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牙周炎是全球最普遍和最普遍的疾病之一，占成年人的發(fā)病率為 30%，嚴重損害患者的咀嚼能力，甚至對患者的自尊和社會或職業(yè)功能造成負面影響。牙周炎是由牙菌斑中的微生物侵入引發(fā)的，可逐漸破壞牙齒的支撐組織，通常會導致牙周袋的形成、牙槽骨的吸收，并最終導致牙齒脫落。目前，牙周炎治療的臨床治療主要集中在預防疾病進展，包括機械療法、使用抗生素對抗生物膜以及服用抗炎藥。其受到根除深牙周袋細菌效率低、半衰期短的臨時刺激和副作用的限制。更重要的是，這些策略無法解決牙周炎不可逆的牙槽骨吸收問題。牙槽骨的吸收加劇了牙齒松動，并產生了繼發(fā)性咬合創(chuàng)傷，從而影響患者的咀嚼功能，導致牙周炎的高度復發(fā)。因此，在牙周炎的預防和治療中非常需要抑制牙槽骨吸收和促進骨再生，這仍然是一個重大挑戰(zhàn)。

針對上述問題，來自中國醫(yī)學科學院馮祖建、王偉偉和天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院鄧嘉胤團隊開發(fā)出一種仿生糖肽水凝膠（MH/GRW凝膠），該水凝膠通過精準調節(jié)牙周炎治療中的破骨細胞和成骨作用，實現(xiàn)了骨骼穩(wěn)態(tài)的重建。這一創(chuàng)新成果為牙周炎的治療提供了新的策略，有望在臨床應用中取得顯著療效。該文章以“Bioinspired Glycopeptide Hydrogel Reestablishing Bone Homeostasis through Mediating Osteoclasts and Osteogenesis in Periodontitis Treatment”為題于2024年10月14日發(fā)表在《ACS Nano》上（DOI：10.1021/acsnano.4c05677）。

方案. 仿生 MH/GRW 凝膠示意圖，具有持續(xù)的抗菌活性，能夠恢復牙周炎的骨穩(wěn)態(tài)

（1） GRW凝膠的制備與表征

葡甘露聚糖（GM）是一種多糖，具有生物相容性好、固有生物活性和易于功能化等優(yōu)點，廣泛應用于藥物遞送、組織工程和傷口愈合等領域。通過高碘酸鈉氧化GM并結合賴氨酸修飾的RADA肽，成功制備出RADA偶聯(lián)的GM水凝膠（GRWgel）。該水凝膠具有β-片層結構的納米纖維微結構，由RADA自組裝形成，且內部多孔網絡結構相互連通，RADA 肽的圓二色（CD）光譜在 220.5nm 處有最大橢圓率，在 202.5nm 處有最小值，這歸因于其特征性的 β - 折疊結構，RADA 和 W9 混合溶液的 CD 光譜與 RADA 肽相似，表明添加 W9 沒有改變 RADA 固有的二級結構。（圖1a-c）。流變學測試表明，GM-RADA水凝膠（GRWgel）處于類固體狀態(tài)，具有可調節(jié)的機械性能(圖1d)。此外，GRWgel展現(xiàn)出優(yōu)異的自愈合能力，能夠在剪切力下保持結構完整性(圖1e, f)。體外降解實驗顯示，GRWgel在人工唾液中可持續(xù)降解（圖1g）。綜上所述，GRWgel作為一種新型水凝膠，具有納米纖維微結構、可調節(jié)機械性能、良好注射性、自愈合能力和生物降解性等優(yōu)點，為藥物遞送和組織工程提供了潛在支架，具有廣闊的應用前景。

圖1. GRW凝膠的制備和理化性質.（a） 不同樣品的代表性 TEM 圖像。比例尺，100 nm。（b） RADA、W9 和 RADA/W9 溶液的 CD 譜圖 （0.1 mg/mL）。（c） 凍干 RADA 和 GRW 凝膠的代表性 SEM 圖像.比例尺，100 μm。（d） GRW凝膠的流變分析在 0.1 至 100 rad/s 的頻率掃描下具有不同的 GM-CHO 含量 （GM-CHO：RADA/W9 = w：w）。（e） GRW凝膠的應變掃描在 37 °C 時具有不同的 GM-CHO 含量。（f） GRW凝膠的自修復特性。（g） GRW凝膠的降解體外 （n = 3）

（2）MH/GRWgel的細胞相容性

本研究采用人牙齦上皮細胞、小鼠成纖維細胞和大鼠骨髓間充質干細胞作為模型細胞進行評估?；?/span>/死染色結果顯示，大部分細胞在培養(yǎng)3天后存活（圖2a）。CCK8試驗進一步證實，這些細胞在肽和納米纖維水凝膠中的活性高于對照組，表明其有利于細胞增殖（圖2b-d）。Transwell試驗顯示，RADA組和W9組的骨髓間充質干細胞遷移能力顯著增強，而GRWgel組遷移的細胞數(shù)量最多，這可能歸因于糖肽聚合物的存在，為細胞粘附、通訊和遷移提供了合適的微環(huán)境（圖2e）。

