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針對上述問題，重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院翟啟明團隊闡明了cGAS-STING通路的激活阻礙了PDLSCs的成骨分化能力。從機制上講，證明了炎癥不僅導致線粒體DNA（mtDNA）通過線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔（mPTP）通道釋放到細胞質(zhì)中，還抑制了cGAMP的外排和降解。這兩種機制共同促成了cGAS-STING通路的過度激活，進而損害了PDLSCs的成骨分化能力。因此，該團隊制造了一種載有環(huán)孢素A（CsA，一種mPTP抑制劑）、ABCC1激動劑噻氟哌啶（TT）和ENPP1的線性聚乙烯醇聚（癸二酸甘油酯）（PEGA）水凝膠系統(tǒng)（CsA-TT-ENPP1@PEGA），該系統(tǒng)可以局部注射到牙周組織中。該三功能水凝膠系統(tǒng)在炎癥條件下有效降低了PDLSCs中的cGAMP水平，并顯示出作為治療牙周骨缺損的有效治療方法的顯著前景，同時具有通過干預cGAMP穩(wěn)態(tài)管理其他疾病的潛在意義。該文章于2025年2月13日以《cGAMP-targeting injectable hydrogel system promotes periodontal restoration by alleviating cGAS-STING pathway activation》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2025.02.010）。

研究示意圖

(1) 炎癥條件下PDLSC中cGAS-STING通路被激活

首先，研究人員進行了轉(zhuǎn)錄組分析以闡明牙周炎的機制。火山圖顯示，炎癥條件下許多基因被上調(diào)（見圖2a）。KEGG通路富集分析（圖2b）、基因本體（GO）富集分析（圖2c）和基因集富集分析（GSEA）（圖2d）表明，LPS暴露增加了細胞質(zhì)DNA感知通路、1型干擾素信號通路以及與cGAS-STING通路相關(guān)的干擾素相關(guān)免疫反應(yīng)。隨后，研究人員探究了cGAS-STING通路是否在炎癥誘導的PDLSCs中被激活。免疫熒光染色確認LPS刺激促進了STING的表達（圖2e和f）。WB分析也顯示，H-PDLSCs + LPS組中cGAS-STING通路相關(guān)蛋白的表達增加（圖2g）。在結(jié)扎誘導的牙周炎小鼠中，標記為CD90的PDLSCs中STING的表達也升高（圖2h和i）。綜上所述，這些結(jié)果表明，cGAS-STING通路在炎癥誘導的PDLSCs中被激活。

圖1（a）H-PDLSC和H-PDLSC+LPS中基因表達的火山圖；（b）LPS處理后的KEGG通路富集分析；（c）GO富集分析；（d）GSEA分析；（e）H-PDLSC和H-PDLSC+LPS中STING的免疫熒光染色和定量分析（f）；（g）cGAS-STING通路相關(guān)蛋白的Western blot分析；（h）牙周組織中PDLSCs（CD90，綠色）和STING（紅色）的免疫熒光染色；（i）對（h）中STING表達的定量分析

（2）抑制cGAS-STING通路促進PDLSCs成骨分化和牙周修復

為了驗證cGAS-STING通路在PDLSCs功能失調(diào)中的作用，研究人員通過小干擾RNA（siRNA）敲低STING的表達。如預期，敲低STING顯著改善了炎癥條件下PDLSCs的分化能力（見圖3a）。此外，他們還使用STING敲除（STING?/?）小鼠檢測STING抑制對牙周修復的影響（見圖3b）。免疫熒光染色顯示，STING缺失顯著減少了結(jié)扎誘導的牙周炎小鼠中CD90標記的PDLSCs中IRF3的表達（見圖3c）。微型計算機斷層掃描（micro-CT）結(jié)果表明，STING?/?小鼠中牙槽骨吸收顯著減輕（見圖3d），CEJ-ABC距離減小，BV/TV比值增加，骨小梁數(shù)量（Tb.N）增加（見圖3e）。此外，還使用了STING的強效選擇性拮抗劑H151來評估STING抑制對PDLSCs成骨分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H151顯著降低了STING及其下游通路蛋白的表達（見圖3f），并顯著緩解了炎癥條件下PDLSCs的成骨分化缺陷（見圖3g和圖S4b）。為了進一步探討STING藥物抑制劑在牙周修復中的作用研究人員在牙周炎誘導一周后，向小鼠第二磨牙周圍的六個部位注射C176（見圖3h）。結(jié)果顯示，C176顯著減輕了牙周炎小鼠的牙槽骨喪失（見圖3i和3j）。綜上所述，體內(nèi)外實驗確認，cGAS-STING通路的激活與牙周炎密切相關(guān)，抑制STING具有治療牙周炎的巨大潛力。

