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針對上述問題，復旦大學孫濤和蔣晨團隊研究團隊設計了一種基于工程化細菌外膜囊泡（OMVs）的納米平臺（AO@PTP/47aD），用于聯合遞送阿霉素（DOX）和CD47小干擾RNA（siCd47）。這種納米平臺的設計思路如下：1核心設計：陽離子聚合物復合物（PTP/47aD）-PTP（PEG3.5k-TK-PEI1.8k）：一種低分子量的聚乙二醇（PEG）和聚乙烯亞胺（PEI）的復合物，通過活性氧（ROS）響應性連接子（TK-COOH）連接。這種設計使得聚合物在腫瘤細胞內的高濃度ROS環(huán)境下能夠降解，釋放藥物。siCd47和DOX：通過靜電作用，PTP與siCd47和DOX負載的核酸適配體結合，形成穩(wěn)定的復合物。2?外層設計：工程化OMVs（ΔmsbBOMVs）OMVs來源：通過基因工程敲除大腸桿菌（E.coliBL21）的msbB基因，減少OMVs中的內毒素含量，提高安全性。功能：OMVs能夠穿透血腦屏障（BBB），并激活免疫系統(tǒng)，增強抗腫瘤效果。3?靶向修飾：Angiopep-2靶向肽：Angiopep-2能夠特異性結合腦血管內皮細胞上的低密度脂蛋白受體相關蛋白1（LRP1），幫助納米平臺穿越BBB并靶向GBM細胞。該文章于2025年3月4日以《Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles-Based Doxorubicin and CD47-siRNA Co-Delivery Nanoplatform Overcomes Immune Resistance to Potentiate the Immunotherapy of Glioblastoma》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202418053）。

研究示意圖

(1) 納米平臺的制備和表征

納米平臺AO@PTP/47aD的制備（圖2a）及各組分完成表征，包括aptamer負載阿霉素（DOX）（圖2b）及響應ATP釋放DOX（圖2c）。PAP在相同質量比下與PTP結果一致，二者均成功與siCd47和aD共負載（圖2d）。PTP/47aD與1 mM H?O?共孵育時粒徑顯著增加并持續(xù)24小時，而與0.1 mM H?O?共孵育時幾乎無變化（圖2e）。ΔmsbBOMV經檢測內毒素水平顯著降低（圖2f），安全性增強。通過超聲及共孵育等操作獲得共遞送納米平臺AO@PTP/47aD，其直徑和zeta電位與O@PTP/47aD無顯著差異（圖2h，i）。形態(tài)學觀察顯示PTP/47aD為完整球形顆粒，ΔmsbBOMV為經典碗狀雙層結構，AO@PTP/47aD為核殼結構，其大小與DLS結果一致（圖1j）。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）顯示ΔmsbBOMV的紅色熒光與siRNA的綠色熒光高度共定位（圖1k），證實其成功封裝PTP/47aD，與透射電子顯微鏡（TEM）和DLS結果一致。

圖1 納米體系的制備與表征。a）AO@PTP/47aD的制備的示意圖。B，c）通過ATP適體負載DOX（b）和通過aD響應ATP釋放DOX（c）熒光分光光度法分析。d）通過PTP或PAP共壓縮siCd47和aD的瓊脂糖凝膠電泳分析。（e）PTP/47aD細胞ROS反應性的DLS分析。f）ΔmsbBOMV和野生型OMV的內毒素含量分析。g）ΔmsbBOMV與PTP/47aD比例的ζ電位分析。h，i，j）PTP/47、ΔmsbBOMV、O@PTP/47aD和AO@PTP/47aD的尺寸（h）和ζ電位（i）的半定量結果（j）的TEM圖像。比例尺=50nm（左右）。比例尺=100nm（中間）。k）ΔmsbBOMV和siRNA之間共定位的代表性共聚焦圖像。用Dil標記的ΔmsbBOMV：紅色。用FAM標記的siRNA：綠色。比例尺=10μm