圖2.GRW凝膠表現(xiàn)出良好的細胞相容性并增強 BMSCs 的遷移。（a） 孵育 3 天后 L929 、 HGEC 和 BMSCs 的活/死染色。比例尺，100 μm。（B-D）不同處理后 CCK-8 測定測定 L929 、 HGEC 和 BMSCs 的增殖能力 （n = 3）。（e） BMSCs 遷移測定和遷移細胞數(shù)定量分析 （n = 3） 的代表性圖像

（3）GRWgel抑制破骨細胞形成

破骨細胞是在生長和重塑過程中侵蝕骨骼的特殊細胞，是源自單核-巨噬細胞前體細胞的多核細胞。RANKL 是一種信號因子，對破骨細胞生成至關重要且必要，并參與骨吸收。將高RANKL親和力的W9肽引入GM-RADA水凝膠（GRWgel），旨在干擾破骨細胞形成中RANKL與RANK的結合，抑制牙周炎骨吸收。通過TRAP染色評估，發(fā)現(xiàn)W9能顯著減少RANKL誘導的破骨細胞成熟數(shù)量（圖3a）。進一步實驗顯示，W9下調了破骨細胞成熟相關的轉錄因子c-Fos和NFATc1的表達（圖3b），以及破骨細胞特異性功能分子如MMP9、TRAP和CTSK的編碼基因和蛋白表達（圖3c,d）。這些結果表明W9通過阻斷RANKL和RANK結合的下游通路來抑制破骨細胞成熟。分子對接模擬和ITC實驗證實，W9與RANKL具有高結合親和力，通過多個氫鍵穩(wěn)定結合，W9 與 RANKL 結合以屏蔽 RANKL/RANK 交互，而不是直接與此交互競爭。（圖3e-f），并干擾RANK細胞外域C端部分的結合，特別是CRD3環(huán)區(qū)域，從而屏蔽RANKL/RANK相互作用。在有無W9的情況下，RANKL和RANK的結合常數(shù)差異顯著，進一步支持W9干擾RANKL和RANK結合并影響下游信號傳導的結論。因此，將W9引入GR水凝膠中顯示出對RANKL的特異性結合親和力，有效抑制破骨細胞成熟，為牙周炎等骨骼相關疾病的治療提供了新策略。

圖3.GRW凝膠通過與 RANKL 的特異性結合在體外抑制破骨細胞形成。（a） TRAP 陽性多核破骨細胞的圖像（破骨細胞：紅色箭頭）。比例尺，200 μm。（b） Western blot 破骨細胞相關蛋白的表達 （n = 3）。（c） qPCR 破骨細胞相關基因的表達 （n = 3）。（d） 不同樣品的 TRAP 活性 （n = 3）。（e） GRW凝膠和RANKL的結合通過分子剛性對接。（f） GRW凝膠和 RANKL之間的親和力 由 ITC 分析

（4）GRWgel誘導的骨髓間充質干細胞成骨分化

破骨細胞驅動的骨吸收和成骨細胞驅動的骨形成之間的平衡被破壞會促進牙槽骨丟失。除了抑制破骨細胞的形成外，成骨干預被認為是促進牙槽骨修復所必需的。成骨細胞源自骨髓間充質干細胞（BMSCs）分化，對骨再生起關鍵作用。實驗通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，GRWgel因其糖肽成分及纖維狀多孔結構，能促進BMSCs粘附和伸展（圖4a）。進一步研究結果顯示，GRWgel組在堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅S（ARS）染色中展現(xiàn)出最高的成骨效率和密集的鈣結節(jié)分布，表明其增強了成骨作用（圖4b, c）。此外，W9肽也被報道具有潛在成骨活性，可通過激活特定信號通路增加RUNX2表達水平。為進一步評估GRWgel對BMSCs成骨分化的影響，通過qPCR和Western blot檢測成骨相關基因和蛋白表達水平。結果顯示，GRWgel組顯著上調了BMP2、RUNX2、ALP和COL-I的表達（圖4d, e），表明GRWgel能增強BMSCs的粘附、增殖和成骨分化，有利于牙周炎治療中的骨再生。

圖4. GRW凝膠支持有效的細胞粘附和增強的體外成骨。（a） 培養(yǎng) 24 小時的 BMSCs 的形態(tài)。（b） 第 7 天捕獲的 ALP 染色圖像。（c） 骨誘導 21 天后的 ARS 染色。（d） 第 7 天 qPCR 測定的成骨相關基因表達 （n = 3）。（e） 第 7 天 BMP2 和 RUNX2 的蛋白質印跡分析和定量數(shù)據(jù) （n = 3）

