì)胞中p-Erk 1/2蛋白的相對(duì)表達(dá);（M）不同樣品處理后巨噬細(xì)胞中p-Erk 1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)。p38的表達(dá)

（6）HBSS在體內(nèi)的SBW治療功效

研究人員在背部帶有1 cm2圓形感染性三度燒傷創(chuàng)面的小鼠模型上全面研究了HBSS治療對(duì)燒傷創(chuàng)面（SBW）愈合的促進(jìn)作用（圖6A）。HBSS治療顯著減少了創(chuàng)面面積，治療14天后創(chuàng)面幾乎完全愈合，表面形成小結(jié)痂，并無(wú)感染跡象（圖6B）。相比之下，控制組和OHA-CMC組在第14天創(chuàng)面明顯較大，創(chuàng)面處有可見(jiàn)滲出液，表明感染性SBW的愈合不足。定量分析顯示，HBSS組的最終創(chuàng)面面積最小，比治療組的對(duì)照組小35%（圖6C）。通過(guò)HE染色和Masson三色染色進(jìn)一步分析了不同治療組的SBW愈合情況，在治療7天時(shí)，HBSS組顯著提高了創(chuàng)面區(qū)域的上皮覆蓋度，并部分再生了受損的毛囊（圖6E）。到治療第14天，HBSS組創(chuàng)面幾乎完全愈合，創(chuàng)面上皮完全重建。Masson染色結(jié)果顯示，HBSS組的膠原沉積優(yōu)于其他所有組，幾乎與健康皮膚組織相當(dāng)（圖6F）。另外，研究人員通過(guò)免疫熒光染色CD31和Ki67檢測(cè)了創(chuàng)面組織的血管化，表明創(chuàng)面再生的強(qiáng)度（圖7A）。HBSS組的毛細(xì)血管密度是對(duì)照組的1.9倍，明顯高于其他處理組（圖7B、C），表明創(chuàng)面區(qū)域的血管系統(tǒng)成功恢復(fù)，促進(jìn)了適當(dāng)?shù)膫谟稀B分析顯示，HBSS處理顯著激活了AMPK和AP1信號(hào)通路（圖6D），這一結(jié)果與體外數(shù)據(jù)一致，支持了提出的傷口愈合機(jī)制。這些數(shù)據(jù)表明，HBSS可以高效加速感染性SBW的愈合，且具有較高的安全性。

圖6.（A）實(shí)驗(yàn)方案的示意圖。（B）顯示從第0天到第14天的各種治療后建立的SBW傷口的時(shí)間依賴性愈合的代表性照片。（C）從第0天到第14天的不同治療后傷口面積的定量分析。比例尺：（D）不同處理后小鼠中關(guān)鍵蛋白介質(zhì)表達(dá)的WB測(cè)定。（E，F(xiàn)）第7天和第14天傷口組織的代表性（E）H&E和（F）Masson染色圖像

（7）HBSS介導(dǎo)的體內(nèi)巨噬細(xì)胞重編程

研究人員進(jìn)一步分析了燒傷創(chuàng)面（SBW）部位的巨噬細(xì)胞組成，以闡明愈合機(jī)制。結(jié)果顯示，控制組的SBW組織在治療7天后表現(xiàn)出高水平的iNOS和低水平的CD206，表明創(chuàng)面仍受到嚴(yán)重炎癥的影響。相比之下，HBSS治療顯著上調(diào)了CD206的表達(dá)，同時(shí)降低了iNOS的表達(dá)（圖7D、E）。具體而言，HBSS組CD206的水平比未處理的對(duì)照組高1.92倍，而iNOS水平降低了62.14%（圖7F、G），表明HBSS治療能夠有效地將巨噬細(xì)胞從促炎M1表型重編程為抗炎M2表型，有助于緩解SBW部位的過(guò)度炎癥反應(yīng)。同時(shí)，通過(guò)PCR檢測(cè)創(chuàng)面組織中與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子的mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBSS治療顯著下調(diào)了TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)，同時(shí)恢復(fù)了IL-4和IL-10的mRNA表達(dá)，其細(xì)胞豐度與健康皮膚組織相當(dāng)（圖7H?K）。此外，創(chuàng)面組織的生化分析顯示，HBSS顯著激活了NRF-2和ERK1/2信號(hào)通路，有效抑制了過(guò)度的炎癥反應(yīng)（圖7L?O）。綜上所述，HBSS能夠通過(guò)減輕巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)SBW的愈合。

圖7.(A)治療14天后傷口的CD 31和Ki 67免疫染色。（B）CD 31表達(dá)的統(tǒng)計(jì)。（C）Ki 67表達(dá)的統(tǒng)計(jì)。（D）治療14天后傷口中CD 206表達(dá)的免疫染色。(E)治療14天后傷口中的iNOS免疫染色。（F）CD 206表達(dá)的統(tǒng)計(jì)。（G）iNOS表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析（細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記）。（H?K）正常小鼠皮膚和不同實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的相對(duì)表達(dá)，（L）WB檢測(cè)不同處理后小鼠p-Erk 1/2和p-p38蛋白的表達(dá)。(M)不同處理后小鼠中Nrf 2和HO-1蛋白的WB測(cè)定。（N-O）圖L和M中蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)