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針對上述問題，福建師范大學(xué)曾雪梅/燕雙仟教授團(tuán)隊開發(fā)了一種可生物降解的離子納米調(diào)節(jié)劑 FessTMiR，用于乳腺癌治療(圖1)。其由二硫代二乙酸和亞鐵離子組裝的納米載體（FessNV）與抗銅劑四硫代鉬酸鹽（TM）組成。FessTMiR通過增強(qiáng)滲透和滯留效應(yīng)在腫瘤部位積累，并在腫瘤的酸性和富含谷胱甘肽的環(huán)境中分解為亞鐵離子和TM，實現(xiàn)“鐵過載效應(yīng)”和“銅負(fù)荷降低方法”。銅耗竭通過鐵死亡、凋亡和自噬增強(qiáng)治療效果，同時抑制血管生成，降低PD-L1表達(dá)，增強(qiáng)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）。此外，銅耗竭還促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，增加T細(xì)胞浸潤和激活，減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和TGF-β，將免疫學(xué)“冷”腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁帷蹦[瘤，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究在2025年4月1日以“Biodegradable ionic nanoregulators for synchronous modulation of copper and iron ion homeostasis in breast cancer therapy”為題發(fā)表于《Chemical engineering journal》 （DOI: 10.1016/j.cej.2025.162041）上。

圖1 研究示意圖。（A）Fe ss TMiR的制備過程；（B）Fe ss TMiR 用于腫瘤治療、激活抗腫瘤免疫反應(yīng)和抑制轉(zhuǎn)移的示意圖

(1) Fe ss NV的制備及表征

通過水熱法合成了鐵基納米載體 FessNV，并進(jìn)一步修飾制備了 FessTMiR。透射電子顯微鏡（TEM）顯示 FessNV 和 FessTMiR 結(jié)構(gòu)相似（圖 2A）。粒徑分析顯示 FessNVP 和 FessTMiR 尺寸分別為 50 nm 和 72 nm（圖 2B），且 FessTMiR 的 zeta 電位更負(fù)（圖 2C），表明修飾成功。XPS 分析驗證了元素組成及價態(tài)，F(xiàn)essTMiR 中出現(xiàn) Mo 元素小峰，證實 TM 成功引入（圖 2D 和 2E）。FTIR 分析顯示 FessTMiR 表面引入氨基，且觀察到 MoS?2? 吸收帶（圖 2F）。紫外 - 可見吸收光譜確認(rèn)了 TM 的存在（圖 2G）。這些結(jié)果證實了 FessTMiR 的成功合成。在酸性條件和 GSH 存在下，F(xiàn)essNV 釋放鐵和 TM，48 小時后釋放率分別達(dá) 74.4% 和 75.6%（圖 2H–I）。FessNV 具有類 POD 活性，可降解 MB、氧化 OPD 和 TMB（圖 2J-L），但過量 GSH 會消耗產(chǎn)生的羥基自由基。FessNV 還具有類 GPx 活性，可高效消耗 GSH（圖 2M-O），這可能是由于其含有二硫鍵?？傮w而言，F(xiàn)essNV 的類 POD 和類 GPx 活性增強(qiáng)了 ROS 水平，削弱了 GPX4 功能，提升了鐵死亡治療效果。

圖2 表征與催化評價。（A）Fe ss NV和Fe ss TMiR的TEM圖像；（B）Fe ss NVP和Fe ss TMiR的流體動力學(xué)直徑；（C）TM、Fe ss NV、Fe ss NVP和Fe ss TMiR的Zeta電位；（D，E）Mo 3d的XPS光譜（全范圍及高分辨）；（F）TM和Fe ss TMiR的FTIR；（G）TM、Fe ss NV、Fe ss NVP和Fe ss TMiR的紫外吸收光譜；（H）不同條件下Fe ss NV的鐵釋放曲線（含/不含10 mM GSH）；（I）不同條件下Fe ss NV的TM釋放曲線（含/不含10 mM GSH）；（J）pH 4.5下不同濃度Fe ss NV對MB+H?O?紫外吸收的影響（H?O?：25 mM，MB：25 μM）；（K）pH 4.5下不同濃度Fe ss NV對OPD+H?O?紫外吸收的影響（H?O?：25 mM，OPD：25 μM）；（L）pH 4.5下OPD+H?O?+Fe ss NV的紫外吸光度隨時間變化；（M）pH 4.5下不同濃度Fe ss NV對DTNB+GSH紫外吸光度的影響（DTNB：1 mg/mL）；（N）pH 4.5下DTNB+Fe ss NV的紫外吸光度隨時間變化（DTNB：1 mg/mL，F(xiàn)e ss NV：250 μg/mL）；（O）POD樣和GPx樣活性反應(yīng)示意圖

