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【研究背景】

慢性糖尿病潰瘍 (DUs) 傷口由于其漫長的愈合過程對全球健康和經(jīng)濟構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)，高血糖水平已被認為是 DUs 的主要誘因，它導致抗氧化劑表達降低并誘導氧化應(yīng)激，從而加劇炎癥。尿道狹窄病變通常具有復雜的微環(huán)境，其特征是血糖水平升高、炎癥反應(yīng)增強、缺氧、弱堿性 pH 值范圍等。所有這些因素都對當前的非手術(shù)臨床方法提出了巨大的挑戰(zhàn)。由于其功能有限，難以有效管理尿道狹窄。多功能納米劑可以有效重塑慢性糖尿病傷口管理環(huán)境。然而，它們的傳遞主要依賴于布朗運動和隨機增強的擴散。它們表現(xiàn)出與血糖水平無關(guān)的移動性，這對應(yīng)對糖尿病傷口內(nèi)血糖水平的潛在差異提出了挑戰(zhàn)，也無法有效解決傷口不愈合或延遲愈合的根本原因。

針對上述問題，武漢理工大學官建國教授團隊研究開發(fā)了一種由半涂層Janus樹枝狀介孔二氧化硅納米粒子制成的納米馬達，利用葡萄糖氧化酶（GOx）和過氧化氫酶（CAT）修飾，以糖尿病傷口中的內(nèi)源性葡萄糖作為動力。這些納米馬達能夠在模擬傷口微環(huán)境中，利用葡萄糖濃度梯度自主導航到高血糖區(qū)域，顯著提高了靶向遞送的效率。與游離酶相比，這種方法提高了約35%的葡萄糖還原率，并改善了pH值和氧氣水平。體內(nèi)實驗顯示，糖尿病小鼠的傷口愈合速度比對照組快近30%，并且炎癥和活性氧水平降低，血管內(nèi)皮生長因子水平上升。這項研究提供了一種新策略，通過利用傷口異質(zhì)性實現(xiàn)靶向納米藥劑輸送，有效管理糖尿病傷口。該文章于2024年10月30日以“Hyperglycemia Targeting Nanomotors for Accelerated Healing of Diabetic Wounds by Efficient Microenvironment Remodeling”為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202417146）。

圖1 JNDMSN 通過高血糖靶向和多功能傷口微環(huán)境重塑有效治療糖尿病傷口的示意圖

（1）納米馬達的制備與表征

所制備的納米馬達的制造過程如圖2A 所示。采用陰離子輔助合成法制備樹枝狀介孔二氧化硅納米粒子（DMS）載體。為了進一步修飾GOx和CAT，對DMS進行功能化(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTES) 改性得到氨基功能化樣品 (NDMS)。 然后半濺射金層制備 Janus 結(jié)構(gòu) (JNDMS)，其特點是對比度的差異 (圖 2B ) 和金元素分布的不對稱 (圖2C )。 隨后通過戊二醛 (GA) 在 JNDMS 未涂層側(cè)交聯(lián)實現(xiàn)酶的固定化，得到制備好的納米馬達 (JNDMSN)。在 DMS 和 NDMS 中都觀察到 Zeta 電位從負到正的轉(zhuǎn)變（圖2D），證實了氨基功能化成功。 隨后向負電位的轉(zhuǎn)變揭示了金涂層和酶的固定化。此外，F(xiàn)TIR 光譜表征也證明了氨基官能化和酶固定化的成功。此外，還使用二辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)測定試劑盒測定了酶量（圖2F），兩種方法獲得的結(jié)果接近，說明納米馬達上酶的負載效率很高。這些結(jié)果證明了它們具有良好的膠體穩(wěn)定性，并有望在復雜的生理環(huán)境中應(yīng)用。

圖2 制備好的 JNDMSN 的制造和特性。A) JNDMSN 制備示意圖。B) SEM 和 C) JNDMSN 的 TEM 圖像以及元素映射。比例尺：250 nm。D) 制備好的樣品的 Zeta 電位和 E) FTIR 光譜。F) 酶負載的標準曲線。插圖是 NDMSN 和 JNDMSN 中的酶負載量

