IF：16.6《Nature Communications》活性乳酸菌株吸入式治療產(chǎn)品改善肺結(jié)構(gòu)功能、降炎及減少中性粒細(xì)胞浸潤
專欄：學(xué)術(shù)前沿
發(fā)布日期：2024-09-24
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背景介紹：
支氣管肺發(fā)育不良（BPD）是影響早產(chǎn)兒的一種慢性肺部疾病，其特征為肺組織炎癥和肺泡及血管發(fā)育失調(diào)。嬰兒期接觸高氧環(huán)境、機(jī)械通氣導(dǎo)致的容積傷以及感染等不良因素，可能會對患兒的肺部健康造成長期影響，增加他們成年后發(fā)展成慢性阻塞性肺?。–OPD）等呼吸系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
BPD和COPD這兩種疾病均表現(xiàn)為肺組織退化、中性粒細(xì)胞浸潤以及肺功能降低。此外，它們都伴隨著肺部微生物組分的變化，特別是硬壁菌門細(xì)菌的減少。盡管如此，肺部細(xì)菌與疾病發(fā)展具體機(jī)制之間的聯(lián)系尚未完全明確。
近期研究提出了一個(gè)假設(shè)，即BPD小鼠模型中乙酰化脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸（Ac-PGP）信號通路和中性粒細(xì)胞活性可能增強(qiáng)。通過功能性增強(qiáng)和減弱實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)Ac-PGP在BPD的發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。因此，研究測試了一種基于活性乳酸菌株的吸入式活體生物治療產(chǎn)品（LBP），在BPD和COPD的體外和體內(nèi)模型中，這種基于乳酸菌的LBP顯示出改善肺結(jié)構(gòu)和功能、減少中性粒細(xì)胞浸潤以及降低多種促炎標(biāo)志物的效果。
圖1 嚴(yán)重的 BPD 以乳酸菌減少、變形菌增加和通過 MMP-9/Ac-PGP 途徑介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤為特征
A 與對照組相比，嚴(yán)重 BPD 嬰兒的變形菌增加，硬壁菌減少，并且通過 16s 微生物組測序測量的內(nèi)毒素水平升高（P = 0.0284）（數(shù)據(jù)來自參考文獻(xiàn) 12）。嚴(yán)重 BPD 嬰兒的 B Ac-PGP（P = 0.0003）、C MMP-9（P = 0.0002）、D MPO（P = 0.0023；對照組 N = 10，BPD N = 7 樣本）和 E NE 蛋白（P < 0.0001；對照組 N = 16，BPD N = 8 樣本）在他們的氣管抽吸物中的濃度更高。未配對 t 檢驗(yàn)。Ac-PGP 通過串聯(lián)質(zhì)譜測量；MMP-9、MPO 和 NE 通過 ELISA 測量。對照組 N = 7，BPD N = 7 樣本。小鼠從 PN3 到 PN14 暴露于高氧（HO），在 PN3、6、9 和 12 上給予 LPS，并在 PN14 處死。
F 暴露于 HO + LPS 的小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的肺泡發(fā)育不良和簡化。收獲的肺組織切片在蘇木精和伊紅（H&E）染色后以 4 倍放大拍攝。G LPS 小鼠的放射肺泡計(jì)數(shù)（RAC）減少。N = 24 樣本。肺功能惡化，通過 H 氣道阻力（增加）（空氣 N = 7，空氣+LPS N = 8，HO N = 5，HO + LPS N = 7 小鼠）和 I 順應(yīng)性（減少）在 HO + LPS 小鼠中測量（空氣 N = 10，空氣+LPS N = 8，HO N = 5，HO + LPS N = 7 小鼠）。暴露于 LPS 的小鼠在支氣管肺泡灌洗液（BAL）中 J Ac-PGP（空氣 N = 8，其他組 N = 7 小鼠）和 K MPO 的濃度更高（空氣 N = 10，空氣 + LPS N = 7，HO N = 6，HO + LPS N = 5 小鼠）。單向 ANOVA，Tukey 的多重比較測試。條代表中位數(shù) ± 四分位數(shù)范圍。
*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
三種噴霧干燥粉末配方的氣溶膠和物理特性
- MMAD：中值質(zhì)量空氣動力學(xué)直徑（Median Mass Aerodynamic Diameter）
