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樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）在啟動(dòng)和協(xié)調(diào)針對(duì)癌癥的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，但其功能通常受限于抗原遞送。為了實(shí)現(xiàn)有效的抗原遞送和疫苗接種，疫苗需要首先積聚在淋巴結(jié)（LNs）中，在那里進(jìn)行抗原呈遞和免疫反應(yīng)，隨后被DCs攝取以處理抗原并刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，近年來(lái)的研究重點(diǎn)在于開(kāi)發(fā)增強(qiáng)抗原遞送至淋巴結(jié)和DCs的納米疫苗，以誘發(fā)強(qiáng)大的免疫反應(yīng)。盡管DCs靶向策略被認(rèn)為是理想的，但并非所有DCs都表達(dá)靶標(biāo)受體，且DCs上這些受體的表達(dá)存在異質(zhì)性，從而降低了抗原遞送的有效性，并可能引發(fā)免疫相關(guān)的不良事件。因此，需要識(shí)別可靠的DC受體并開(kāi)發(fā)創(chuàng)新的疫苗接種策略，以改善免疫效果。

針對(duì)上述問(wèn)題，四川大學(xué)華西醫(yī)院米鵬教授團(tuán)隊(duì)從樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）的代謝問(wèn)題上尋找突破口，結(jié)合糖酵解對(duì)DCs的生存和免疫功能的重要性，以及Glut-1作為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以上調(diào)DC激活過(guò)程，是抗原遞送和免疫治療的潛在靶點(diǎn)，成功開(kāi)發(fā)了一種用于靶向樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）葡萄糖基化納米疫苗（GluOVANPs和GluNeoNVs），以提高抗原遞送和增強(qiáng)免疫反應(yīng)。GluOVANPs通過(guò)靶向DCs遞送卵清蛋白，顯著提高了對(duì)B16黑色素瘤的免疫應(yīng)答和記憶T細(xì)胞反應(yīng)，而GluNeoNVs則通過(guò)遞送新抗原，誘發(fā)了對(duì)MC38結(jié)腸腫瘤的特異性免疫反應(yīng)。研究結(jié)果表明，Glut-1是一個(gè)有效的靶點(diǎn)，靶向該分子的納米疫苗能夠顯著增強(qiáng)癌癥免疫治療的效果。該文章于2024年8月30日以《Glucosylated Nanovaccines for Dendritic Cell-Targeted Antigen Delivery and Amplified Cancer Immunotherapy》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c0905）。

圖1. 糖基化納米疫苗DC靶向抗原遞送精準(zhǔn)腫瘤免疫治療方案示意圖：針對(duì)DC上Glut-1的糖基化納米疫苗可以遞送常規(guī)抗原和腫瘤特異性新抗原，從而觸發(fā)DC成熟，并刺激強(qiáng)大的適應(yīng)性免疫反應(yīng)和記憶T細(xì)胞，用于癌癥免疫治療。

（1） Glut-1在人和動(dòng)物DC細(xì)胞上表達(dá)

研究表明，Glut-1在健康供體和動(dòng)物的樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）上高表達(dá)，并且在DC激活過(guò)程中表達(dá)水平上調(diào)（圖2b-d）。通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）、Western blot（WB）和流式細(xì)胞術(shù)分析，確認(rèn)了Glut-1在DCs上的高表達(dá)，并且其在DC暴露于不同刺激因子（如TNF-α、IL-6、LPS）時(shí)的表達(dá)顯著增加。與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞等腹股溝LNs的其他免疫細(xì)胞相比，Glut-1 (Glut-1/Control)在dc上的相對(duì)表達(dá)量最高（圖2e），這表明Glut-1是一個(gè)有效的DC靶向標(biāo)記物，為高特異性抗原遞送提供了有力的支持。Glut-1的上調(diào)也提示通過(guò)多次接種疫苗可能增強(qiáng)免疫反應(yīng)。

圖2. Glut-1在人和動(dòng)物DC上的表達(dá)。（a）從人類(lèi)供體和動(dòng)物中獲得用于Glut-1鑒定的未成熟和成熟hdl-c和bmdc的方法；（b?d）代表性的CLSM圖像（b）和WB分析（c, d）顯示，在有/沒(méi)有刺激的情況下，hDCs、BMDCs和DC2.4細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)Glut-1；（e）有代表性的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與LNs中其他免疫細(xì)胞相比，Glut-1在DC上的相對(duì)表達(dá)量最高。