（2）Fe ss TMiR細(xì)胞毒性及攝取評價

通過 CCK-8 實驗評估了 TM 的細(xì)胞毒性，當(dāng) TM 濃度超過 100 μmol/L 時，4T1 乳腺癌細(xì)胞存活率顯著下降至 44% 以下（圖 3A），因此后續(xù)實驗選擇 50 μmol/L 的 TM，此時細(xì)胞存活率為 88%。進(jìn)一步實驗表明，50 μmol/L 的 TM 與 50 μg/mL 的 FessNVP 聯(lián)合使用時，F(xiàn)essTMiR 組的細(xì)胞存活率隨時間顯著下降（圖 3B）。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和流式細(xì)胞儀檢測顯示，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的 FessNVP 攝取量隨時間增加（圖 3C），且與細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/溶酶體存在共定位，但皮爾遜相關(guān)系數(shù)較低（圖 3D-F），表明共定位較弱。這可能是因為納米調(diào)節(jié)劑觸發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/溶酶體的逃逸，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/溶酶體膜破裂（圖 3G）。

（3）抑制銅傳輸能力的評價

乳腺癌細(xì)胞因銅相關(guān)分子伴侶蛋白上調(diào)而對銅需求更高。TM 能靶向銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ATP7A 并螯合銅，具有良好的細(xì)胞內(nèi)治療效果。實驗表明，4T1 細(xì)胞與不同濃度的 CuCl? 共孵育時，細(xì)胞存活率顯著增加（圖 3H），但在 CuCl? 濃度達(dá) 10 nmol/L 時，存活率因銅過載而下降。使用 Cu2? 探針 RBH 檢測細(xì)胞內(nèi)銅水平，結(jié)果顯示 FessTMiR 組紅色熒光顯著減弱，表明其細(xì)胞內(nèi) Cu2? 水平較低（圖 3I 和 3J），且 FessNVP 組熒光強(qiáng)度低于 TM 組，可能是因 ROS 增加破壞銅轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白及細(xì)胞膜。Western blot 分析顯示，F(xiàn)essTMiR 組中銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ATP7B/ATP7A 和 SLC31A1 的表達(dá)水平顯著降低（圖 3K-N），證實 FessTMiR 能有效抑制銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)。

圖3 抗腫瘤活性和銅轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制評估。（A）用不同濃度TM處理4T1細(xì)胞后的細(xì)胞存活率；（B）四種不同處理24或48小時后4T1細(xì)胞的細(xì)胞存活率（Ⅰ：PBS，Ⅱ：50 μmol/L TM，Ⅲ：50 μg/mL Fe ss NVP，Ⅳ：50 μg/mL Fe ss TMiR）；（C）流式細(xì)胞術(shù)分析4T1細(xì)胞對FITC標(biāo)記的Fe ss NVP的細(xì)胞攝??；（D）處理4小時后4T1細(xì)胞對FITC標(biāo)記的Fe ss NVP的代表性共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像；（E-F）核/FITC（E）和溶酶體/FITC共定位（F）熒光強(qiáng)度的定量分析；（G）Fe ss NVP的溶酶體逃逸機(jī)制示意圖；（H）在50 μmol/L TM存在下與不同濃度的CuCl?孵育后4T1細(xì)胞的細(xì)胞存活率；（I-J）在4T1細(xì)胞中進(jìn)行各種處理后，使用RBH探針對Cu2?進(jìn)行代表性CLSM圖像（I）和流式細(xì)胞術(shù)分析（J）；（K）在4T1細(xì)胞中進(jìn)行不同處理后ATP7B、ATP7A和SLC31A1蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析；（L-M）根據(jù)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果定量分析ATP7B（L）、ATP7A（M）和SLC31A1（N）的相對表達(dá)水平