- GSD：幾何尺寸分布（Geometric Size Distribution）
- FPF：細(xì)顆粒分?jǐn)?shù)（Fine Particle Fraction）
- gPSD：幾何顆粒尺寸（Geometric Particle Size）
- DSC：差示掃描量熱法（Differential Scanning Colorimetry）
- Tg：玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Glass Transition Temperature）
- KF：卡爾費(fèi)休法（Karl Fischer）
- CFU：菌落形成單位（Colony Forming Units）
圖2 Ac-PGP 驅(qū)動組織損傷，乳酸菌 LBP 減少中性粒細(xì)胞炎癥
Ac-PGP 和 LPS 與高氧 (HO) 結(jié)合暴露各自導(dǎo)致了嚴(yán)重的肺泡發(fā)育不良和簡化。
A 使用 RTR (精氨酸-蘇氨酸-精氨酸) 治療改善了肺泡結(jié)構(gòu)。H&E 染色，4倍放大。
B 給予 Ac-PGP 或 LPS 后 RAC 減少（N = 120 樣本）。
C 在 HO 中 Ac-PGP 暴露使 MPO 表達(dá)增加（P = 0.0451；空氣 N = 11, 空氣 + Ac-PGP N = 8, HO N = 8, HO+Ac-PGP N = 5 小鼠）。
D 在 Ac-PGP + HO 小鼠中右心室肥大 (RVH) 增加（P = 0.028；N = 4 小鼠）。
E 給予 RTR 治療后 RAC 改善。N = 120 樣本。
F 在 LPS + HO 暴露后 MPO 表達(dá)增加，RTR 治療后減少（P = 0.0079；空氣 N = 10, 空氣 + RTR N = 9, HO N = 5, HO + LPS + RTR N = 5 小鼠）。
G 在 LPS + HO 小鼠中使用 RTR 治療后 RVH 減少（P = 0.0187；N = 4 小鼠）。Mann–Whitney U 檢驗(yàn)，Kruskal–Wallis, Dunn’s 多重比較測試。
H 高氧加劇了經(jīng)鼻內(nèi)暴露于大腸桿菌的小鼠肺泡簡化，而經(jīng)氣管 LBP 治療改善了 E. coli + HO 小鼠的組織結(jié)構(gòu)。H&E 染色，4倍放大。
I 在 HO + E. coli 暴露后 RAC 減少，LBP 治療后恢復(fù)正常?？諝?N = 7, 空氣 + E. coli N = 5, 空氣 + E. coli + Lacto N = 5, HO 組 N = 5 小鼠各。
J BAL 中 MMP-9, K NE, L MPO, M IL-6, 和 N CRP 在 LBP 治療后減少。單向 ANOVA, Tukey’s 多重比較測試。空氣 N = 7, 空氣 + E. coliN = 10, 空氣 + E. coli + Lacto N = 5, HO N = 6, HO + E. coli N = 8, HO + E. coli + Lacto N = 5 小鼠。條代表中位數(shù) ± 四分位數(shù)范圍。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。
圖3 乳酸菌混合物通過 L (+) 乳酸產(chǎn)生減少中性粒細(xì)胞炎癥
A 單獨(dú)的菌株 L. plantarum (P)、L. acidophilus (A) 和 L. rhamnosus (R) 比單獨(dú)的 L. casei、L. paracasei、L. reuteri 和 L. fermentum 菌株以及沒有乳酸菌處理的僅 E. coli 暴露相比，更能減少 MMP-9 表達(dá)。N = 7。
B 不同比例的混合 P、A 和 R 在不同程度上減少 MMP-9。N = 7 孔。
C 在減少有毒刺激暴露的體外人支氣管上皮 (HBE) 模型中，P、A 和 R 的混合物比單獨(dú)的菌株更有效地減少 MMP-9。N = 4 孔。
D 乳酸菌混合物培養(yǎng)上清液在增加的濃度下減少 MMP-9 表達(dá)。N = 6。
E 單獨(dú)的活性乳酸菌菌株與其他三種混合物菌株的上清液共轉(zhuǎn)染。L. acidophilus 上清液與活的 A、P、R 和 PR 混合物培養(yǎng)，增加了 P 和 PR 混合物的乳酸基因表達(dá)（作為代表性示例顯示）。AS A N = 13, AS P N = 6, AS R N = 9, AS PR N = 9 孔。
F 乳酸菌菌株單獨(dú)和作為混合物產(chǎn)生更多的 L (+) 乳酸而不是 D (+) 乳酸。N = 6 孔。