（2） GluOVANPs靶向DC遞送抗原并觸發(fā)DC激活

為了在樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）上靶向Glut-1進(jìn)行抗原遞送，該研究使用卵清蛋白（OVA）作為常規(guī)抗原，通過(guò)生物礦化方法制備了糖基化卵清蛋白納米疫苗（GluOVANPs），作為活性靶向疫苗，與不含葡萄糖配體的OVA負(fù)載納米疫苗（OVANPs）進(jìn)行了對(duì)比（圖3a）。GluOVANPs由用于磁共振成像（MRI）的納米晶氧化釓（Gd₂O₃）核和用于激活DCs的OVA抗原殼組成。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和透射電鏡（TEM）測(cè)量結(jié)果顯示（圖3b-c），OVANPs和GluOVANPs均為單分散球形，直徑分別為21 nm和28 nm。這些納米疫苗的直徑小于100 nm，具備親水性和負(fù)電荷特性，有助于其在大量淋巴結(jié)（LNs）中遷移并定位于樹(shù)突狀細(xì)胞，從而促進(jìn)免疫反應(yīng)。其他表征結(jié)果證明了納米疫苗的合成以及良好的生物相容性。在被細(xì)胞攝取能力檢測(cè)中，GluOVANPs被攝取量是OVANPs的7倍（圖3d-e）。使用Glut-1抑制劑根皮素阻斷BMDCs上的Glut-1，結(jié)果表明GluOVANPs的攝取量顯著下降，與阻斷組相當(dāng)（圖3f）。此外，與OVANPs和OVA相比，GluOVANPs表現(xiàn)出更大的內(nèi)體逃逸（圖3g），表明糖基化改進(jìn)了OVA抗原的細(xì)胞內(nèi)遞送。這種增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)遞送有助于提高抗原對(duì)CD8⁺ T細(xì)胞的遞呈，從而刺激更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。結(jié)果如圖3h-i所示，不同處理后，GluOVANPs誘導(dǎo)的BMDCs和DC2.4細(xì)胞成熟率和細(xì)胞表面SIINFEKL肽量顯著高于OVA和OVANPs，顯示出更有效的抗原交叉呈遞。同時(shí)，GluOVANPs促進(jìn)了BMDCs和DC2.4細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-12p70的分泌，這證實(shí)了GluOVANPs可以觸發(fā)強(qiáng)烈的DC激活，顯著改善抗原遞送和免疫應(yīng)答，增強(qiáng)免疫治療。

圖3. 用于體外DC靶向抗原遞送的GluOVANPs納米疫苗的制備。（a）示意圖顯示OVA抗原、OVANPs和GluOVANPs，葡萄糖（紅色三角形）被偶聯(lián)到OVA殼上；（b）DLS圖顯示OVANPs和GluOVANPs是單分散的；（c）OVANPs和GluOVANPs的TEM圖像，比例尺為100 nm；（d）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量暴露于Cy5標(biāo)記的OVA、OVANPs或GluOVANPs后24小時(shí)BMDCs對(duì)疫苗的相對(duì)細(xì)胞攝??；（e）BMDCs攝取Cy5標(biāo)記的OVA、OVANPs和GluOVANPs的代表性CLSM圖像（紅色：OVA；藍(lán)色：核）；（f）代表性流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)根皮素阻斷或不阻斷Glut-1處理的BMDCs對(duì)疫苗的細(xì)胞攝?。?0分鐘），然后暴露于Cy5標(biāo)記的OVA、OVANPs或GluOVANPs 6小時(shí)；（g）Cy5標(biāo)記的疫苗胞漿遞送至DC的代表性CLSM圖像；（h?k）PBS、OVA、OVANPs和GluOVANPs處理的BMDCs體外DC成熟（h）和OVA抗原交叉呈遞效果（i），以及TNF-α（j）和IL-12p70（k）的分泌

（3）GluOVANPs的體內(nèi)LN積累

納米疫苗通過(guò)將抗原遞送到樹(shù)突狀細(xì)胞（DC），并在引流淋巴結(jié)（LNs）中觸發(fā)CD8⁺ T細(xì)胞反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)有效接種。接種OVANPs和GluOVANPs的小鼠腹股溝LNs的對(duì)比度增強(qiáng)，表明疫苗在LNs中的遷移（圖4a-b）。同時(shí)，GluOVANPs的遷移量明顯高于其他處理組（圖4c-g）。免疫熒光成像顯示，從GluOVANPs組和OVANPs組切除的LNs更大且含有更多的DC，較OVA組更多。另外，GluOVANPs能深入滲透到LNs中（圖4h），并廣泛與DC相互作用。

圖4. GluOVANPs將抗原傳遞給LNs。（a, b）接種后腹股溝LNs（黃色圓圈）累積OVANPs（a）和GluOVANPs（b）的MR圖像；（c?e）接種24小時(shí)后小鼠（c）和腹股溝LNs（d）中Cy5標(biāo)記的OVA、OVANPs和GluOVANPs的IVIS圖像顯示，GluOVANPs在LNs中的積累最高（e）；（f、g）代表性IVIS圖像顯示Cy5標(biāo)記的OVA、OVANPs和GluOVANPs在LNs、腫瘤和主要器官中的生物分布（f），GluOVANPs在LNs中的積累最高；（h）腹股溝LN切片的代表性熒光圖像顯示GluOVANPs（紅色）與DCs（綠色）明顯共定位（黃色）