（2）納米平臺誘導的毒性和ICD

鑒于SiRNA和DOX在細胞內發(fā)揮作用，研究了納米平臺在細胞水平上的攝取行為。結果顯示，G422細胞對AO@PTP/47aD的攝取主要通過能量依賴性機制和網格蛋白介導的內吞作用發(fā)生（圖3a，b），表明納米平臺經歷細胞內溶酶體途徑。CCK8實驗表明，DOX（447.2 nM）和AO@PAP/47aD（494.5 nM）具有相似的半最大抑制濃度，而AO@PTP/47aD的IC50降低至285.5 nM（圖3c）。7-AAD/AnnexinV染色（圖3d）觀察細胞凋亡情況，AO@PTP/47aD對腫瘤細胞產生實質性細胞毒性作用。接下來，評估了AO@PTP/47aD誘導免疫原性細胞死亡（ICD）的能力。如圖3e-g所示，流式細胞術（FCM）和Western Blot（WB）分析表明，所有含DOX的制劑都引起可測量的ICD反應。與ROS非應答制劑和缺乏血管肽素-2修飾的制劑相比，AO@PTP/47aD引起最強的CRT暴露并顯著促進HMGB1核轉位。免疫熒光（IF）結果進一步證實了這些發(fā)現（圖3h）。流式細胞術（FCM）分析顯示，AO@PTP/47aD組中成熟樹突狀細胞（DC）的比例最高（圖3j），這與觀察到的CRT暴露和HMGB1核轉位的程度一致，從而為后續(xù)T細胞活化奠定了基礎。

圖2 納米平臺誘導的細胞毒性和ICD。a，b）AO@PTP/47aD攝取途徑的FCM分析（a）和相應的半定量結果（b）熒光依賴性攝取。c）不同制劑的細胞毒性分析。。d）不同制劑誘導的細胞凋亡的FCM分析。e，f）不同制劑誘導的CRT表達的FCM分析（e）和相應的半定量結果（f）。g）不同處理后細胞質HMGB1和核HMGB1表達的WB分析。h，i）不同處理后CRT表達（h）和HMGB1核共定位（i）的代表性共聚焦圖像。比例尺=20μm。j）FCM分析通過不同配方促進BMDC的成熟

（3）納米平臺促進的GAM的吞噬作用

膠質母細胞瘤（GBM）適應性免疫抗性的主要特征是腫瘤細胞通過過表達多種檢查點來逃避免疫細胞的攻擊和破壞。在腫瘤微環(huán)境（TME）中，小膠質細胞/巨噬細胞（GAM）是主要的免疫細胞，CD47介導的吞噬逃逸起著重要作用。對患者來源的GBM組織進行Western Blot（WB）和免疫熒光（IF）分析進一步確認了這一點。這些結果提示，利用siRNA下調GBM細胞表面CD47的表達，可有效降低GBM細胞的吞噬逃逸能力，從而增強GAM對GBM的吞噬作用，克服GBM細胞的獲得性免疫抵抗。

通過免疫熒光（IF）觀察到，移植G422細胞的原位GBM荷瘤小鼠切片中，GBM區(qū)域的CD47熒光信號顯著強于周圍瘤周組織和相應的正常腦組織中的CD47熒光信號（圖4b）。與先前的siCd47篩選一致，Western Blot（WB）和流式細胞術（FCM）分析顯示，含有siCd47的制劑在不同程度上降低了G422細胞中的CD47表達水平。值得注意的是，在PTP/47a條件下，ROS響應性和Angiopep-2修飾的AO的沉默效應最為顯著（圖4c-e）。

此外，為了驗證CD47敲低產生的促吞噬作用，從C57BL/6小鼠中提取骨髓源性巨噬細胞（BMDM），并選擇BV2細胞代表GAM。流式細胞術結果顯示，經AO@PTP/47a處理后，BV2細胞對G422細胞的吞噬能力提高了約1.6倍，超過了商業(yè)轉染試劑siRNA-Mate的效果（圖4g，h）。