G L (+) 乳酸減少暴露于 E. coli 的 HBE 細(xì)胞中的 MMP-9 表達(dá) (N = 6 孔)，而 H D (?) 乳酸則不減少 (N = 4 孔)。
Kruskal–Wallis 檢驗(yàn)，Dunn’s 多重比較。細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行三次重復(fù)。條代表中位數(shù) ± 四分位數(shù)范圍。
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。
圖4 L (+) 乳酸減少 MMP-9 并在體內(nèi)由乳酸菌產(chǎn)生
通過氣管內(nèi)給藥的方式，將 L (+) 乳酸給予經(jīng) LPS 處理 10 天的小鼠。
A 肺組織學(xué)圖像顯示 LPS 損傷后的肺泡簡化，以及 LA 治療后的輕微恢復(fù)。H&E 染色，4倍放大。
B 給予每只小鼠 1 ug/g 體重的 L (+) LA 治療后，MLI 減少（P = 0.0152；N = 6 小鼠）。
C 通過氣管內(nèi)給予 L (+) 乳酸治療后，肺組織 MMP-9 表達(dá)減少（對照 N = 10, LPS N = 8, LA 0.125 N = 4, LA 0.5 N = 12, LA 1.0 N = 4 小鼠）。
D 健康小鼠經(jīng)氣管接種乳酸菌 LBP 后 3 小時(shí)，乳酸菌（綠色）定位到肺上皮。DAPI 藍(lán)色。4倍放大，插圖為 40倍放大。N = 5。
E 健康小鼠經(jīng)氣管接種 LBP 至肺部，通過減少菌落數(shù)顯示細(xì)菌的逐漸清除超過 72 小時(shí)。
F 健康小鼠經(jīng)氣管接種 LBP 至肺部，顯示 L (+) 乳酸產(chǎn)生增加，并通過 72 小時(shí)后劑量持續(xù)效果。L(+) LA 通過乳酸比色法測量。每個(gè)時(shí)間點(diǎn) N = 3 小鼠。
G–I 炎癥生物標(biāo)志物 MMP-9、CRP 和 IL-6 在 LBP 劑量后 4–8 小時(shí)升高，并在 16–24 小時(shí)恢復(fù)到基線水平。每個(gè)時(shí)間點(diǎn) N = 5 小鼠。
Mann–Whitney U 檢驗(yàn)和 Kruskal–Wallis, Dunn’s 多重比較。條代表中位數(shù) ± 四分位數(shù)范圍。
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。
圖5 噴霧干燥產(chǎn)生含有活性細(xì)菌的小流動性粉末顆粒
A 用于將乳酸菌干燥成小流動性粉末顆粒的噴霧干燥過程的示意圖。
B 干燥后三種配方粉末顆粒的掃描電子顯微鏡 (SEM) 圖像。從每個(gè)樣品中獲取了 25,000、50,000 和 100,000 倍放大的圖像（從左到右）。
圖6 基于乳酸菌的活體生物治療產(chǎn)品 (LBP) 改善慢性阻塞性肺病 (COPD) 小鼠模型中的炎癥生物標(biāo)志物及肺結(jié)構(gòu)和功能
小鼠暴露于香煙煙霧中1個(gè)月，并經(jīng)氣管內(nèi)給予乳酸菌 LBP (Lacto) 治療。
A 肺組織學(xué)圖像（H&E 染色，40倍放大）通過 (B) 平均線性截距 (MLI) 測量，顯示1個(gè)月煙霧暴露后肺泡結(jié)構(gòu)沒有顯著惡化。測量值：空氣 N = 5, 空氣 + Lacto N = 11, 煙霧 N = 23, 煙霧 + Lacto N = 27 樣本。暴露于煙霧并接受 Lacto 治療的小鼠在 (C) 肺組織 MMP-9 表達(dá) (空氣 N = 4, 煙霧 N = 5 小鼠)，D 血清 MMP-9 蛋白水平 (空氣 N = 4, 煙霧 N = 5 小鼠)，以及 E 支氣管肺泡灌洗液 (BAL) IgA 蛋白水平 (空氣 N = 4, 煙霧 N = 6 小鼠) 方面顯示出改善。小鼠暴露于經(jīng)氣管內(nèi)給予的豬胰彈性蛋白酶 (PPE) 和 LPS，導(dǎo)致顯著的肺泡發(fā)育不良和簡化。
F 肺組織學(xué)圖像（H&E 染色，4倍放大）顯示，在損傷期間吸入 Lacto LBP 減少了組織損傷。G 在 PPE 和 PPE + LPS 暴露組中，給予 Lacto LBP 治療后 MLI 得到改善。
H 肺功能通過增加的阻力測量，在暴露于 PPE 后惡化，在接受 Lacto LBP 治療后改善。
I 通過順應(yīng)性測量的肺功能在各組之間沒有顯著變化。
J 肺組織中 MMP-9 表達(dá)在 PPE + LPS 暴露后增加，在接受 Lacto LBP 治療后減少。
