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心肌梗死（MI）是缺血性心血管疾病的主要形式，嚴(yán)重威脅著人類的健康。心肌梗死后，血氧供應(yīng)的突然停止導(dǎo)致代謝變化和心肌凋亡，進(jìn)一步激活心肌的炎癥反應(yīng)和纖維化，增加心力衰竭的發(fā)生概率。阻斷缺氧誘導(dǎo)的不良反應(yīng)對(duì)心肌梗死后心功能的恢復(fù)具有潛在的作用。缺氧條件下心肌保護(hù)的基礎(chǔ)是增加缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的表達(dá)水平。HIF-1α的高表達(dá)可改善細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，抑制纖維化促進(jìn)梗死后組織修復(fù)。HIF-1α（hypoxia induced factor-1α）是心肌梗死（MI）后重要的缺氧保護(hù)信號(hào)，其生存期較短。通過(guò)使用脯氨酸羥化酶抑制劑如DPCA（1,4-二氫phenonthrolin-4- 1 -3-羧酸）抑制HIF-1α的羥基化作用來(lái)提高HIF-1α的穩(wěn)定性，結(jié)果是積極的。但是，游離的DPCA分子量小，溶解度差，導(dǎo)致其體內(nèi)半衰期短，因此限制了HIF-1的穩(wěn)定性和對(duì)DPCA治療MI的理想釋放譜的研究。

針對(duì)上述問題，浙江大學(xué)朱旸、任探琛、高長(zhǎng)有教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)和合成了可注射的熱敏水凝膠，具有可編程的DPCA釋放。水凝膠降解和緩慢的DPCA釋放耦合形成一個(gè)反饋回路，通過(guò)將懸垂的DPCA附著在聚合物骨架上，通過(guò)Π-Π和疏水相互作用作為額外的交聯(lián)點(diǎn)。懸垂羧基被添加到共聚物中以加速DPCA的釋放。急性期為心肌保護(hù)作用的突發(fā)釋放和不同速率的炎癥期和纖維化期的近零級(jí)延長(zhǎng)釋放。所有釋放DPCA的水凝膠上調(diào)HIF-1α，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成，刺激心肌細(xì)胞增殖，從而保持心功能和心室?guī)缀涡螤?。更快的DPCA釋放導(dǎo)致更快的水凝膠降解導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)量是健康對(duì)照組的8倍，并且在心肌梗死治療中效果更好。本研究證實(shí)了精確調(diào)控HIF-1α表達(dá)在治療心肌梗死等相關(guān)疾病中的價(jià)值，并提供了一種基于植入式裝置的調(diào)控策略。該文章于2024年09月23日以《Thermosensitive Hydrogel with Programmable, Self-Regulated HIF-1α Stabilizer Release for Myocardial Infarction Treatment》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202408013）。

圖1. 可注射釋放降解熱敏水凝膠穩(wěn)定心肌梗死HIF-1α的設(shè)計(jì)、功能及應(yīng)用

(1) DPCA系鏈聚合物的合成與表征

研究人員通過(guò)兩步可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合法成功合成了含DPCA接枝的聚合物PNVH和聚合物PNVMH（圖2A）。通過(guò)活化DPCA，將其羧基轉(zhuǎn)化為咪唑啉基團(tuán)，并通過(guò)¹H NMR光譜驗(yàn)證這一過(guò)程，顯示羧基氫消失及苯環(huán)區(qū)域新峰的出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)¹H NMR光譜中的特征峰變化，確認(rèn)了聚合過(guò)程的成功（圖2B），同時(shí)計(jì)算和驗(yàn)證了單體的聚合度（表1）。最后，通過(guò)在HEMA羥基上接枝DPCA，合成了PNVD和PNVMD，進(jìn)一步通過(guò)NMR光譜證實(shí)了這一點(diǎn)。

圖2. A) PNVD 和 PNVMD 的合成路線；B) 聚合物及其中間體的 ¹H NMR；C) 使用 HFIP 作為洗脫液的 SEC 分析聚合物及其中間體的痕跡

