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研究背景：

針對上述問題，山東第一醫(yī)科大學(xué)王昌龍教授團隊開發(fā)出形態(tài)可切換的Au納米線（ANW），與血紅蛋白（Hb）-白藜蘆醇（RES）納米顆粒（HR）經(jīng)微針共同遞送，用于糖尿病傷口的協(xié)同治療。制備時，通過調(diào)節(jié)聚乙二醇（PEG）的量和超聲處理將ANW轉(zhuǎn)變?yōu)锳u納米球（AS）以提高遞送效率；治療時，AS濃度依賴性解聚為ANW，憑其葡萄糖氧化酶活性持續(xù)消耗葡萄糖。將該納米材料用于PVA微針并與HR共遞，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中，微針降解，HR協(xié)同改善缺氧、清除ROS、抑制巨噬細胞向M1表型分化，ANW持續(xù)降糖。本研究提出糖尿病傷口愈合中長期控糖新策略，并應(yīng)用于基于微針的協(xié)同治療系統(tǒng)。該文章于2025年3月11日以《Co-Delivery of Morphologically Switchable Au Nanowire and Hemoglobin-Resveratrol Nanoparticles in the Microneedle for Diabetic Wound Healing Therapy》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202419430）。

研究示意圖

（1）ANW與AS的構(gòu)建與表征

本研究選用直徑約1.6納米、長度達數(shù)微米的超薄金納米線（ANW）作為降糖劑，通過簡單溶液還原法合成，并在室溫下用SH-PEG2000-COOH（PEG）替換其表面的油胺（OA）封端配體（圖1A）。高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM）圖像顯示，ANW-PEG長度超4微米，直徑始終低于2納米（圖1B）。HRTEM成像結(jié)合能量色散X射線（EDX）圖譜及光譜分析確認了金納米線的成功構(gòu)建（圖1C、D）。不同形式的ANW（ANW-OA和ANW-PEG）的葡萄糖氧化酶活性測試表明，ANW-PEG因去除了致密的油胺層而展現(xiàn)出高葡萄糖消耗效率，驗證了其在糖尿病傷口區(qū)域消耗葡萄糖的可行性（圖1E）。在超聲條件下，通過調(diào)節(jié)PEG濃度，開發(fā)了形態(tài)可切換的ANW，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榻鸺{米球（AS）。當PEG濃度從10微克/毫升降至8微克/毫升時，納米線開始自組裝成環(huán)；當PEG濃度為5微克/毫升時，出現(xiàn)粒徑約200納米的納米球；當PEG濃度降至2微克/毫升時，AS粒徑無明顯變化，但進一步降至0.5微克/毫升時，ANW開始團聚沉淀（圖1F、G）。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，組裝的AS直徑在150至300納米之間（圖1H），HRTEM成像結(jié)合元素圖譜及EDX光譜分析進一步確認了AS的成功構(gòu)建（圖1I、J）。自組裝成AS后，其Zeta電位從?15.7±0.5毫伏降至?13.42±0.8毫伏（圖1K）。當AS濃度稀釋至0.01毫克/毫升（金）時，開始解聚為分散的ANW，而濃度高于0.1毫克/毫升（金）時保持穩(wěn)定，這可能歸因于在低濃度下，疏水-親水平衡被打破，水合作用增強，導(dǎo)致穩(wěn)定性下降（圖1L、M）。

圖1. 金納米球（AS）納米顆粒的構(gòu)建與表征。A）金納米線和金納米球的合成示意圖；B）ANW-PEG（聚乙二醇修飾的金納米線）的透射電子顯微鏡（TEM）圖像；C）ANW-PEG的高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM）圖像和能量色散X射線（EDX）圖譜；D）ANW-PEG的EDX光譜微分析；E）分別與ANW-OA（油胺修飾的金納米線）和ANW-PEG孵育的葡萄糖溶液中葡萄糖酸濃度變化曲線；F）AS自組裝過程的示意圖；G）經(jīng)不同濃度的SH-PEG2000-COOH（PEG）超聲處理后ANW的典型TEM圖像；H）ANW-PEG2000超聲處理30分鐘后，水中AS的TEM圖像；I）AS的典型HRTEM圖像和EDX圖譜；J）AS的EDX光譜微分析；K）通過納米顆粒跟蹤分析（NTA）得到的AS的粒徑和ζ電位分布；L）AS解聚過程的示意圖；M）在不同濃度的分散于水中的AS解聚過程的典型TEM圖像