（4）Fe ss TMiR誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡

FessTMiR 能有效釋放細(xì)胞內(nèi) Fe2?（圖 4A），并通過類芬頓反應(yīng)增強(qiáng)羥基自由基（?OH）積累（圖 4B），同時產(chǎn)生大量 ROS（圖 4C-D）。此外，F(xiàn)essTMiR 增加脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物 LPO 和 4-HNE 的生成（圖 4E-G），降低 GPX4 和 xCT 表達(dá)，耗竭 GSH，誘導(dǎo)鐵死亡。鐵死亡抑制劑 Ferrostatin-1（Fer-1）和抗氧化劑維生素 E（VE）可有效逆轉(zhuǎn) FessTMiR 誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡（圖 4H），而銅死亡抑制劑對 FessTMiR 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡緩解作用有限（圖 4H），表明其主要誘導(dǎo)鐵死亡。FessTMiR 還誘導(dǎo)自噬和凋亡，自噬抑制劑 3-MA 和凋亡抑制劑 Z-VAD 部分恢復(fù)細(xì)胞存活率（圖 4I），且 FessTMiR 處理的細(xì)胞上調(diào)自噬蛋白 LC3Ⅱ/Ⅰ 表達(dá)，下調(diào)凋亡蛋白 Bcl-2（圖 4J）。流式細(xì)胞儀分析和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）檢測顯示，F(xiàn)essTMiR 組的自噬水平顯著增加（圖 4K），線粒體膜電位（MMP）顯著降低（圖 4L），且誘導(dǎo)了較高的凋亡率（圖 4M-N）。

圖4 Fe ss TMiR誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡和凋亡。（A）4T1細(xì)胞經(jīng)處理后Fe2?水平的CLSM圖像（FerroOrange探針）；（B）4T1細(xì)胞內(nèi)·OH水平的CLSM圖像（HPF探針）；（C-D）4T1細(xì)胞中ROS水平的CLSM圖像（C，DCFH-DA探針）及流式細(xì)胞術(shù)分析（D）；（E-F）4T1細(xì)胞中LPO水平的CLSM圖像（E，Liperfluo探針）及流式細(xì)胞術(shù)分析（F）；（G）xCT、GPX4和4-HNE的蛋白印跡分析；（H-I）4T1細(xì)胞的相對存活率（Fe ss TMiR+不同抑制劑）；（J）LC3Ⅱ/Ⅰ和Bcl-2的Western blot分析；（K）4T1細(xì)胞自噬水平的流式細(xì)胞術(shù)分析（MDC探針）；（L）4T1細(xì)胞線粒體膜電位的CLSM圖像（JC-1探針）；（M-N）4T1細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析及定量分析

（5）Fe ss TMiR體外抑制腫瘤轉(zhuǎn)移并激活免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）

FessTMiR 顯著降低了 4T1 細(xì)胞的遷移、侵襲和黏附效率（圖 5B, F-H），并將劃痕實驗中的愈合率降低到 -10.2%，細(xì)胞形態(tài)受損（圖 5C, D, I）。此外，F(xiàn)essTMiR 抑制了腫瘤球體的生長（圖 5E, J），降低了 VEGF 表達(dá)（圖 5M, P）。在免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）方面，F(xiàn)essTMiR 增加了 CRT 暴露（圖 5K），促進(jìn)了 HMGB-1 外泌（圖 5N），降低了細(xì)胞內(nèi) ATP 水平（圖 5O），并抑制了 PD-L1 表達(dá)（圖 5M, Q），從而觸發(fā)了強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)（圖 5R）。

圖5 ICD促進(jìn)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移體外分析。（A）遷移、侵襲、粘附、劃痕和3D球體測定的實驗裝置示意圖；（B）4T1細(xì)胞遷移、侵襲和粘附的染色圖像（瑞氏-姬姆薩，紫色）；（C-D）4T1細(xì)胞的明場圖像；（E）4T1細(xì)胞球體7天生長的代表性圖像；（F-H）4T1細(xì)胞遷移（F）、侵襲（G）和粘附（H）的半定量分析；（I）4T1細(xì)胞劃痕試驗傷口閉合的半定量分析；（J）4T1腫瘤球體的生長曲線；（K-L）4T1細(xì)胞中CRT（K）和HMGB-1（L）的免疫熒光圖像；（M）VEGF和PD-L1的蛋白印跡分析；（N）4T1細(xì)胞中細(xì)胞外HMGB-1水平的量化；（O）4T1細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)ATP水平的測量；（P-Q）4T1細(xì)胞中VEGF（P）和PD-L1（Q）水平的半定量分析；（R）腫瘤轉(zhuǎn)移過程及鐵死亡誘導(dǎo)的ICD抗腫瘤作用示意圖

