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針對上述問題，中國科學(xué)院國家納米科學(xué)中心聶廣軍教授、中國科學(xué)院大學(xué)張銀龍教授開發(fā)了一種基于點擊化學(xué)的介孔二氧化硅納米陷阱（SiO?-Mal），用于逆轉(zhuǎn)氯吡格雷和普拉格雷的功能，以防止出血風(fēng)險，研究表明其在體外和動物模型中均能有效恢復(fù)血小板聚集功能，并具有進一步開發(fā)臨床應(yīng)用的潛力。該研究于2025年4月8日以《Mesoporous Silica Nanotraps for Mitigating Bleeding Risk From ‘Irreversible’ Antiplatelet Drugs》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（DOI：10.1002/adma.202501576）。

圖1 研究示意圖

(1) SiO? - Mal納米陷阱的制備與表征

通過溶膠 - 凝膠法合成介孔二氧化硅納米粒子并用馬來酰亞胺基團功能化，形成SiO? - Mal納米阱，用于捕獲氯吡格雷和普拉格雷的活性代謝物。圖2A展示了凍干的SiO? - Mal納米阱。TEM成像顯示SiO?（圖2B）和SiO? - Mal（圖2C）均為均勻球形，直徑約100 nm。DLS分析表明，SiO?尺寸為164.3 nm，SiO? - Mal尺寸為173.4 nm，且分布較窄（圖2D）。馬來酰亞胺基團引入后，SiO?表面電荷從 - 35.9 mV變?yōu)?- 33.9 mV（圖2E）。儲存三個月后，DLS分析顯示SiO? - Mal穩(wěn)定性良好（圖2D、E）。N?吸附 - 解吸分析證實了有序介孔結(jié)構(gòu)，主要孔徑約4.25 nm，改性后孔徑略有變化（圖2F - I）。SiO?的BET表面積為773.8 m2 g?1，總孔容為1.26 cm3 g?1，改性后SiO? - Mal的BET表面積為747.4 m2 g?1，孔容為1.18 cm3 g?1。TEM映射成像和EDS分析表明硅烷 - PEG - Mal改性成功（圖2J）。TGA顯示改性硅烷 - PEG - Mal在SiO? - Mal中的含量為8.13%。馬來酰亞胺定量試劑盒測得SiO? - Mal的馬來酰亞胺基團含量為133.1±2.6 μmol g?1。FTIR驗證了馬來酰亞胺基團修飾成功（圖2K）。TEM映射成像證實SiO? - Mal可與活性代謝物CLP - AM或PRA - AM結(jié)合，每個SiO? - Mal納米粒子可捕獲1.98×10?個CLP - AM分子或2.86×10?個PRA - AM分子（圖2L）。

圖2 SiO?-Mal納米阱的表征。（A）凍干SiO?-Mal納米阱照片；（B-C）SiO?和SiO?-Mal的TEM圖像（比例尺100 nm）；（D）3個月后SiO?、SiO?-Mal的尺寸分布；（E）3個月后SiO?、SiO?-Mal的Zeta電位；（F-I）SiO?和SiO?-Mal的N?吸附-解吸等溫線及BJH孔徑分布曲線；（J）SiO?和SiO?-Mal的TEM映射圖像（比例尺50 nm）；（K）FTIR光譜；（L）與CLP-AM或PRA-AM孵育后SiO?-Mal的元素分布映射圖像（比例尺100 nm）