表1. 所有合成聚合物的Mn、DP和PDI

(2) 負(fù)載DPCA的熱敏水凝膠的性能

研究人員通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射和流變學(xué)分析測(cè)量了不同聚合物的低臨界溶解溫度（LCST），并發(fā)現(xiàn)PNVD在37 ℃時(shí)表現(xiàn)出明顯的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，其水合直徑從49.56 nm減小至13.63 nm，表明疏水相互作用導(dǎo)致聚合物鏈?zhǔn)湛s（圖3A和3B）。相比之下，PNVMD在整個(gè)溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的凝膠狀態(tài)，如圖3C所示，PNVD的G'和G"在≈35 ℃時(shí)顯著增加，且G'超過(guò)G"，表明溶液發(fā)生了溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。相比之下，PNVMD的G'和G"隨溫度變化較小，且在整個(gè)測(cè)試溫度范圍內(nèi)G'始終大于G"，表明PNVMD保持凝膠狀態(tài)。這種差異歸因于PNVMD的強(qiáng)分子間相互作用和聚合物拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，為熱敏材料的研究提供新思路，DPCA是一種穩(wěn)定HIF-1α的PHDs抑制劑，其釋放特性在缺血環(huán)境中對(duì)治療效果至關(guān)重要。此外，研究結(jié)果顯示，水凝膠在前3天內(nèi)釋放物理結(jié)合的DPCA，隨后共價(jià)結(jié)合的DPCA隨聚合物降解逐漸釋放（圖3D-F）。MAA的引入加速了酯水解，提升了PNVMD的整體釋放速率，使其在21天內(nèi)幾乎全部釋放DPCA，而PNVD則低于50%。更有趣的是，PNVD和PNVMD在不同階段表現(xiàn)出近似零級(jí)釋放，這源于聚合物結(jié)構(gòu)的獨(dú)特設(shè)計(jì)（圖3G）。這種智能控制的釋放方式為心肌修復(fù)等應(yīng)用提供了新的研究方向。

圖3. A) 在濃度為 1 mg·mL?1 時(shí)，通過(guò) DLS 測(cè)量溫度誘導(dǎo)的 PNVD 和 PNVMD 的 LCST（PNVD 的 LCST 為 ≈35 ℃，PNVMD 無(wú)顯著 LCST）；B) 在 25 ℃ 和 37 ℃ 時(shí)，PNVD 和 PNVMD 水凝膠（1 mg·mL?1）的粒徑分布；C) 不同溫度下 PNVD 和 PNVMD 水凝膠的流變性能；D) 在 pH 7.4 和 5.0 時(shí)，PNVD 和 PNVMD 的累積藥物釋放量。紅色和黑色虛線分別表示 PNVD 和 PNVMD 的理論載藥量（n = 4）；E) pH 為 7.4 和 5.0 時(shí)，PNVD 和 PNVMD 的藥物釋放率（n = 4）；F) 在 pH 7.4 和 5.0 下 PNVD 和 PNVMD 的降解（n = 4）。數(shù)據(jù)以 mean ± SD 表示；G) 共價(jià)鍵 DPCA 的近似零級(jí)釋放示意圖

(3) 程序化DPCA釋放水凝膠用于改善心功能

研究人員引入PNVH作為無(wú)藥對(duì)照組，由于PNVH的成分和性質(zhì)與PNVH相似，未納入PNVH。研究結(jié)果顯示，在第7天，作為心功能評(píng)估關(guān)鍵指標(biāo)的LVEF在MI組（46.65%）明顯低于Sham組（94.98%），表明心肌梗死后心功能不全。此時(shí)，PNVD組顯著提高了LVEF(63.66%)，而PNVH和PNVD組由于機(jī)械作用和藥物釋放有限，沒有表現(xiàn)出明顯的改善心功能的能力。28 d后，未進(jìn)行水凝膠干預(yù)的梗死心?。∕I組，28 d）進(jìn)一步惡化，LVEF降至39.53%。水凝膠治療對(duì)心功能有改善作用，反映在LVEF上。PNVH組LVEF（47.41%）略高于MI組。PNVD組對(duì)高LVEF的心功能改善較好（55.48%）。與PNVD組相比，PNVMD組LVEF明顯升高達(dá)到73.99%（圖4A-C），顯示出DPCA的快速釋放在增強(qiáng)心臟功能中的潛力。

圖4. A) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)間表。假手術(shù)組（行開胸手術(shù)，未結(jié)扎 LAD）；MI 組（LAD 結(jié)扎 + 鹽水注射）；PNVH 組（LAD 結(jié)扎 + PNVH 水凝膠注射）；PNVD 組（LAD 結(jié)扎 + PNVD 水凝膠注射）；PNVMD 組（LAD 結(jié)扎 + PNVMD 水凝膠注射）；B) 各組分別在 7 d 和 28 d 的代表性超聲心動(dòng)圖；C) 基于 (B) 的 LVEF、LVFS、ESV 和 EDV 的統(tǒng)計(jì)值