（4）GluOVANPs將抗原傳遞到LNs中的DC并在體內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)

為了研究體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的靶向行為，免疫標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析表明C57BL/6小鼠淋巴結(jié)（LNs）中的DC表達(dá)Glut-1（圖5a），結(jié)果表明GluOVANPs能夠靶向這些細(xì)胞，并且被DC攝取的量顯著高于其他處理組（圖5b）。進(jìn)一步分析表明，與其他疫苗（如OVANPs）和免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）相比，GluOVANPs在DC的細(xì)胞攝取水平高達(dá)76.50%（圖5c），說(shuō)明糖基化的納米疫苗能顯著改善抗原在LNs中的遞送（圖5c）。此外，與PBS、OVA和OVANPs相比，GluOVANPs接種小鼠在LNs中表達(dá)CD86⁺CD80⁺ CD11c⁺成熟DC的百分比和CD11c+SIINFEKL-H-2Kb+抗原交叉表達(dá)DC的百分比最高（圖5d-g）。GluOVANPs接種小鼠的脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的CD8⁺ T細(xì)胞百分比和血液中IFN-γ的水平也顯著高于OVA和OVANPs接種小鼠（圖5h-i）。經(jīng)過(guò)三次免疫后，GluOVANPs在脾臟中產(chǎn)生的中樞記憶T細(xì)胞（TCM）和效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEM）數(shù)量最多（圖5j-k），顯示出強(qiáng)烈的全身免疫反應(yīng)和免疫記憶，這對(duì)腫瘤的免疫治療非常重要。

圖5. GluOVANPs將抗原傳遞給LNs中的DC，在體內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。（a）代表性流式細(xì)胞術(shù)直方圖顯示Glut-1在LNs的DC上表達(dá)；（b）細(xì)胞內(nèi)DC攝取的Cy5標(biāo)記的OVA、OVANPs和GluOVANPs的定量測(cè)定，DC用抗CD11c-FITC標(biāo)記；（c）B細(xì)胞、T細(xì)胞、DC細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)Cy5標(biāo)記的OVA、OVANPs和GluOVANPs的相對(duì)細(xì)胞攝?。唬╠, e）代表性流式細(xì)胞術(shù)直方圖（d）和結(jié)果（e）顯示，接種后GluOVANPs誘導(dǎo)DC成熟的比例最高；（f, g）代表性流式細(xì)胞術(shù)直方圖（f）和結(jié)果（g）顯示，GluOVANPs在免疫后的LNs中誘導(dǎo)抗原交叉呈遞DC的比例最高；（h）免疫后再刺激脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的CD8+ T細(xì)胞百分比；（i）免疫后小鼠血清IFN-γ水平；（j, k）三次免疫后第7天脾臟（CD3+CD8+門(mén)控）中TEM（j）和TCM（k）的百分比

（5）GluOVANPs在體內(nèi)預(yù)防和抑制黑色素瘤

按照?qǐng)D6a的時(shí)間線(xiàn)和處理流程，包括小鼠的免疫時(shí)間和腫瘤接種時(shí)間，建立動(dòng)物模型。結(jié)果如圖6b-d所示，GluOVANPs處理組腫瘤生長(zhǎng)速度最低，存活率最高，其他處理組小鼠均死亡。進(jìn)一步評(píng)估根除已建立腫瘤的免疫治療效果，結(jié)果表明，與Montanide ISA-51+Poly(I:C)+OVA或OVA免疫的動(dòng)物相比，OVANPs和GluOVANPs免疫的動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)速度更低，存活時(shí)間更長(zhǎng)（圖6f-g）。尤其接種GluOVANPs的小鼠腫瘤明顯更小，47天存活率（66.7%）更高（圖6h）。這些結(jié)果表明，接種GluOVANPs可以有效地消融現(xiàn)有腫瘤，延長(zhǎng)體內(nèi)生存期。

圖6. GluOVANPs在體內(nèi)預(yù)防和抑制黑色素瘤腫瘤生長(zhǎng)。（a）預(yù)防B16OVA腫瘤的疫苗接種計(jì)劃；（b?d）B16OVA黑色素瘤腫瘤的平均（b）和個(gè)體（c）腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)，以及不同處理后免疫小鼠的生存曲線(xiàn)（d）；（e）治療B16OVA腫瘤的疫苗接種計(jì)劃；（f?h）接種OVA、Montanide ISA-51+Poly(I:C)+OVA、OVANPs或GluOVANPs免疫小鼠的B16OVA腫瘤平均（f）和個(gè)體（g）腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)和存活曲線(xiàn)（h）