（2）SiO? - Mal納米陷阱與體外活性代謝物的結(jié)合能力

由于氯吡格雷和普拉格雷需經(jīng)肝臟代謝成活性化合物，研究使用其活性代謝物進行體外實驗。模擬計算顯示，CLP - AM與P2Y??受體結(jié)合能為 - 12.07 kcal mol?1，與SiO? - Mal納米阱馬來酰亞胺基團結(jié)合能為 - 98.74 kcal mol?1，表明SiO? - Mal對CLP - AM親和力更強（圖3A - C）。表面等離子體共振（SPR）實驗測得SiO? - Mal與CLP - AM、PRA - AM的結(jié)合親和常數(shù)（KD值）分別約為1.44×10?? M和2.59×10?? M，顯示其與活性代謝物結(jié)合力強（圖3D - F）。流式細(xì)胞術(shù)實驗表明，隨著CLP - AM濃度增加，P2Y??抗體與血小板結(jié)合率降低，而SiO? - Mal納米阱可濃度依賴性地增加該結(jié)合率，降低CLP - AM在靜息血小板表面占據(jù)的P2Y??受體比例（圖3G - K）。類似地，SiO? - Mal納米阱也能有效降低PRA - AM在靜息血小板表面占據(jù)的P2Y??受體比例（圖3L - O；）。

圖3 SiO?-Mal納米阱與CLP-AM或PRA-AM的結(jié)合能力。（A）CLP-AM與P2Y??受體的優(yōu)化構(gòu)象結(jié)構(gòu)；（B）CLP-AM與P2Y??受體及SiO?-Mal的分子結(jié)構(gòu)；（D）SPR分析示意圖；（E-F）SPR分析SiO?-Mal與CLP-AM（E）或PRA-AM（F）的解離常數(shù)（K?）；（G）流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)合率的示意圖；（H-K）流式細(xì)胞術(shù)檢測CLP-AM與P2Y??受體的結(jié)合率（SiO?-Mal濃度為0、0.05、0.2、0.5 mg/mL，CLP-AM濃度為2（H）、5（I）、30（J）、60 μM（K））；（L-O）流式細(xì)胞術(shù)檢測PRA-AM與P2Y??受體的結(jié)合率（SiO?-Mal濃度為0、0.05、0.2、0.5 mg/mL，PRA-AM濃度為2（L）、5（M）、30（N）、60 μM（O））

（3）SiO? - Mal納米陷阱體外對CLP-AM或PRA-AM的功能逆轉(zhuǎn)

血小板聚集實驗表明，與PBS組相比，CLP-AM顯著抑制了ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，而SiO?-Mal納米阱的加入則有效減輕了這種抑制作用，且隨著納米阱濃度的增加，血小板聚集率顯著提升（圖4B、D）。類似地，PRA-AM也能抑制血小板聚集，但SiO?-Mal納米阱同樣能以濃度依賴性方式恢復(fù)其聚集功能（圖4C、E）。此外，在巴馬豬和健康人類志愿者的PRP中，SiO?-Mal納米阱也展現(xiàn)出對CLP-AM的逆轉(zhuǎn)效果（圖S7-S10）。在體內(nèi)實驗中，氯吡格雷或普拉格雷處理的小鼠PRP中，ADP誘導(dǎo)的血小板聚集顯著降低，而與SiO?-Mal納米阱聯(lián)合使用時，聚集率顯著升高，表明其在體內(nèi)也能有效逆轉(zhuǎn)抗血小板活性（圖S11-S13）。機制上，CLP-AM與P2Y??受體結(jié)合雖穩(wěn)定，但血液中的還原物質(zhì)（如GSH）可促進其解離，而SiO?-Mal納米阱通過競爭性結(jié)合CLP-AM，進一步增強逆轉(zhuǎn)效果，血漿置換實驗也顯示血小板聚集率略有增加，表明二硫鍵形成是動態(tài)過程（圖4I；圖S14-S15）。血栓彈力圖（TEG）分析顯示，SiO?-Mal納米阱顯著降低了CLP-AM和PRA-AM誘導(dǎo)的血小板抑制率，增加了血凝塊強度（MA ADP），并縮短了凝血時間（R和K時間）（圖4J-M）。血凝塊形成實驗直觀地表明，SiO?-Mal納米阱顯著加快了因CLP-AM和PRA-AM延遲的血凝塊形成速度（圖4O）。