（2）ASHR微針的構(gòu)建和表征

將金納米球（AS）與由攜氧血紅蛋白（Hb）和抗炎白藜蘆醇（RES）自組裝而成的HR納米顆粒共同封裝到微針中，用于協(xié)同治療（圖2A）。TEM和DLS測量顯示，HR納米顆粒的粒徑約為150納米，表面電位約為?30毫伏（圖2B、C）。HR納米顆粒在4℃的PBS中儲存八天后粒徑無明顯變化，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性（圖2D）。其UV-vis-NIR光譜顯示出RES和Hb的特征吸收峰，證實RES成功負載到Hb中（圖2E）。在缺氧環(huán)境中，HR納米顆粒能逐漸釋放氧氣，保留了攜氧和釋氧能力（圖2F），并保留了清除活性氧（ROS）的能力，ESR光譜顯示其對?OH和O??的清除作用（圖2G、H），且隨著HR濃度增加，總ROS以劑量依賴的方式減少（圖2I）。這些結(jié)果表明，HR納米顆?？删徑馓悄虿诘娜毖醪⑶宄齊OS，與AS降解葡萄糖協(xié)同作用，促進有效的傷口愈合治療。隨后，將AS與HR納米顆粒共同負載到聚乙烯醇（PVA）微針中，微針設(shè)計為圓錐形，高度550微米，底部寬度300微米，針間距500微米（圖2J、K）。熒光成像和EDX圖譜分析顯示，HR納米顆粒和AS在微針中均勻分布，證明ASHR微針構(gòu)建成功（圖2L、M）。攜氧HR納米顆粒（HR（+））與AS的協(xié)同效應(yīng)測試表明，ASHR（+）組中葡萄糖酸的生成量高于ASHR組，說明氧氣增強了AS對葡萄糖的催化作用（圖2N）。在葡萄糖溶液中，不同濃度的ASHR（+）未觀察到DCFH-DA熒光顯著增加，表明AS催化葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生的H?O?并未提高ASHR（+）系統(tǒng)中的總自由基水平，這可能歸因于HR（+）中的白藜蘆醇對自由基的消耗（圖2O）。為評估存在生物膜屏障時ASHR（+）的遞送效率，建立了模擬傷口屏障的體外模型，生物膜由表達綠色熒光蛋白（GFP）的大腸桿菌在瓊脂糖凝膠中形成并培養(yǎng)7天。將標記有Cy5的ASHR（+）微針應(yīng)用于模具頂部以模擬局部藥物遞送，同時將游離的ASHR（+）添加到模具頂部作為對照。激光共聚焦顯微鏡數(shù)據(jù)顯示，微針顯著提高了ASHR（+）向目標區(qū)域的遞送效率（圖2P），而游離的ASHR（+）穿透效率有限，主要局限于屏障表面（圖2Q），從而阻礙了其到達更深目標區(qū)域的能力。總體而言，這些結(jié)果表明ASHR（+）微針能夠克服慢性傷口中的屏障，將藥物直接遞送至病變部位以發(fā)揮治療功能。

圖2. ASHR（+）微針的構(gòu)建與表征。A）ASHR（+）微針設(shè)計的示意圖；B）HR納米顆粒的透射電子顯微鏡（TEM）圖像；C）HR納米顆粒在水中的粒徑和ζ電位；D）HR納米顆粒八天的穩(wěn)定性和分散系數(shù)變化曲線；E）血紅蛋白（Hb）、白藜蘆醇（RES）和HR納米顆粒的紫外-可見-近紅外（UV-vis-NIR）吸收光譜；G）加入Hb、RES和HR納米顆粒后對?OH清除情況的電子自旋共振（ESR）分析；H）加入Hb、RES和HR納米顆粒后對O2?清除情況的ESR分析；I）以DCFH-DA作為活性氧（ROS）探針，不同濃度的HR納米顆粒對ROS的清除情況；J）ASHR微針的形態(tài)；K）ASHR微針的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像；L）ASHR微針的熒光圖像；M）ASHR的高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM）圖像和元素圖譜；N）與AS微針和ASHR（+）微針孵育后葡萄糖酸濃度變化曲線；O）以DCFH-DA作為ROS探針，ASHR（+）微針對ROS的清除情況；P-Q）ASHR（+）微針（P）和游離的ASHR（+）（Q）在體外生物膜和瓊脂糖凝膠中的穿透深