（2）增強擴散

納米馬達由 GOx 和 CAT 級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物（例如葡萄糖、葡萄糖醛酸和 O₂）的不對稱分布產(chǎn)生的界面擴散電泳滑移推動（圖 3A ）。不同葡萄糖濃度下 JNDMSN 的典型軌跡如圖3A所示。隨后，擴散系數(shù)隨著葡萄糖濃度的進一步增加，遷移率緩慢增加（圖 3B）。與之前報道的涉及類似 Janus 結(jié)構(gòu)的結(jié)果相比，在生理葡萄糖水平下，所制備的 JNDMSN 的遷移率提高了四倍，這與其減小的粒徑和高酶負載密切相關(guān)。JNDMSN在純水中的擴散系數(shù)約為 1.81 ± 0.39 μm²/s，并且隨著離子濃度從 1.5 mM 增加至 150 mM 而逐漸降低（圖 3C），值得注意的是，在系統(tǒng)中引入蛋白質(zhì)不僅不會降低納米馬達的移動性，而且還在一定程度上對其運動產(chǎn)生了刺激作用，表現(xiàn)出增強的擴散作用。制備的 JNDMSN 在富含離子和蛋白質(zhì)的環(huán)境中表現(xiàn)出優(yōu)異的移動性，這表明其在生理環(huán)境中具有潛在的應(yīng)用價值。JNDMSN 的密度分布以彩色編碼圖表示（圖3D）。通過繪制所選感興趣區(qū)域的像素強度分布的時間變化直方圖，進一步定量呈現(xiàn)它們的擴散動態(tài)（圖3E）。這極大地突顯了 JNDMSN 分布的不均勻性，表明其擴散增強，并具有預(yù)期的群集遷移行為。增強的移動性允許在更短的時間內(nèi)覆蓋更大的面積，從而有助于有效的傷口管理。

圖3 JNDMSN 的增強擴散行為。A) 制備好的 JNDMSN 在 3 秒內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)推進和代表性運動軌跡示意圖。制備好的 JNDMSN 的擴散系數(shù) B) 在不同葡萄糖濃度下和 C) 在不同離子濃度的 PBS 溶液和 10% FBS 補充的 DMEM 中。黃色部分對應(yīng)糖尿病傷口的生理血糖范圍。D) 在 60 秒內(nèi)，在含有 20 mM 葡萄糖的模擬傷口環(huán)境中獲得的活性 JNDMSN 的彩色編碼密度分布圖。E) 所選感興趣區(qū)域 (D) 中像素強度分布的時間變化直方圖

（3）趨化性增強靶向作用以增強微環(huán)境調(diào)節(jié)

與 JNDMSs 相比，GOx 和 CAT 修飾的 NDMSN 和 JNDMSN 表現(xiàn)出明顯的向高糖區(qū)域趨化行為，如圖4A所示。其中，具有Janus結(jié)構(gòu)的JNDMSN表現(xiàn)出最高的趨化效果，表明納米粒子在葡萄糖濃度梯度場中的移動性是基于增強擴散的趨化行為，而非梯度場的擴散泳動吸引或凝膠引起的對流。通過趨化速度、趨化指數(shù)和趨化方向性三個參數(shù)進一步比較它們的趨化能力（圖 4B-D）。這種增強可以歸因于它們的不對稱 Janus 結(jié)構(gòu)，賦予它們更大的扭矩。這種增強的趨化性可能使其更傾向于優(yōu)先在高血糖水平的區(qū)域積累，從而實現(xiàn)對糖尿病傷口的有效治療。如圖4E所示，基于非平衡朗之萬方程，模擬了 JNDMSNs 在高葡萄糖界面趨化性增強的積累功效 。納米載體 JNDMS、完全改性的 NDMSN 和制備的 JNDMSN 在傷口模型中的動態(tài)分布如圖 4F所示。單個 JNDMSN 的軌跡最具方向性，這意味著通過其強大的趨化性可以最佳地校正擴散。由于粒子與粒子和粒子與界面之間更頻繁的碰撞而導致的這種界面富集可能導致局部壓力升高，從而促進納米粒子進一步滲透到傷口組織中的界面。此外，JNDMSNs的增強擴散和在高葡萄糖界面上的增強富集有利于葡萄糖消耗達到最高（圖 4G），相應(yīng)地，大量的葡萄糖酸生成，導致pH值迅速降低，同時體系中的 O₂產(chǎn)生量達到最大（圖4H，I），而且O₂的產(chǎn)生進一步促進了葡萄糖的氧化。這一現(xiàn)象可用于通過降低葡萄糖水平同時支持O₂供應(yīng)來改善糖尿病傷口微環(huán)境，從而通過自主選擇工作區(qū)域?qū)崿F(xiàn)傷口微環(huán)境的有效重塑。