圖4 SiO?-Mal納米阱和CLP-AM或PRA-AM對血小板功能的影響。（A）血小板聚集試驗示意圖；（B-C）與CLP-AM（B）或PRA-AM（C）孵育并添加不同濃度SiO?-Mal納米阱后，ADP誘導(dǎo)的血小板聚集；（D-E）定量B（D）和C（E）中的血小板聚集率；（F）采集全血并制備富含血小板的血漿（PRP）的示意圖；（G）與不同藥物孵育后的人體血小板聚集率；（H）定量G中的人體血小板聚集率；（I）不同治療組（包括CLP-AM、新鮮血漿置換或不同濃度的GSH）的血小板聚集率；（J-N）TEG血小板映射試驗。（J）CLP-AM處理并添加SiO?-Mal納米阱的樣品的ADP誘導(dǎo)的血小板抑制率和MA???；（K）CLP-AM處理并添加SiO?-Mal納米阱的樣品的R時間和K時間；（L）PRA-AM處理并添加SiO?-Mal納米阱的樣品的ADP誘導(dǎo)的血小板抑制率和MA???；（M）PRA-AM處理并添加SiO?-Mal納米阱的樣品的R時間和K時間；（N）活性抗血小板代謝物和SiO?-Mal納米阱處理的樣品的TEG血小板映射描記圖及ADP誘導(dǎo)的血小板抑制率；（O）CLP-AM或PRA-AM處理后，使用SiO?-Mal納米阱的全血凝固試驗

（4）SiO?-Mal納米阱在小鼠尾部出血模型中對氯吡格雷或普拉格雷的體內(nèi)功能逆轉(zhuǎn)

熒光成像顯示靜脈注射后SiO?-Mal納米阱的血液循環(huán)半衰期約為9小時且主要在肝臟、腎臟、肺和脾臟中積聚，48小時后大部分消散，表明其主要通過肝臟降解和腎臟排泄清除（圖S16A-D），在小鼠尾部出血模型中，SiO?-Mal納米阱顯著縮短了氯吡格雷引起的出血時間，逆轉(zhuǎn)效率在2.5 mg/kg劑量下最高，達(dá)到89.78%（圖5A-D），對于普拉格雷，SiO?-Mal納米阱同樣以劑量依賴性方式顯著減少出血時間，最大逆轉(zhuǎn)效率為84.03%（圖5E-G），與單獨使用血小板輸注相比，SiO?-Mal納米阱與血小板輸注聯(lián)合使用顯著提高了逆轉(zhuǎn)效率，3小時后氯吡格雷和普拉格雷的逆轉(zhuǎn)效率分別達(dá)到93.01%和88.22%（圖5H-K），表明聯(lián)合使用可增強逆轉(zhuǎn)抗血小板藥物的效果，在給予氯吡格雷或普拉格雷后2.5小時，當(dāng)抗血小板作用完全發(fā)揮時，注射SiO?-Mal納米阱可在5分鐘內(nèi)顯著減少尾部出血時間，逆轉(zhuǎn)效果與立即注射相當(dāng)（圖5L-O），表明其能快速起效。

圖5 SiO?-Mal納米阱在小鼠尾部出血模型中對氯吡格雷/普拉格雷的體內(nèi)功能逆轉(zhuǎn)。（A）小鼠尾部出血模型示意圖；（B）不同處理組小鼠的尾部出血時間（氯吡格雷組、氯吡格雷+SiO?組、氯吡格雷+SiO?-Mal組）；（C）不同劑量SiO?-Mal納米阱對氯吡格雷處理小鼠出血時間的影響；（D）B和C中氯吡格雷處理后出血時間的歸一化分析；（E）不同處理組小鼠的尾部出血時間（普拉格雷組、普拉格雷+SiO?組、普拉格雷+SiO?-Mal組）；（F）不同劑量SiO?-Mal納米阱對普拉格雷處理小鼠出血時間的影響；（G）E和F中普拉格雷處理后出血時間的歸一化分析；（H）血小板輸注對氯吡格雷處理小鼠出血時間的影響；（I）H中出血時間的歸一化分析；（J）血小板輸注對普拉格雷處理小鼠出血時間的影響；（K）J中出血時間的歸一化分析；（L）氯吡格雷處理后2.5小時給予SiO?-Mal納米阱的小鼠出血時間；（M）氯吡格雷處理后0.5小時或5分鐘給予SiO?-Mal的出血時間歸一化分析；（N）普拉格雷處理后2.5小時給予SiO?-Mal納米阱的小鼠出血時間；（O）普拉格雷處理后0.5小時或5分鐘給予SiO?-Mal的出血時間歸一化分析