（3）ASHR對糖尿病傷口愈合的體外協(xié)同治療效果分析

在體外研究中，ASHR展現(xiàn)出協(xié)同治療效果。其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效率均約為90%，具有廣譜且高效的抗菌特性（圖3A、B）。死活細胞染色實驗進一步證實了ASHR的抗菌效果（圖3C），這可能源于超薄金納米線誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及白藜蘆醇的天然抗菌活性。細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測顯示，即使在較高濃度下，ASHR對真核細胞（L929細胞）也幾乎無影響（圖3D）。在糖尿病傷口愈合過程中，ASHR可降低傷口微環(huán)境中的葡萄糖濃度，促進愈合。與PBS組和HR組相比，L929細胞在與AS或ASHR孵育后，細胞內(nèi)葡萄糖的熒光信號顯著降低（圖3E、I）。HR有望清除AS消耗葡萄糖過程中產(chǎn)生的過氧化氫（H?O?），平衡氧化還原微環(huán)境。在營造病理性氧化微環(huán)境的條件下，HR納米顆粒顯著降低了細胞內(nèi)ROS的濃度（圖3F、J）。攜氧的HR（+）能顯著改善細胞缺氧狀況，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）免疫熒光染色結(jié)果表明，HR（+）在糖尿病傷口愈合中具有緩解缺氧的作用（圖3G、K）。在由干擾素-γ（IFN-γ）和脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥條件下，含有白藜蘆醇的HR組和ASHR組中CD86（M1型巨噬細胞的標志物）表達顯著降低（圖3H、L），表明白藜蘆醇有效調(diào)節(jié)了巨噬細胞的表型。在缺氧、ROS和高糖條件下，ASHR（+）組表現(xiàn)出最顯著的促進L929細胞遷移作用（圖3M、N）。此外，ASHR（+）對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）具有保護作用。在缺氧、高糖和氧化條件下，ASHR（+）組的線粒體保護效果最佳（圖3O、P），且表現(xiàn)出最高的血管生成能力（圖3Q）。

圖3. ASHR的體外協(xié)同治療效果分析。A）與磷酸鹽緩沖液（PBA）、AS、HR或ASHR孵育后大腸桿菌活性的定量分析；B）與PBA、AS、HR或ASHR孵育后金黃色葡萄球菌活性的定量分析；C）與PBA、AS、HR或ASHR孵育后大腸桿菌的死活細胞染色分析；D）ASHR對L929細胞的細胞毒性評估；E）用PBS、HR、AS和ASHR處理后，與2-NBDG孵育的L929細胞內(nèi)葡萄糖含量的代表性熒光圖像；F）用PBS、HR、AS和ASHR處理12小時后，L929細胞中活性氧（ROS）的代表性熒光圖像；G）用PBS、HR、HR（+）和ASHR（+）處理12小時后，L929細胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達的代表性熒光圖像；H）用PBS、HR、AS或ASHR處理12小時后，RAW 264.7細胞中CD86表達的代表性熒光圖像；I–L）圖（D）、（E）、（F）和（G）的相應(yīng)定量分析；M）在不同條件下處理12小時后，L929細胞遷移的代表性圖像；N）圖M中細胞遷移的定量分析；O）用PBS、HR、HR（+）、AS或ASHR處理后，與人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）用JC-1試劑盒孵育后的線粒體膜電位染色；P）圖O中單體的定量分析；Q）不同組處理12小時后，HUVECs管腔形成的代表性圖像