（5）MH/GRWgel的抗菌活性

生物膜形成是牙周炎的引發(fā)因素，包括各種細菌菌落的侵襲和增殖。為了賦予GRW凝膠長期的抗菌性能，研究者將臨床上用作抗菌劑的MH物質封裝在凝膠中（圖5a, b）。實驗顯示，MH從GRW凝膠中持續(xù)釋放，有效延長了其在牙周組織的半衰期。通過菌落計數(shù)和死活染色等方法評估，MH/GRW凝膠對血鏈球菌、具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌等關鍵牙周致病菌表現(xiàn)出顯著的抗菌活性（圖5c）。特別是，該凝膠不僅能消除浮游狀態(tài)的細菌，還能有效去除生物膜內的細菌。這歸因于MH的釋放和GRW凝膠中RADA肽的精氨酸殘基的原位抗菌作用，后者能破壞細菌細胞壁，使MH更易滲透到細菌內部（圖5d, e）。因此，MH/GRW凝膠通過結合這兩種機制，顯示出強大的抗菌功效，有望成為牙周炎治療中消除細菌感染的有效手段。

圖5. MH/GRW凝膠顯示出有效的抗菌活性和去除生物膜的能力。（a）水凝膠及其抗菌特性的示意圖。（b）GRW凝膠的 MH累積釋放 (n = 3）。（c）血鏈球菌、核鐮刀菌和牙齦卟啉假單胞菌菌落的數(shù)量 （n = 3）。（d）MH/GRW 凝膠的長期抗菌作用體外 （n = 3）。（e）牙齦卟啉單胞菌的活/死染色。比例尺，100 μm。（f）牙齦卟啉單胞菌的 SEM 圖像。（g）牙齦卟啉單胞菌生物膜的活/死染色

圖6.MH/GRW凝膠在體內顯示出抗菌活性和抑制牙槽骨吸收。（a） 結扎線誘導的牙周炎模型和治療過程的示意圖。（b） MH/GRW凝膠的抗菌效果治療 1 周后體內 （n = 5）。（c） 治療 4 周后 M2 周圍上頜牙槽骨的代表性 micro-CT 圖像。（d） M2 的 CEJ 和 ABC 之間距離的定量分析結果 （n = 5）。（例如）定量分析骨骼相關參數(shù)：顯微 CT 圖像中的 BV/TV （e）、Tb.Th （f） 和 Tb.Sp （g） （n = 5）

（6）MH/GRWgel在體內促進牙槽骨再生

為揭示牙槽骨形態(tài)，研究采用了H&E染色和馬松三色染色分析上頜樣本。結果顯示（圖7a），健康組牙槽骨吸收輕微，而對照組高度顯著降低，缺乏牙間乳頭，為牙周炎癥狀。相比之下，MH/GRW凝膠組牙槽骨高度較高，上皮組織正常，牙間乳頭特征明顯。馬松三色染色顯示（圖7b），MH/GRW凝膠治療后，再生牙槽骨多為成熟組織，膠原沉積有序且致密。免疫熒光染色（圖7c, d）和qPCR分析（圖7e）進一步表明，MH/GRW凝膠組中RUNX2陽性細胞多，TRAP陽性細胞少，成骨基因表達高，破骨細胞基因表達低。這些結果表明，MH/GRW凝膠具有抗菌效果，能抑制破骨細胞活性，促進成骨分化，有效抑制牙槽骨喪失，為牙周炎提供了一種有效的治療方法。

圖7.MH/GRW凝膠抑制牙槽骨吸收，促進體內牙槽骨再生。（a） 上頜標本的 H&E 染色。比例尺，500 μm。黑色箭頭表示牙槽骨。紅色箭頭表示根。（b） 上頜牙槽骨的 Masson 三色染色。比例尺，500 μm。（c） RUNX2 （紅色） 免疫熒光染色和統(tǒng)計分析 （n = 3） 的代表性圖像。（d） TRAP IHC 和統(tǒng)計分析的代表性圖像 （n = 3）。（e） 牙槽骨中成骨 （ALP、RUNX2 和 CoL-I） 和破骨細胞 （TRAP） 基因表達的 qPCR 分析 （n = 3）

研究小結：

該研究制備了一種仿生糖肽水凝膠，將抗菌活性與抑制牙槽骨吸收和促進牙槽骨再生協(xié)同結合以治療牙周炎。該凝膠具有制造簡單、類似 ECM 的納米纖維和多孔微觀結構、自修復能力和良好的注射性等優(yōu)點。MH 的原位釋放抑制了牙周袋中牙菌斑生物膜的形成，減輕了牙周炎。更重要的是，W9 的引入使水凝膠能夠特異性結合 RANKL 并抑制 RANKL 誘導的破骨細胞生成。此外，W9 能夠促進 BMSCs 的成骨分化，增加 ALP 活性促進成骨。因此，MH/GRW凝膠成功阻止大鼠牙周炎進一步病變，抑制牙槽骨吸收，促進牙槽骨再生。這項研究強調了通過介導骨破骨細胞生成和成骨治療牙周炎重建骨穩(wěn)態(tài)的重要性，設想這種糖肽水凝膠具有巨大的潛力，可以成為臨床治療牙周炎的可行制劑。