圖2（a）siRNA介導的STING敲低改善了H-PDLSC+LPS細胞的成骨分化；（b）STING?/?小鼠治療的示意圖；（c）不同處理組小鼠牙周組織中PDLSCs（CD90，綠色）和IRF3（紅色）的免疫熒光染色；（d）小鼠牙槽骨的代表性Macro-CT圖像；（e）CEJ-ABC、BV/TV%和Th.N的定量分析；（f）H151處理后cGAS-STING通路相關(guān)蛋白的Western blot分析；（g）H151處理后阿利新紅染色和礦化結(jié)節(jié)的定量分析；（h）C176處理C57小鼠結(jié)扎誘導的牙周炎的示意圖；（i）不同處理組小鼠牙槽骨的代表性Macro-CT圖像和H&E染色；（j）CEJ-ABC、BV/TV%和Th.Tb的定量分析

（3）從受損線粒體釋放的mtDNA負責炎癥后PDLSC中cGAS-STING通路的激活

為研究線粒體功能，使用Seahorse Bioscience XF分析儀檢測了氧氣消耗率（OCR）和細胞外酸化率（ECAR），作為代謝活性的指標。結(jié)果顯示，LPS顯著損害了PDLSCs的氧氣消耗（見圖4a），表明在炎癥條件下線粒體代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)向糖酵解。共聚焦顯微鏡圖像顯示，H-PDLSCs + LPS組的線粒體網(wǎng)絡(luò)受損，線粒體數(shù)量增多且形態(tài)延長（見圖4b和c）。此外，線粒體反應(yīng)性氧種（mtROS）是線粒體功能的重要指示物，該研究發(fā)現(xiàn)H-PDLSCs + LPS組的mtROS水平顯著升高（見圖4d）。與細胞內(nèi)mtROS水平一致，H-PDLSCs + LPS組抗氧化基因的表達也顯著低于H-PDLSCs組，并伴隨著炎癥條件下PDLSCs中膜電位（MMP）降低（見圖4e）。8-羥基-2′-脫氧鳥苷（8-OHdG）作為DNA氧化損傷的標志物，在H-PDLSCs + LPS組中高表達（見圖4f）。此外，H-PDLSCs + LPS組中雙鏈DNA和線粒體的共定位減少（見圖4g和h），qRT-PCR進一步提示炎癥條件下更多的mtDNA被釋放到細胞質(zhì)中（見圖4i）。為了進一步明確cGAS-STING通路的激活與PDLSCs功能失調(diào)是否與mtDNA泄漏相關(guān)，使用溴化乙錠（EtBr）去除PDLSCs的mtDNA。EtBr顯著減少了mtDNA拷貝數(shù)（，并抑制了H-PDLSCs + LPS組中cGAS-STING通路的激活（見圖4j）。更重要的是，EtBr處理部分緩解了炎癥微環(huán)境下PDLSCs的成骨分化缺陷（見圖4k）。這些結(jié)果表明，炎癥刺激引起的mtDNA損傷和釋放到細胞質(zhì)中，進一步激活了cGAS-STING通路，導致PDLSCs功能失調(diào)。