(4) 水凝膠對(duì) HIF-1α 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和再生的影響心肌細(xì)胞凋亡和再生的影響

DPCA上調(diào)的HIF-1α表達(dá)在心肌梗死（MI）治療中的再生和抗凋亡效果顯著。PNVD和PNVMD組的HIF-1α表達(dá)在MI后第3天顯著增加（圖5），特別是PNVMD組的快速DPCA釋放效果最佳。DPCA誘導(dǎo)的HIF-1α上調(diào)降低了心肌細(xì)胞凋亡比例，使PNVMD組的細(xì)胞凋亡降至11.84%，明顯優(yōu)于其他組。此外，水凝膠治療提升了關(guān)鍵蛋白Cx43和cTnT的表達(dá)，促進(jìn)了心肌功能恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，HIF-1α上調(diào)能促進(jìn)缺血心肌中pH3和Ki67的表達(dá)，助力細(xì)胞增殖，為MI后的心肌再生提供了新思路。

圖5. A) 水凝膠治療 3 天和 28 天后心臟切片的組織學(xué)評(píng)估：代表性免疫熒光染色圖像顯示 HIF-1α（綠色）、cTnT（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）（3 天和 28 天）；代表性 TUNEL 染色圖像（僅 3 天）；代表性免疫熒光染色圖像顯示 Cx43（綠色）、cTnT（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）（僅 28 天）；代表性免疫熒光染色圖像顯示 pH3（綠色）、cTnT（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）（3 天和 28 天）；代表性免疫熒光染色圖像顯示 Ki67（綠色）、cTnT（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）（3 天和 28 天）。白色和黃色箭頭分別代表纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞中的陽(yáng)性標(biāo)記。B) 基于 (A) 中相應(yīng)的免疫熒光染色圖像和 TUNEL 染色圖像，對(duì) HIF-1α 表達(dá)、凋亡、cTnT 表達(dá)、Cx43 表達(dá)、pH3 表達(dá)和 Ki67 表達(dá)的定量分析

(5) 程序化DPCA釋放水凝膠通過(guò)減少纖維化和血管化治療心肌梗死

研究人員在心肌梗死后28 d使用馬松三色染色檢測(cè)纖維化，Masson三色染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DPCA干預(yù)能顯著減少心肌纖維化，PNVMD組纖維化最少，僅為10.39%，優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組（圖6）。PNVD組顯示了較慢的水凝膠降解，這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，CD31和α-SMA染色結(jié)果顯示，在Sham組中，觀察到極少的新血管，而在MI和PNVH組中存在許多血管。這可能是由于心肌啟動(dòng)的自我防御機(jī)制，通過(guò)誘導(dǎo)血管再生來(lái)抵消梗死部位缺血缺氧微環(huán)境。PNVMD組具有最高的血管再生密度，說(shuō)明DPCA的合理釋放與機(jī)械支撐能顯著促進(jìn)血管再生，為心肌修復(fù)提供了強(qiáng)有力的支持。

圖6.A)水凝膠治療效果的組織學(xué)評(píng)價(jià)：心臟切片CD31（綠色）、α-SMA（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）的代表性馬松三色染色和代表性免疫熒光染色圖像; B) 基于(A)中的Masson三色染色和相應(yīng)的免疫熒光染色圖像，對(duì)梗死面積和血管化的定量分析

研究小結(jié)：

為了探索心肌梗死后HIF-1α的表達(dá)是否穩(wěn)定和調(diào)節(jié)，我們?cè)O(shè)計(jì)了PNVD和PNVMD水凝膠，這些水凝膠能夠可編程釋放HIF-1α的穩(wěn)定劑。通過(guò)調(diào)節(jié)連接到聚合物主鏈的DPCA的酯鍵水解和游離DPCA的擴(kuò)散之間的相互作用，我們?cè)诩毙云趯?shí)現(xiàn)了快速釋放，在炎癥和纖維化期實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)時(shí)間的近零級(jí)釋放，釋放速率不同。局部釋放的DPCA通過(guò)上調(diào)HIF-1α，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成和刺激心肌細(xì)胞增殖來(lái)維持心功能和心室?guī)缀涡螤睢NVMD的DPCA釋放速度比PNVD快，導(dǎo)致心肌組織中HIF-1α的水平更高，達(dá)到健康基線的8倍，從而產(chǎn)生優(yōu)越的治療效果。綜上所述，本工作為心肌梗死治療中HIF-1α的表達(dá)調(diào)控指明了優(yōu)化方向，提供了一種基于水凝膠的調(diào)控方法。