圖4 趨化性增強的界面富集和增強的動態(tài)微環(huán)境調(diào)節(jié)功能。A) JNDMSN 的趨化行為。背景顏色表示傷口微環(huán)境內(nèi)的模擬葡萄糖濃度梯度（?c葡萄糖）。B) 趨化速度（V趨化）、C) 趨化指數(shù)（I趨化）和 D) 在不同實驗條件下獲得的趨化方向性：具有?c葡萄糖的 JNDMSN 、具有?c葡萄糖的 NDMSN 、具有?c葡萄糖的 JNDMS和不具有?c葡萄糖的JNDMSN。E ) 趨化性增強的界面富集圖示。F) 模擬傷口模型中納米粒子分布的數(shù)值模擬。插圖為不同納米粒子相應(yīng)的運動軌跡。在游離酶（GOx 和 CAT）、NDMSN 和 JNDMSN 存在下，幾種微環(huán)境因素隨時間的變化。G) 葡萄糖濃度，H) pH 值，和 (I) O₂濃度

（4）體外評價

研究使用人角質(zhì)形成細胞（HaCaT）和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）評估了納米材料NDMSNs和JNDMSNs的細胞效應(yīng)，包括清除活性氧（ROS）、緩解缺氧、促進細胞遷移以及細胞毒性。通過CCK-8試驗，發(fā)現(xiàn)不同濃度的JNDMSNs對細胞活力和增殖沒有明顯影響，顯示出良好的生物相容性。使用DCFH-DA探針檢測ROS水平，結(jié)果表明JNDMSNs在HaCaT和HUVEC細胞中均表現(xiàn)出顯著的ROS清除能力，清除率分別提高約21.2%和23.4%。氧氣含量測定顯示，JNDMSNs顯著增加了細胞內(nèi)O2含量，促進了葡萄糖的氧化和H2O2的分解。進一步評估發(fā)現(xiàn)，JNDMSNs能顯著提高HUVEC細胞中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，增加幅度達133%。此外，JNDMSNs還顯著促進了HUVEC細胞的增殖和遷移，遷移速度比NDMSNs增加了27.6%?？偟膩碚f，JNDMSNs通過增強氧氣供應(yīng)和ROS清除能力，顯著改善了細胞的生存和功能。

圖5 細胞水平的體外評估。A) HaCaT 和 HUVEC 細胞中不同組別的 ROS 清除和缺氧緩解表現(xiàn)。H 2 O 2和 PBS 分別用作陽性 (+) 和陰性 (-) 對照。比例尺：50 μm。B、C) ROS 水平和 D、E) O 2含量的相應(yīng)統(tǒng)計分析。F) HUVEC 細胞遷移的圖像和 G) 量化。比例尺：100 μm。顯著差異：* p  < 0.05，** p  < 0.01，*** p  < 0.001。

（5）糖尿病傷口的體內(nèi)治療

基于體外研究結(jié)果，進一步評估了JNDMSNs在糖尿病小鼠（db/db，平均血糖濃度為27.4 ± 2.4 mM）傷口治療中的潛力。JNDMSNs與PBS混合后，每兩天噴灑在傷口上。結(jié)果顯示，經(jīng)過10天的治療，JNDMSNs顯著促進了傷口愈合，僅留下輕微的痂皮，14天后表皮恢復正常，優(yōu)于游離酶和NDMSN治療的效果。組織學分析表明，盡管所有組在治療7天后都有炎癥細胞浸潤，JNDMSNs組的炎癥反應(yīng)明顯減弱，傷口面積最小，結(jié)痂最薄。而對照組和JNDMS組在治療14天后仍有大量炎癥細胞。JNDMSNs組的膠原沉積明顯高于其他組，且毛囊、血管和皮脂腺再生增強。統(tǒng)計分析證實，JNDMSNs治療后的皮膚結(jié)構(gòu)更接近健康皮膚，顯示出加速傷口愈合的效果，這得益于其移動性和葡萄糖激活的級聯(lián)反應(yīng)的協(xié)同作用。

圖6 JNDMSNs 在體內(nèi)治療加速糖尿病傷口愈合。A) 體內(nèi)實驗設(shè)計。B) 不同組別在第 0、3、7、10 和 14 天治療的糖尿病傷口的代表性照片圖像和相應(yīng)的傷口痕跡。C) 傷口面積隨時間變化的曲線。D) 第 14 天不同組別傷口的蘇木精和伊紅 (H&E) 和 Masson 染色皮膚組織。標尺：1 毫米。第 14 天 E) 表皮厚度、F) 真皮厚度和 G) 膠原沉積水平的統(tǒng)計分析。顯著差異：* p  < 0.05，** p  < 0.01，*** p  < 0.001