（4）糖尿病傷口小鼠模型中的體內(nèi)分布分析

在糖尿病傷口小鼠模型中，測試了形態(tài)可切換的金納米線（ANW）的效果，并與市售金納米顆粒（Au NPs）和金納米球（AS）進行了對比。將Au NPs、ANW和AS用SH-PEG2000-Cy5標記并載入微針中，插入血糖水平為11 mM的空腹小鼠背部區(qū)域后，ANW組和AS組的熒光信號至少持續(xù)了96小時，而市售Au NPs在6小時內(nèi)就被迅速清除（圖4A、B）。定量分析顯示，AS在皮下的保留時間是市售相同尺寸Au NPs的4倍。在插入微針24小時后，處死另一組接受相同處理的小鼠，收集皮膚和主要器官進行熒光成像和組織切片分析。結(jié)果顯示，AS在皮膚內(nèi)均勻分散，三維表面圖分析中出現(xiàn)多個明顯峰值；ANW組呈現(xiàn)聚集結(jié)構(gòu)，表面圖中僅出現(xiàn)一個峰值；市售Au NPs已完全代謝，表面圖中無峰值，且在肝臟和脾臟中檢測到來自Au NPs的熒光信號（圖4C-E）。這些數(shù)據(jù)證實了AS具有更優(yōu)的分布特性和更長的保留時間。

圖4. AS微針的體內(nèi)分布分析。A）給予金納米顆粒-Cy5微針（Au NPs-Cy5 MN）、金納米線-Cy5微針（ANW-Cy5 MN）或金納米球-Cy5微針（AS-Cy5 MN）后，在指定時間點糖尿病模型小鼠的代表性體內(nèi)熒光圖像；B）在（A）中接受不同處理后小鼠皮膚的平均熒光強度（MFI）定量分析；C）接受Au NPs-Cy5 MN、ANW-Cy5 MN或AS-Cy5 MN處理24小時后，切除的皮膚和主要器官的熒光成像；D）接受Au NPs MN、ANW MN或AS MN處理24小時后，皮膚和主要器官的代表性熒光圖像；E）使用Cy5熒光通道得到的Au NPs、ANW和AS微針的三維表面圖圖像

（5）ASHR（+）微針的體內(nèi)治療效果分析

在鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠傷口模型中，ASHR（+）微針展現(xiàn)出顯著的治療效果。與PBS組相比，HR治療顯著提高了傷口愈合率，而HR（+）組的治療效果更為顯著，這主要歸因于攜氧血紅蛋白改善缺氧的能力以及白藜蘆醇的抗炎能力（圖5B-D）。值得注意的是，ASHR（+）組的聯(lián)合治療效果最為優(yōu)越。在第15天，ASHR（+）處理的傷口在肉芽組織厚度增加、表皮再生和傷口長度減小方面表現(xiàn)最為顯著（圖5E）。此外，ASHR（+）組中觀察到豐富且排列整齊的膠原纖維，表明其治療效果最為顯著（圖5F）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，HR（+）組和ASHR（+）組中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達水平顯著低于其他組，表明攜氧血紅蛋白帶來了更優(yōu)越的氧氣供應(yīng)（圖5G）。對M1型標志物CD86和M2型標志物CD206的免疫熒光染色顯示，HR組、HR（+）組和ASHR（+）組中CD86表達降低，而CD206表達上調(diào)，表明M2/M1比值增加，抗炎能力增強（圖5H、I）。在血管生成方面，HR（+）組和AS組中CD31的表達顯著高于PBS組和HR組，而ASHR（+）組中CD31的表達水平最高，表明其促血管生成能力最為優(yōu)越（圖5J）。因此，ASHR（+）組通過促進表皮形成、膠原沉積和新生血管生成，加速了糖尿病傷口的愈合。

圖5. ASHR（+）微針的體內(nèi)治療效果分析。A）治療效果分析的實驗設(shè)計示意圖；B）不同治療組小鼠的體內(nèi)傷口愈合圖像；C）不同治療組從第0天到第8天傷口愈合過程的示意圖像；D）不同治療組傷口面積的定量分析；E）不同治療組肉芽組織形成和再上皮化的蘇木精-伊紅（H&E）分析；F）不同治療組傷口皮膚組織的代表性馬松染色圖像；G）不同治療組傷口的代表性缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）染色圖像；H、I）第6天感染組織中CD86（紅色）和CD206（綠色）的免疫熒光圖像；J）不同治療組傷口的代表性CD31染色圖像