圖3 Nanoplatform敲低CD47以促進GAMs的吞噬作用。a，b）來自GBM患者（a）和攜帶原位GBM的小鼠（b）的瘤周組織和GBM組織之間CD47表達的代表性免疫熒光圖像。比例尺=200μm。c，d）不同制劑誘導的CD47敲低的WB分析和相應的半定量結果。e）不同制劑誘導的CD47敲低的FCM分析。f）基于ΔmsbBOMVs的納米平臺促進GAMs吞噬過程的示意圖。g，h）不同處理后BV2細胞吞噬作用的FCM分析和相應的半定量結果

（4）納米平臺對GAMS的重編程

盡管ΔmsbBOMV的內毒素含量顯著降低，但作為細菌源性物質，它們仍可通過病原體相關分子模式激活免疫系統(tǒng)。此前的研究已證實ΔmsbBOMV可使巨噬細胞恢復?；诖?，研究了AO@PTP/47aD是否能逆轉GAM的表型，以進一步克服GBM的適應性免疫抗性（圖5a）。結果顯示，與對照組相比，經ΔmsbBOMV和AO@PTP/47aD處理24小時后，M2樣BV2細胞和M2樣BMDM的比例降低，而M1樣BV2細胞和M1樣BMDM的比例顯著增加（圖5b）。

為探究ΔmsbBOMV啟動GAM重編程的潛在機制，重點關注經典的NF-κB通路。Western Blot（WB）分析顯示，與對照組和IL-4處理組相比，經LPS和IFN-γ組合處理以及ΔmsbBOMV和AO@PTP/47aD處理的BV2細胞表現出細胞質中p65水平降低和細胞核中p65水平增加（圖5d-f）。這一結果證實了NF-κB通路的激活。

圖4 通過納米平臺重編程GAM。a）AO@PTP/47aD重編程GAM的示意圖。b）不同處理后BV2細胞和BMDMs重編程的FCM分析。c）AO@PTP/47aD重編程BV2細胞的機制示意圖。d-f）不同處理后BV2細胞中細胞質p65和核p65表達的WB分析（d）和相應的半定量結果（e，f）

（5）納米平臺的穿透BBB和GBM靶向能力

首先通過Western Blot（WB）證實LRP1在GBM細胞（G422和GL261）和腦毛細血管內皮細胞（BCEC）中高度表達（圖6a），這為基于Angiopep-2的共遞送系統(tǒng)在體內穿過血腦屏障（BBB）和靶向GBM提供了基礎。隨后，使用Transwell構建體外BBB模型，評價其穿過BBB的能力（圖6b）。結果表明，AO@PTP/47aD進入下室的滲透是O@PTP/47aD的1.75倍，而游離Angiopep-2的額外存在降低了其BBB滲透能力（圖6c）。

隨后，進一步探索了其體內靶向GBM的能力。從體內腦內信號變化的角度來看，從尾靜脈注射后1小時開始，AO@PTP/47aD在腦內的蓄積明顯高于O@PTP/47aD。該差異在注射后8小時進一步增加，并持續(xù)至注射后24小時（圖6d、e），提示AO@PTP/47aD具有較強的腦靶向性。離體器官成像結果顯示，與非靶向組相比，靶向組在腦中的蓄積更多，而在肝臟和肺中的蓄積較少（圖6f，g）。因此，Angiopep-2的修飾不僅增強了納米平臺的腦靶向能力，還減少了其在肝臟和肺部的積累，從而最大限度地減少了非特異性分布并減少了脫靶效應。

圖5 納米平臺穿透BBB并靶向GBM的能力。a）BCECs、G422、GL261和HEK293細胞中LRP1表達的WB分析。b）AO@PTP/47aD穿過體外BBB模型的示意圖。c）分析不同制劑在穿越體外BBB中的滲透量隨時間的變化。數據以SD±平均值表示（n=3個獨立實驗）。d，e）AO@PTP/47aD和O@PTP/47aD在不同時間在GBM原位小鼠大腦中積累的代表性IVIS圖像和相應的半定量結果。f，g）尾靜脈注射后24hAO@PTP/47aD和O@PTP/47aD在主要器官中積累的代表性IVIS圖像和相應的半定量結果。h）尾靜脈注射后24小時血管標志物CD31和納米平臺在GBM病變區(qū)域分布的免疫熒光成像結果（局部區(qū)域）。比例尺=100μm。i）CD31和納米平臺在非靶向組和靶向組中的共定位分析