（6）用 Fe ss TMiR 納米調(diào)節(jié)劑處理 4T1 細(xì)胞后的 RNA-Seq 分析

RNA-Seq 分析顯示，對照組與 FessTMiR 處理組間存在顯著 mRNA 表達(dá)差異（圖 6A）?；鹕綀D識別出 FessTMiR 組中有 3040 個差異表達(dá)基因（DEGs），其中 1467 個下調(diào)，1573 個上調(diào)（圖 6B）。KEGG 通路富集分析顯示氧化磷酸化、凋亡、TGF-β 信號通路等顯著改變（圖 6C），鐵死亡和谷胱甘肽代謝相關(guān)基因顯著變化（圖 6D）。GSEA 進(jìn)一步證實 FessTMiR 上調(diào)鐵死亡、凋亡相關(guān)基因，下調(diào)谷胱甘肽代謝基因（圖 6E）。銅代謝相關(guān)基因與鐵死亡相關(guān)基因的相關(guān)性顯著增加（圖 6F），表明 FessTMiR 通過破壞銅和鐵離子平衡促進(jìn)鐵死亡。環(huán)形圖、弦圖和蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)展示了基因的生物學(xué)作用（圖 6G-I），揭示 FessTMiR 通過耗竭銅離子、破壞離子穩(wěn)態(tài)、誘導(dǎo)鐵死亡和增強(qiáng)免疫反應(yīng)發(fā)揮治療效果。

圖6 Fe ss TMiR誘導(dǎo)增強(qiáng)鐵死亡的機(jī)制分析。（A）對照組和Fe ss TMiR組中差異表達(dá)基因（DEG）的主成分分析（PCA）；（B）火山圖說明兩組之間的DEG；（C）從差異基因表達(dá)分析中確定的關(guān)鍵KEGG通路；（D）熱圖顯示與鐵死亡、谷胱甘肽代謝、細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)的DEG；（E）與鐵死亡、谷胱甘肽代謝、細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)的通路的基因集富集分析（GSEA）；（F）對照組和Fe ss TMiR組中銅離子代謝信號通路與鐵死亡通路之間DEG的相關(guān)性分析；（G）DEG的基因本體（GO）功能分析，其中綠色和紫色表示每個通路中下調(diào)和上調(diào)的基因；（H）KEGG弦圖突出顯示在多個信號通路中下調(diào)或上調(diào)的基因；（I）功能性交叉基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

（7）體內(nèi)生物分布及抗腫瘤性能評價

在 4T1 腫瘤荷載小鼠中，F(xiàn)essNVP@ICG 組的腫瘤部位熒光強(qiáng)度顯著高于游離 ICG 組（圖 7），離體成像和半定量分析進(jìn)一步證實其腫瘤特異性積累增強(qiáng)（圖 7B-C）。體內(nèi)治療實驗中，F(xiàn)essTMiR 顯著抑制腫瘤生長（圖 7E-G），而 FessTMiR + Lip-1 組腫瘤重新生長（圖 7D）。各組平均腫瘤重量與腫瘤生長趨勢一致（圖 7H），且小鼠體重?zé)o顯著變化（圖 7I），表明 FessTMiR 無明顯毒性。病理學(xué)評估顯示 FessTMiR 組腫瘤切片中損傷面積最大（圖 7J）。FessTMiR 組腫瘤中銅和銅載體蛋白（Cp）水平最低，鐵水平最高（圖 7K-L），且鐵死亡相關(guān)蛋白 xCT 和 GPX4 表達(dá)顯著降低（圖 7M-N），VEGF、PD-L1 和 CD31 水平也降低（圖 7M-N），表明 FessTMiR 通過調(diào)節(jié)鐵水平、增強(qiáng)鐵死亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)免疫治療發(fā)揮作用。

圖7 Fe ss TMiR的體內(nèi)生物分布和抗腫瘤功效。（A）4T1腫瘤小鼠尾靜脈注射ICG標(biāo)記的Fe ss NVP后不同時間點(diǎn)的體內(nèi)熒光圖像；（B-C）12、36和60小時切除的主要器官和腫瘤的離體熒光圖像（B），以及相應(yīng)的熒光強(qiáng)度量化（C）；（D）皮下4T1腫瘤模型治療的實驗時間線示意圖；（E）每個治療組的腫瘤生長曲線；（F）4T1腫瘤小鼠解剖腫瘤的代表性圖像；（G）不同治療條件下4T1腫瘤小鼠的腫瘤生長曲線；（H）治療后4T1腫瘤小鼠的腫瘤重量；（I）治療期間小鼠的體重；（J）各種治療后腫瘤切片的代表性H&E染色圖像；（K-L）腫瘤組織中銅（K）和鐵（L）含量的量化；（M）治療后腫瘤組織中xCT、GPX4、VEGF和PD-L1表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析；（N）小鼠模型中Fe ss TMiR離子干預(yù)的示意圖