（6）GluOVANPs在巨噬細(xì)胞缺失和DC缺失動(dòng)物模型中的免疫治療評(píng)價(jià)

在巨噬細(xì)胞缺失小鼠模型中，GluOVANPs與OVANPs的免疫治療效果和在未進(jìn)行巨噬細(xì)胞缺失相似，表明巨噬細(xì)胞的缺失對(duì)疫苗的治療效果影響較小。然而，在DC缺失小鼠模型中，無(wú)論是GluOVANPs還是其他疫苗，其治療效果幾乎完全喪失。這表明GluOVANPs主要通過(guò)作用于樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）發(fā)揮其治療作用（圖7）。因此，DC是GluOVANPs及其他類(lèi)似疫苗實(shí)現(xiàn)有效治療的關(guān)鍵細(xì)胞類(lèi)型。

圖7. GluOVANPs用于巨噬細(xì)胞缺失和DC缺失動(dòng)物模型中黑色素瘤的體內(nèi)免疫治療。（a）免疫治療巨噬細(xì)胞缺失小鼠B16OVA腫瘤的疫苗接種方案；（b, c）第0天一次性皮下注射氯膦酸脂質(zhì)體后巨噬細(xì)胞（b）和DC（c）的消除率；（d, e）分別免疫OVA、OVANPs或GluOVANPs后巨噬細(xì)胞缺失小鼠B16OVA腫瘤的平均（d）和個(gè)體（e）腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)；（f）在DC缺失的Itgax-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠中治療已建立的B16OVA腫瘤的疫苗接種方案；（g）腹腔注射DT對(duì)DCs的消耗，未治療的小鼠作為對(duì)照；（h, i）分別免疫OVA、OVANPs或GluOVANPs后DC缺失小鼠B16OVA腫瘤的平均（h）和個(gè)體（i）腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)

（7）GluNeoNVs用于腫瘤免疫治療

該研究利用GluNeoNVs遞送新抗原Adpgk，并與傳統(tǒng)納米疫苗（neonv）進(jìn)行比較（圖8a）。結(jié)果顯示，GluNeoNVs（gluneonv）在腫瘤引流LNs中的積累明顯高于其他疫苗，表明其在轉(zhuǎn)移到LNs時(shí)最為有效（圖8d）。不同疫苗處理后小鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度，結(jié)果表明neonv和gluneonv組的腫瘤生長(zhǎng)速度較低，其中g(shù)luneonv組的腫瘤明顯更?。▓D8f-g）。免疫分析進(jìn)一步確認(rèn)，GluNeoNVs能夠顯著增加分泌IFN-γ的CD8+ T細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)了對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。這些結(jié)果表明，GluNeoNVs在新抗原遞送和腫瘤免疫治療中具有較好的應(yīng)用前景。 

圖8. 新抗原遞送GluNeoNVs用于結(jié)腸腫瘤的免疫治療。（a）示意圖顯示新抗原（Adpgk）、NeoNV和GluNeoNV，葡萄糖（紅色三角形）被偶聯(lián)到納米疫苗的PEG外殼上；（b, c）DLS（b）和TEM（c）圖像顯示，NeoNV和GluNeoNV是單分散的，比例尺為50 nm；（d）Cy5標(biāo)記Adpgk、Montanide+Poly(I:C)+Adpgk、NeoNV和GluNeoNV生物分布的定量結(jié)果；（e）治療MC38結(jié)腸腫瘤的疫苗接種計(jì)劃；（f, g）新抗原疫苗免疫小鼠MC38結(jié)腸腫瘤的平均（g）和個(gè)體（f）腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)；（h, i）接種新抗原疫苗后脾臟中分泌IFN-γ的CD8+ T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)圖（h）和定量測(cè)量（i）

研究小結(jié)：

該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種多功能糖基化納米疫苗方法，通過(guò)靶向動(dòng)物和人類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）上高表達(dá)的Glut-1，實(shí)現(xiàn)了有效的抗原遞送。與裸抗原和無(wú)糖基配體的常規(guī)納米疫苗相比，這種糖基化納米疫苗引發(fā)了更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，顯著提高了抗腫瘤效果和生存率。研究表明，Glut-1是一個(gè)可靠的抗原遞送靶點(diǎn)，因?yàn)樗诟鞣N類(lèi)型的DC上廣泛表達(dá)并且在DC激活過(guò)程中上調(diào)。有效的抗原遞送能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)，尤其是在腫瘤治療中表現(xiàn)出良好的效果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了糖基化納米疫苗通過(guò)DC的高選擇性和有效性，為DC靶向抗原遞送和免疫治療提供了一個(gè)實(shí)用的方法。