（6）納米平臺的體內抗腫瘤作用

在使用G422-熒光素酶（G422-Luci）構建的C57BL/6原位GBM小鼠模型中探索AO@PTP/47aD的體內抗腫瘤作用。在整個治療過程中記錄小鼠的存活率和體重。如圖7b所示，與生理鹽水和游離DOX組相比，AO@PTP/47a表現出較弱的腫瘤生長抑制，表明單獨調節(jié)GAMs在GBM中產生的抗腫瘤作用有限。AO@PTP/SaD顯示出一定程度的腫瘤生長抑制，初步表明解決GBM中內在免疫抵抗和適應性免疫抵抗的策略是有效的。此外，在治療期間，所有小鼠組均表現出體重下降，這可能是由于惡性腦腫瘤的快速增殖。然而，AO@PTP/47aD治療組的體重減輕有所緩解（圖7c）。就存活率而言（圖7d），AO@PTP/47a組的中位生存時間為18天，與生理鹽水組（15天）相比，未顯示出顯著的生存獲益。隨后，我們使用免疫組織化學研究了不同治療組腫瘤細胞中TUNEL表達。結果表明，AO@PTP/47aD組TUNEL的凋亡信號在對照組中最強（圖7e），表明該組中的腫瘤細胞經歷了最有效的殺傷。

圖6 納米平臺的體內抗腫瘤作用。a）原位GBM荷瘤小鼠給藥組和方案示意圖。b-d）接受指定治療的原位GBM荷瘤小鼠的平均腫瘤信號生長曲線（b）、體重變化（c）和動物存活率（d）。e）每組中TUNEL表達的免疫組織化學分析。比例尺=50μm

（7）納米平臺的體內抗腫瘤免疫反應

基于AO@PTP/47aD在體內優(yōu)異的抗腫瘤結果，在體內評估了免疫激活。給藥四次后，處死小鼠，解剖和處理其腦組織以制備單細胞懸液。使用Percoll細胞分離溶液和離心，獲得富含腦免疫細胞的環(huán)層，并通過FCM對免疫細胞進行染色和分析，以評估GBM免疫微環(huán)境的整體變化（圖8a）。定量FCM結果（圖8b-f）顯示，AO@PTP/47aD處理后，荷瘤小鼠GBM病灶中成熟DC（CD80CD86）、CD8T細胞（CD3CD8）和M1樣GAMs（F4/80CD86）的比例顯著增加，而M2樣GAMs（F4/80CD206）和調節(jié)性T細胞（Tregs，CD25Foxp3）的比例顯著降低。這表明GBM中免疫抑制微環(huán)境的廣泛逆轉。隨后，使用IF可視化GBM病變部位免疫細胞的分布。與FCM結果一致，G6組CD8T細胞和M1樣GAMs的浸潤水平顯著高于其他對照組，而M2樣GAMs和Foxp3Tregs在切片水平上幾乎檢測不到（圖8g-n）。此外，值得注意的是，在G6組中也發(fā)現了高水平的顆粒酶B（GZBM），表明AO@PTP/47aD不僅改善了CD8T細胞的浸潤，還增強了其活性，以確保其有效的腫瘤殺傷功能（圖8o，p）。ELISA來評估GBM部位相關細胞因子的表達。治療后，G6組誘導的IFN-γ、TNF-α和IL-12水平最高，與CD8T細胞和M1樣GAMs的抗腫瘤功能密切相關。相比之下，與M2樣GAMs的促腫瘤功能和維持微環(huán)境免疫抑制特性相關IL-10和TGF-β的水平最低（圖8q-u）。這些結果進一步證實了AO@PTP/47aD全面徹底地激活了大腦中的抗腫瘤免疫反應，將GBM從“冷”腫瘤轉變?yōu)椤盁帷蹦[瘤。