（8）Fe ss TMiR的體內(nèi)抗腫瘤免疫治療

FessTMiR 組的成熟樹突狀細(xì)胞（DCs，CD80?CD86?）比例顯著增加至約 30.4%（圖 8A-B），表明其促進(jìn) DCs 成熟。FessTMiR 組中 MHC II?CD80?CD86? 的表達(dá)顯著升高（圖 8C-D），增強(qiáng) DCs 的抗原呈遞能力。FessTMiR 處理的腫瘤中調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Tregs）水平最低（圖 8E-F），而 CD4? 和 CD8? T 細(xì)胞水平最高（圖 8G-H），表明其降低免疫抑制細(xì)胞比例，增強(qiáng)細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞浸潤。此外，F(xiàn)essTMiR 組中自然殺傷（NK）細(xì)胞顯著增加（圖 8I）。血清中 FessTMiR 處理組的干擾素-γ（IFN-γ）水平最高，而轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）水平最低（圖 8J-K），激活 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，減少免疫抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化。FessTMiR 通過抑制 PD-L1 表達(dá)，促進(jìn) CD8? T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞浸潤，減緩腫瘤生長（圖 7M，圖 8H-I）。綜上，F(xiàn)essTMiR 將免疫“冷”腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁帷蹦[瘤，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，顯示出顯著的癌癥治療潛力。

圖8 Fe ss TMiR誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)評估。（A-B）4T1腫瘤小鼠在接受各種治療后，代表性流式細(xì)胞術(shù)圖（A）和DC成熟的量化（B）；（C-D）相同條件下代表性流式細(xì)胞術(shù)圖（C）和DC活化的量化（D）；（E-F）代表性流式細(xì)胞術(shù)圖（E）和治療誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞的量化（F）；（G-I）流式細(xì)胞術(shù)分析顯示腫瘤內(nèi)CD4? T細(xì)胞（G）、CD8? T細(xì)胞（H）和NK1.1?細(xì)胞（I）的百分比；（J-K）治療后血清IFN-γ（J）和TGF-β（K）水平的量化

（9）Fe ss TMiR對乳腺腫瘤的體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移作用

在肺轉(zhuǎn)移模型中，尾靜脈注射后第 7 天，小鼠接受 Luc-4T1 腫瘤細(xì)胞注射。生物發(fā)光成像顯示 FessTMiR 組肺轉(zhuǎn)移顯著減少（圖 9B），其腫瘤生長曲線最慢（圖 9C），表明抑制效果最好。FessTMiR 對小鼠體重影響極小（圖 9D），且第 50 天存活率為 57.1%（圖 9E）。在另一實驗中，皮下注射 4T1 細(xì)胞誘導(dǎo)原發(fā)腫瘤后，尾靜脈注射治療藥物，一周后再次注射 4T1 細(xì)胞誘導(dǎo)肺轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，F(xiàn)essTMiR 組腫瘤體積顯著更小（圖 9H），小鼠體重?zé)o顯著變化（圖 9G）。實驗結(jié)束后，F(xiàn)essTMiR 組腫瘤體積和重量顯著更小（圖 9I-J），且印度墨水染色和 H&E 切片分析顯示其肺轉(zhuǎn)移灶顯著更少且更小（圖 9M），轉(zhuǎn)移率和結(jié)節(jié)數(shù)量最低（圖 9K-L）。這些結(jié)果表明 FessTMiR 有效抑制了原發(fā)腫瘤生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

圖9 抗肺轉(zhuǎn)移效果評價。（A）Luc-4T1荷瘤小鼠模型體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移成像試驗示意圖；（B）不同治療后肺轉(zhuǎn)移Balb/c小鼠生物發(fā)光圖像；（C）不同治療后Luc-4T1荷瘤小鼠腫瘤生長曲線；（D）不同治療后Luc-4T1荷瘤小鼠體重；（E）不同治療組肺轉(zhuǎn)移Balb/c小鼠存活率；（F）4T1荷瘤小鼠模型體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移試驗示意圖；（G）不同治療后小鼠體重；（H）不同治療后小鼠腫瘤生長曲線；（I）4T1荷瘤小鼠腫瘤解剖照片；（J）不同治療后4T1荷瘤小鼠腫瘤重量；（K）4T1荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)；（L）各組轉(zhuǎn)移率統(tǒng)計分析；（M）不同治療組肺的明視野和H&E染色圖像