K 在 PPE 和 PPE + LPS 暴露后 BAL 中的 MMP-9 蛋白增加，在接受 PPE + LPS 小鼠的 Lacto LBP 治療后減少。
L 在 PPE + LPS 小鼠中，Lacto LBP 治療后 BAL 中的 NE 蛋白減少。
M 在 PPE + LPS 暴露后 BAL 中的 CRP 蛋白增加，在接受 Lacto LBP 治療后減少。
N 在 PPE 和 PPE + LPS 小鼠中，Lacto LBP 治療后 BAL 中的 IL-8 蛋白減少。
O 在對照、PPE 和 PPE + LPS 小鼠中，Lacto LBP 治療后 BAL 中的 IgA 蛋白增加（改善）。N = 12 小鼠（6 雄/6 雌）。
Kruskal–Wallis 檢驗(yàn)，Dunn’s 多重比較。條代表中位數(shù) ± 四分位數(shù)范圍。
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。
圖7 小鼠通過氣管內(nèi)給予 PPE 和 LPS 來建立肺氣腫和細(xì)菌驅(qū)動的炎癥
A 肺組織學(xué)圖像（H&E 染色，4倍放大）顯示，在損傷建立后2周給予 Lacto LBP 治療，減少了炎癥并改善了組織結(jié)構(gòu)。損傷后給予類固醇治療減少了炎癥。
B PPE 和 PPE + LPS 暴露均增加了平均肺泡大小，而 Lacto LBP 治療顯著減少了（改善了）它。類固醇氟替卡松（FF）也顯著減少了 MLI，但在 PPE 組中不如 Lacto LBP 顯著。測量值：輔料 N = 16, Lacto N = 8, 類固醇 N = 18, PPE + 輔料 N = 44, PPE + Lacto N = 18, PPE + 類固醇 N = 18, PPE + LPS N = 13, PPE + LPS + Lacto N = 24, PPE + LPS + 類固醇 N = 23 樣本。
C 在減少暴露于 PPE + LPS 的小鼠 BAL 中的 MMP-9 蛋白方面，Lacto LBP 的效果優(yōu)于類固醇。
D 在減少暴露于 PPE 和 PPE + LPS 的小鼠 BAL 中的 CRP 蛋白方面，Lacto LBP 的效果與類固醇相當(dāng)。輔料 N = 5, Lacto N = 2, 類固醇 N = 3, PPE + 輔料 N = 3, PPE + Lacto N = 6, PPE + 類固醇 N = 4, PPE + LPS N = 5, PPE + LPS + Lacto N = 7, PPE + LPS + 類固醇 N = 6 小鼠。Kruskal–Wallis 檢驗(yàn)，Dunn’s 多重比較。條代表中位數(shù) ± 四分位數(shù)范圍。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。
圖8 吸入式基于乳酸菌的活體生物治療產(chǎn)品 (LBP) 在 PPE 小鼠模型中顯示出良好的安全性和生物分布特性
A 在生物分布研究中，所有小鼠在第 23 天（終點(diǎn)犧牲）和第 28 天（恢復(fù)犧牲）均存活。為了可見性，生存曲線進(jìn)行了偏移。
在 B–H 終點(diǎn)犧牲小鼠和 I–O 恢復(fù)犧牲小鼠中，體重、體溫、血氧飽和度、呼吸頻率、呼吸膨脹、心率和脈搏膨脹在 LBP 給藥 2 周后仍保持在正常范圍內(nèi)。
P 來自 PCR 的代表性凝膠顯示終點(diǎn)犧牲組織肺、血清和大腦中沒有 LBP 乳酸菌株的存在。
Q 來自 PCR 的代表性凝膠顯示恢復(fù)犧牲組織肺、血清和大腦中沒有 LBP 乳酸菌株的存在。PBS 和 PPE 對照每組 N = 10；PPE + 安慰劑，LBP 1 mg，LBP 3 mg 每組 N = 15 小鼠。Kruskal–Wallis 檢驗(yàn)，Dunn’s 多重比較。條代表中位數(shù) ± 四分位數(shù)范圍。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。
圖9 吸入式乳酸菌 LBP 工作原理的示意圖
粒子工程創(chuàng)新促進(jìn)了乳酸菌 LBP 直接進(jìn)入肺部，幫助減少炎癥和恢復(fù)肺組織。吸入的 LBP 釋放抗炎代謝物，減少 MMP-9 和 Ac-PGP 表達(dá)以及下游的中性粒細(xì)胞炎癥。其他炎癥生物標(biāo)志物減少，保護(hù)性 IgA 增加。
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-51169-0
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