圖3（a）使用Seahorse XFe24分析儀測量的線粒體呼吸能力分析（氧氣消耗率；OCR）；（b）用Mito Tracker染色的線粒體代表性圖像；（c）線粒體形態(tài)（每個細胞的分支長度和數(shù)量）分析；（d）MitoSox染色的免疫熒光和定量分析；（e）線粒體膜電位（?Ψm，TMRM染色）的免疫熒光和定量分析；（f）8-OHdG染色的免疫熒光和定量分析；（g）線粒體（Mito Tracker，紅色）和DNA（抗雙鏈DNA抗體，綠色）的免疫熒光染色；（h）（g）數(shù)據(jù)的共定位分析；（i）通過qRT-PCR分析細胞質(zhì)DNA的來源；（j）mtDNA耗竭后cGAS-STING通路相關(guān)蛋白的Western blot分析；（k）阿利新紅染色和礦化結(jié)節(jié)的定量分析

（4）發(fā)生炎癥時PDLSC中mtDNA通過mPTP通道釋放到胞質(zhì)溶膠中

研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激未顯著增加PDLSCs的凋亡或BAX表達（見圖5a和b），但mPTP相關(guān)蛋白HK2和VDAC的表達顯著增加（見圖5b），表明炎癥可能改變了mPTP狀態(tài)。LPS還導致線粒體腫脹、延長，并增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的膜接觸（見圖5c）。同時，Ca²⁺過載和基質(zhì)顆粒的出現(xiàn)（見圖5c，綠色箭頭）表明線粒體功能受損。Rhod-2 AM染色顯示，H-PDLSCs + LPS組的Ca²⁺水平顯著升高（見圖5d），且Calcein-CoCl₂染色結(jié)果表明mPTP開放增加（見圖5e）。

RU360有效阻斷了Ca²⁺的進入并抑制了mPTP的開放。此外，CsA抑制mPTP開放，減緩了cGAS-STING通路的激活（見圖5f），并改善了PDLSCs在炎癥條件下的成骨分化缺陷（見圖5g，圖S10）。在結(jié)扎誘導的牙周炎小鼠中，CsA有效減少了牙槽骨喪失（見圖5h）并顯著改善了CEJ-ABC距離、BV/TV和Tb.Th（見圖5i）。長期使用CsA未見明顯組織病理變化。綜上，炎癥通過線粒體Ca²⁺過載引發(fā)mPTP開放和mtDNA泄漏，進而激活cGAS-STING通路。

圖4（a）通過PI染色和流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；（b）BAX、VDAC和HK2表達的Western blot分析；（c）H-PDLSCs和H-PDLSCs+LPS的代表性透射電子顯微鏡（TEM）圖像（黃色標記的結(jié)構(gòu)表示線粒體，紅色虛線框出的結(jié)構(gòu)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，綠色箭頭指示基質(zhì)顆粒）；（d）通過Rhodi-2 AM染色和流式細胞術(shù)定量分析線粒體Ca2?；（e）通過Calcein AM檢測mPTP開放情況，并通過流式細胞術(shù)定量分析MFI；（f）CsA處理后cGAS-STING通路相關(guān)蛋白的Western blot分析；（g）阿利新紅染色和礦化結(jié)節(jié)的定量分析；（h）不同處理組小鼠牙槽骨的代表性Macro-CT圖像和H&E染色；（i）CEJ-ABC、BV/TV%和Th.Tb的定量分析

（5）PDLSC中cGAMP穩(wěn)態(tài)失調(diào)導致cGAS-STING通路持續(xù)激活

cGAS與細胞質(zhì)中的mtDNA結(jié)合后，催化形成cGAMP，激活先天免疫反應(yīng)。使用cGAMP ELISA試劑盒測量LPS刺激下不同時間點的cGAMP濃度，發(fā)現(xiàn)H-PDLSCs + LPS組細胞外cGAMP濃度顯著低于H-PDLSCs組，而細胞內(nèi)cGAMP濃度顯著升高（見圖6a），表明cGAMP穩(wěn)態(tài)失調(diào)。可能的原因是cGAMP的轉(zhuǎn)運減少或細胞外降解減少，導致細胞內(nèi)cGAMP積累，激活cGAS-STING通路。