（5）SiO?-Mal納米阱在小鼠肝損傷模型中對氯吡格雷或普拉格雷的體內(nèi)功能逆轉(zhuǎn)

在肝損傷出血模型中，SiO?-Mal納米阱顯著減少了接受氯吡格雷或普拉格雷治療小鼠的出血時間和失血量，表明其能有效逆轉(zhuǎn)抗血小板藥物的活性并促進止血（圖6A-D）；在抗血小板活性完全確立后，注射SiO?-Mal納米阱0.5小時內(nèi)即可顯著減少出血時間和失血量，證明其快速起效（圖6E-H）；在新西蘭大白兔模型中，SiO?-Mal納米阱同樣顯著減少了氯吡格雷治療導(dǎo)致的出血時間和失血量（圖6I-L）；進一步在巴馬小型豬模型中，該納米阱也顯著減少了氯吡格雷導(dǎo)致的出血時間和失血量（圖6M-P），證實了其在不同動物模型中對氯吡格雷的體內(nèi)逆轉(zhuǎn)作用。

圖6 SiO?-Mal納米阱在不同動物肝損傷模型中對氯吡格雷/普拉格雷的體內(nèi)功能逆轉(zhuǎn)。（A-B）小鼠的出血時間（A）和失血量（B）（鹽水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO?-Mal組，n=5）；（C-D）小鼠的出血時間（C）和失血量（D）（鹽水、普拉格雷、普拉格雷+SiO?-Mal組，n=5）；（E-F）小鼠肝損傷模型的出血時間（E）和失血量（F）（鹽水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO?-Mal組，注射后2.5小時，n=5）；（G-H）小鼠肝損傷模型的出血時間（G）和失血量（H）（鹽水、普拉格雷、普拉格雷+SiO?-Mal組，注射后2.5小時，n=5）；（I）兔肝損傷出血模型示意圖；（J）兔肝損傷模型抽血濾紙的代表性圖像；（K-L）兔子的出血時間（K）和失血量（L）（鹽水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO?-Mal組，n=5）；（M）豬肝損傷出血模型示意圖；（N）豬肝損傷模型抽血濾紙和紗布的代表性圖像；（O-P）巴馬小型豬的出血時間（O）和失血量（P）（鹽水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO?-Mal組）

（6）在小鼠尾部出血和肝損傷模型中，SiO?-Mal納米陷阱長期治療對氯吡格雷或普拉格雷的體內(nèi)功能逆轉(zhuǎn)

在長期接受抗血小板藥物治療的小鼠模型中，連續(xù)五天給予氯吡格雷或普拉格雷后，尾部出血時間顯著延長，表明藥物導(dǎo)致持續(xù)的血小板抑制（圖7A-E）。然而，SiO?-Mal納米阱顯著縮短了這種延長的出血時間，證明其能有效逆轉(zhuǎn)長期抗血小板藥物的作用，而血小板輸注的逆轉(zhuǎn)效果有限（圖7A-E）。在肝損傷模型中，長期使用氯吡格雷或普拉格雷的小鼠表現(xiàn)出顯著增加的失血量和出血時間，而SiO?-Mal納米阱的注射顯著減少了這些指標(biāo)，表明其能有效逆轉(zhuǎn)長期抗血小板治療的效應(yīng)（圖7F-I）。此外，通過測量血小板中的cAMP和P-選擇素水平，發(fā)現(xiàn)氯吡格雷治療導(dǎo)致cAMP水平升高和P-選擇素水平降低，而SiO?-Mal納米阱治療則降低了cAMP水平并提高了P-選擇素水平，表明其恢復(fù)了血小板的生理功能（圖7J-M）。