（6）加速愈合機制

為了闡明JNDMSNs加速傷口愈合的機制，研究評估了不同治療組中納米粒子在傷口中的滲透情況。采用線性切口以保持傷口組織結(jié)構(gòu)完整性。熒光成像顯示，JNDMSNs在傷口界面表現(xiàn)出最強的熒光，表明其具有較好的界面富集和趨化能力，增強了葡萄糖消耗。通過引入“特征滲透深度”（CPD）參數(shù)，發(fā)現(xiàn)JNDMSNs的CPD最大（2.44 ± 0.26 μm），顯著高于其他組。JNDMSNs處理的傷口pH約為7.15，組織中的葡萄糖濃度顯著降低，葡萄糖還原效率提高約40%，證明了傷口微環(huán)境的體內(nèi)重塑。在評估ROS清除、缺氧緩解和VEGF上調(diào)的效果時，結(jié)果顯示JNDMSNs組在免疫組織化學染色中HIF-1α表達顯著降低，表明其具有良好的缺氧緩解能力。此外，JNDMSNs組的ROS水平顯著降低，VEGF表達上調(diào)至對照組的2.5倍，促進血管生成，有助于糖尿病傷口的愈合。關(guān)于血管生成和巨噬細胞調(diào)節(jié)，JNDMSNs組顯示更高的血管密度和成熟度，且巨噬細胞的M1標志物CD86減少而M2標志物CD206增加，表明其能有效降低炎癥反應(yīng)。綜上所述，JNDMSNs通過增強擴散、清除ROS、降低血糖和pH值，促進內(nèi)皮細胞增殖和遷移，從而加速糖尿病傷口的愈合。

圖7 糖尿病傷口在體內(nèi)的愈合機制。A) 納米粒子滲透評估過程說明。B) 用不同納米粒子治療的傷口的免疫熒光和免疫組織化學染色圖像。滲透切片用分化簇 31 (CD31，紅色)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI，藍色) 標記，所用的納米粒子用 FITC (綠色) 標記。ROS 切片用 DHE (紅色) 標記。VEGF 切片用 Alexa Fluor 594 (紅色) 標記。不同治療組中 C) 特征滲透深度 (CPD)、D) HIF-1α、E) ROS 和 F) VEGF、G) α-SMA 水平和 H) CD86/CD206 的統(tǒng)計分析。顯著差異：* p  < 0.05、** p  < 0.01 和 *** p  < 0.001

（7）生物安全評價

研究評估了各種納米粒子的生物安全性，通過血液相容性、常規(guī)血液學和生化檢查以及主要器官的組織學分析。溶血試驗結(jié)果顯示，未修飾的JNDMS納米粒子在200 μg/mL濃度下的溶血率高達68%，主要是由于其負電荷表面與帶正電荷膜脂的靜電相互作用。相比之下，酶修飾的納米粒子（NDMSN和JNDMSN）及游離酶顯示出優(yōu)異的血液相容性，未發(fā)現(xiàn)紅細胞碎片和可忽略的溶血率在對糖尿病小鼠進行為期14天的常規(guī)血液學和生化測試后，所有實驗組的血液指標（如MCV、MCHC、HGB等）均未出現(xiàn)顯著變化。組織學分析顯示，注射不同樣本后主要器官的切片未觀察到損傷或炎癥。這些結(jié)果共同證明了JNDMSN在體內(nèi)的安全性和生物相容性，顯示其未來臨床應(yīng)用的潛力。

圖8 JNDMSNs 的生物安全性評價。A) 暴露于 JNDMSs、酶、NDMSNs 和 JNDMSNs 后的紅細胞溶血率和數(shù)碼照片（插圖）。PBS 和去離子水分別用作陰性 (-) 和陽性 (+) 對照。條形圖中的“Control”為“Control +”。B) db/db 小鼠在 14 天治療后的常規(guī)血液學檢查。E) db/db 小鼠在 14 天治療后皮下注射不同樣品后主要器官 H&E 切片的代表性照片。比例尺：100 μm

【研究小結(jié)】

該研究提出了葡萄糖驅(qū)動的雙酶級聯(lián)推進納米馬達，這是通過在 Janus 樹枝狀介孔二氧化硅納米球上改性 GOx 和 CAT 獲得的。這些納米馬達能夠通過消耗葡萄糖在富含離子和蛋白質(zhì)的液體中自主移動。它們的趨化性使它們能夠響應(yīng)內(nèi)源性葡萄糖梯度，從而能夠?qū)Ш降礁哐墙缑妗Ｔ诟哐墙缑娴挠行Хe累和滲透促進了傷口環(huán)境的重塑，導致葡萄糖減少 25%，同時伴隨 pH 值降低和氧氣輸送。體內(nèi)實驗證明，改善的微環(huán)境通過降低炎癥反應(yīng)和 ROS 水平、促進膠原沉積、提高 VEGF 增強血管形成等，極大地促進了傷口愈合。此外，制備的納米馬達表現(xiàn)出生物安全性。這些發(fā)現(xiàn)為基于納米馬達通過有針對性和全面的微環(huán)境調(diào)節(jié)（而不是簡單的運動增強策略）治療糖尿病傷口提供了新的見解。