LPS處理顯著降低了ABCC1和ENPP1的表達（見圖6b、6c和6e），提示這些機制可能導致cGAMP積累。為增強cGAMP外排，使用ABCC1激動劑TT（1 μg/mL）并發(fā)現(xiàn)其顯著增加了細胞外cGAMP（見圖6f）。進一步實驗表明，1 μg/mL TT與0.1 μg/mL ENPP1的聯(lián)合使用不僅抑制了cGAS-STING通路的激活（見圖6h），還恢復了PDLSCs的成骨能力（見圖6i）。這些結(jié)果表明，cGAMP穩(wěn)態(tài)的失調(diào)導致STING信號持續(xù)激活，從而損害PDLSCs的功能。

圖5（a）ELISA分析H-PDLSC和H-PDLSC+LPS組在不同時間點的細胞外和細胞內(nèi)cGAMP水平；（b）通過qRT-PCR定量ABCC1 mRNA的表達；（c, d）ABCC1表達的Western blot分析；（e）通過qRT-PCR定量ENPP1 mRNA的表達；（f）ABCC1激動劑TT促進cGAMP的細胞外轉(zhuǎn)運；（g）TT和ENPP1聯(lián)合應(yīng)用后細胞外cGAMP的檢測；（h）TT和ENPP1聯(lián)合應(yīng)用后cGAS-STING通路的Western blot分析；（i）阿利新紅（AR）染色和礦化結(jié)節(jié)的定量分析

（6）通過CsA-TT-ENPP1@PEGA水凝膠恢復cGAMP穩(wěn)態(tài)抑制cGAS-STING途徑并促進體內(nèi)牙周恢復

根據(jù)對cGAMP穩(wěn)態(tài)失調(diào)的研究，研究團隊合成了藥物載體水凝膠系統(tǒng)，調(diào)節(jié)cGAMP的生成、外排和降解以治療牙周炎。研究人員通過混合PEGA粉末和光引發(fā)劑LAP，制備了光固化水凝膠（見圖7a）。不同濃度的LAP對PEGA水凝膠的力學性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)無顯著影響（見圖7b、7c和7d），因此選擇了0.07%的LAP濃度。PEGA水凝膠具有良好的注射性和成膠性，能夠精確填充不規(guī)則的牙周缺損并在藍光照射下迅速固化（見圖7f，圖S14）。紅外光譜（FTIR）和拉曼光譜分析確認了PEGA水凝膠的典型特性（見圖7g和7h）。水凝膠在PBS中膨脹并緩慢降解（見圖7i），并以快速初期釋放后，慢且均勻地釋放藥物（見圖7j）。在結(jié)扎誘導的牙周炎小鼠中，CsA-TT-ENPP1@PEGA水凝膠顯著促進了成骨，CEJ-ABC距離較短，BV/TV %和Tb.Th明顯提高（見圖7k、7l、7m）。免疫熒光顯示STING和IRF3在PDLSCs中的表達減弱（見圖7n、7o）。這些結(jié)果表明，局部遞送cGAS-ABCC1-ENPP1能夠緩解牙周炎并促進牙槽骨再生?？偟膩碚f，研究人員發(fā)現(xiàn)恢復cGAMP穩(wěn)態(tài)在牙周炎治療中具有重要作用，并具有巨大的治療潛力。

圖6（a）PEGA水凝膠合成的示意圖；（b）PEGA水凝膠在5%應(yīng)變下儲能模量和損耗模量（G′和G′′）的變化；（c）在5%應(yīng)變和6 rad/s條件下PEGA水凝膠儲能模量和損耗模量（G′和G′′）的時間掃描變化；（d）PEG粉末和PEGA水凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像；（e）PEGA的能譜分析（EDS）光譜；（f）PEGA水凝膠在不同3D模式下的注射照片（體外）；（g）PEG粉末和PEGA水凝膠的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）；（h）PEG粉末和PEGA水凝膠的拉曼光譜；（i）PEGA水凝膠在PBS中的膨脹和降解曲線；（j）PEGA水凝膠中DOX的累積釋放曲線；（k）不同處理組小鼠牙槽骨的代表性Micro-CT圖像；（l）CEJ-ABC的定量分析；（m）BV/TV%和Th.Tb的定量分析；（n）不同處理組小鼠牙周組織中PDLSCs（CD90，綠色）和STING（紅色）的免疫熒光染色；（o）CD90陽性細胞和STING陽性細胞的共定位分析