圖7 SiO?-Mal納米阱對長期抗血小板治療的體內(nèi)逆轉(zhuǎn)作用。（A）長期抗血小板藥物處理的小鼠尾部出血模型示意圖；（B）不同處理組小鼠的尾部出血時間（鹽水、氯吡格雷、氯吡格雷+PLT、氯吡格雷+SiO?-Mal組）；（C）不同處理組小鼠的尾部出血時間（鹽水、普拉格雷、普拉格雷+PLT、普拉格雷+SiO?-Mal組）；（D）B中氯吡格雷處理后出血時間的歸一化分析（n=6）；（E）C中普拉格雷處理后出血時間的歸一化分析（n=6）；（F-G）不同處理組小鼠肝損傷的出血時間（F）和失血量（G）（鹽水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO?-Mal組，n=5）；（H-I）不同處理組小鼠肝損傷的出血時間（H）和失血量（I）（鹽水、普拉格雷、普拉格雷+SiO?-Mal組，n=5）；（J）通過ELISA檢測不同處理組小鼠血漿中的cAMP水平（鹽水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO?-Mal組，n=4）；（K）通過ELISA檢測不同處理組小鼠血漿中的P-選擇素水平（鹽水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO?-Mal組，n=3）；（L）通過ELISA檢測不同處理組小鼠血漿中的cAMP水平（鹽水、普拉格雷、普拉格雷+SiO?-Mal組，n=4）；（M）通過ELISA檢測不同處理組小鼠血漿中的P-選擇素水平（鹽水、普拉格雷、普拉格雷+SiO?-Mal組）

（7）SiO?-Mal納米陷阱的生物安全性

在評估SiO? - Mal納米阱的潛在臨床應(yīng)用時，研究發(fā)現(xiàn)即使在500 μg/mL的高濃度下孵育72小時，該納米阱對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）也無明顯細(xì)胞毒性（圖8A）。此外，在1小時內(nèi)不同濃度的SiO? - Mal納米阱對紅細(xì)胞的影響測試中，幾乎沒有觀察到溶血現(xiàn)象（圖8B）。體內(nèi)副作用評估顯示，與生理鹽水處理組相比，SiO? - Mal納米阱處理組在活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）和纖維蛋白原（FIB）水平等凝血系統(tǒng)參數(shù)上無顯著差異（圖8C-F），表明其不會影響凝血系統(tǒng)。同時，SiO? - Mal納米阱處理也未導(dǎo)致白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）等肝腎功能指標(biāo)發(fā)生顯著變化（圖8G-L）。此外，對15天內(nèi)四次接受SiO? - Mal納米阱處理的小鼠的主要器官進行蘇木精和伊紅（H&E）染色，結(jié)果表明該納米阱對心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等主要器官無不良影響（圖8M）。對新西蘭兔和巴馬豬的進一步生物安全性評估也顯示，SiO? - Mal納米阱處理組與生理鹽水處理組之間在血液凝固指數(shù)、血液生化指標(biāo)以及主要器官的H&E染色結(jié)果上無明顯差異（圖S18-S22），表明SiO? - Mal納米阱在體內(nèi)具有良好的生物安全性。

圖8 SiO?-Mal納米阱的安全性評估。（A）用所示濃度（以μg/mL為單位）的SiO?-Mal納米阱處理的HUVEC的細(xì)胞活力；n=4。（B）用所示濃度（以μg/mL為單位）的SiO?-Mal納米阱處理的紅細(xì)胞的溶血率，分別以PBS和水作為陰性和陽性對照；n=5。（C-F）用SiO?-Mal納米阱或鹽水處理的小鼠血漿樣本的血液凝固參數(shù)，包括APTT（C）、FIB（D）、PT（E）和TT（F）；n=3。（G-L）用SiO?-Mal納米阱或生理鹽水治療的小鼠血清樣本的血液生化分析，包括肝功能指標(biāo)（ALB（G）、ALP（H）、ALT（I）、AST（J））以及腎功能指標(biāo)（BUN（K）和CREA（L））；n=5。（M）用SiO?-Mal納米阱或生理鹽水治療的小鼠主要器官（心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）切片的H&E染色圖像