圖7 抗腫瘤免疫反應的評估。a）攜帶原位GBM的C57BL/6小鼠腦組織FCM分析示意圖。b-f）荷瘤小鼠大腦中成熟DC（b）、CD8T細胞（c）、M1樣GAMs（d）、M2樣GAMs（e）和Tregs（f）比例的半定量結果。g、h）5次處理后GBM區(qū)域CD8T細胞浸潤程度的代表性IF圖像（g）和相應的半定量結果（h）。比例尺=50μm。i，j）代表性IF圖像經過5次處理后M1樣GAMs浸潤在GBM區(qū)域的程度和相應的半定量結果。k，l）五次處理后GBM區(qū)域M2樣GAMs浸潤程度的代表性IF圖像和相應的半定量結果。比例尺=50μm。m，n）五次處理后GBM區(qū)域Foxp3Tregs浸潤程度的代表性IF圖像和相應的半定量結果。比例尺=50μm。o，p）五次處理后GBM區(qū)域顆粒酶B表達的代表性IF圖像和相應的半定量結果。比例尺=50μm。。q-u）五次治療后腫瘤問題中IFN-γ（q）、TNF-α（r）、IL-12p70（s）、IL-10（t）和TGF-β（u）含量的半定量結果

（8）體內抗腫瘤作用和免疫反應的機制

AO@PTP/47aD旨在全面破壞GBM的免疫抵抗并增強免疫治療的療效。一方面，它通過誘導ICD克服內在免疫抵抗來增強GBM的免疫原性，從而促進DC成熟和T細胞活化。另一方面，它利用siCd47和ΔmsbBOMV精確沉默CD47并重編程GAM，從而克服適應性免疫抵抗，從而增強GAMs對GBM的吞噬能力，使它們分泌大量促炎細胞因子殺死腫瘤細胞（圖9a）。因此，這種策略的協同效應可能產生出色的抗腫瘤和免疫激活能力，促使我們驗證潛在的機制。給藥五次后，處死小鼠，收集腦組織制備組織切片和勻漿。首先，使用IF檢查腫瘤組織中CRT的表達。值得注意的是，與其他對照組相比，在用AO@PTP/47aD治療的腫瘤核心區(qū)域觀察到強烈而集中的CRT熒光信號（圖9b，c），表明GBM的內在免疫抵抗被有效克服。同時，組織WB分析顯示AO@PTP/47aD處理組的CRT和HMGB1表達水平最高（圖9d-f），進一步證實了這一結論。隨后，為評價各治療組GBM的適應性免疫抵抗能力，使用組織WB定量腫瘤中GAMs表型標志物和CD47的表達。如圖9g，h所示，與生理鹽水組相比，游離DOX處理后GBM中的CD47水平有所增加。這可能歸因于響應化療引發(fā)的免疫效應而上調的特異性免疫檢查點。相比之下，其他治療組的CD47表達顯著降低，表明GBM的適應性免疫抵抗被破壞。與CD47表達的變化不同，與G4相比，在G5和G6中觀察到M1樣GAM標志物（CD86和CD16）的增加更明顯，而M2樣GAM標志物（CD206和Arg-1）的減少更顯著（圖9i-l）。這表明，通過克服GBM的內在免疫抵抗，可以進一步破壞適應性免疫抵抗。綜上所述，這些結果表明，基于ΔmsbBOMV的納米平臺AO@PTP/47aD通過同時克服GBM中的內在免疫耐藥性和適應性免疫耐藥性，引發(fā)了強大的抗腫瘤免疫反應。

圖8 體內抗腫瘤作用和免疫反應激活的機制。a）AO@PTP/47aD克服GBM和適應性免疫抵抗的示意圖。b，c）5次處理后GBM區(qū)域CRT表達的代表性IF圖像和相應的半定量結果。比例尺=100μm。。d）5次治療后腫瘤組織中CRT和HMGB1表達的WB分析。e，f）5次治療后腫瘤組織中CRT（e）和HMGB1（f）表達的半定量結果。g，h）WB分析治療5次后腫瘤組織中CD47表達的相應半定量結果。i）5次治療后腫瘤組織中CD206、Arg-1、CD86和CD16表達的WB分析。j-l）5次治療后腫瘤組織中CD86（j）、Arg-1（k）和CD206（l）表達的半定量結果