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術(shù)后粘連是由于創(chuàng)傷組織與相鄰組織或器官之間病理性連接而引起的，最常見于腹腔、心包、肝臟、腱和子宮等部位。其中，腹腔粘連尤為關(guān)注，因為其發(fā)病率高，且腹部手術(shù)的數(shù)量逐漸增加。據(jù)統(tǒng)計，93%的腹部手術(shù)患者會發(fā)生腹腔粘連。雖然通過粘連松解術(shù)可以機械性地移除粘連，但這也增加了復(fù)發(fā)性粘連的風(fēng)險，原因包括手術(shù)創(chuàng)傷、出血和感染。腹腔粘連可能導(dǎo)致女性不孕、嘔吐、腹痛和小腸梗阻等并發(fā)癥，每年因此增加了30萬次手術(shù)，并造成數(shù)十億美元的醫(yī)療費用。因此，開發(fā)有效的預(yù)防腹腔粘連和復(fù)發(fā)性粘連的策略至關(guān)重要。目前，臨床上用于預(yù)防術(shù)后腹腔粘連的策略主要分為藥物治療和物理屏障兩類。常見的預(yù)防腹腔粘連的藥物，如抗炎藥物、膠原蛋白抑制劑和纖溶劑，通常效果不佳，因為它們在腹腔內(nèi)代謝迅速。物理屏障系統(tǒng)通過隔離受創(chuàng)組織和相鄰組織，防止粘連的發(fā)生。然而，現(xiàn)有的商業(yè)化屏障產(chǎn)品在預(yù)防效果上表現(xiàn)有限，例如Seprafilm和Interceed等屏障膜由于停留時間短和實際使用限制，無法保證有效結(jié)果。同樣，Adept（愛得普）聚合物溶液由于粘度低，難以有效附著于腹膜，因此在預(yù)防粘連方面效果欠佳。相比之下，水凝膠因其高度適應(yīng)性和與腹腔鏡手術(shù)的兼容性，顯示出更大的應(yīng)用前景。

針對上述問題，西安交通大學(xué)的王珂團隊開發(fā)了一種新型抗污注射水凝膠（CGM水凝膠），其通過甲基丙烯酸酯硫酸軟骨素（CS-GMA）和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸膽堿（MPC）單體的自由基聚合制備。CGM水凝膠的加入大大提高了抗污能力和親水性。此外，硫酸軟骨素（CS）通過甲基丙烯酸化破壞分子間氫鍵，促進快速水化。相關(guān)研究表明，CGM水凝膠不僅表現(xiàn)出良好的生物相容性，而且有效地預(yù)防了術(shù)后腹腔粘連。相關(guān)研究在2024年6月8日以“An injectable and antifouling hydrogel prevents the development of abdominal adhesions by inhibiting the CCL2/CCR2 interaction”為題發(fā)表于《Biomaterials》（DOI: 10.1016/j.biomaterials.2024.122661）。

圖1 研究示意圖

（1）CGM水凝膠的制備與表征

本研究通過熱引發(fā)共聚合合成了CGM水凝膠，主要成分包括CS-GMA和MPC。水凝膠展示了良好的自愈能力和抗污性能，能夠有效減少非特異性蛋白質(zhì)和細胞吸附。¹H NMR和FT-IR分析驗證了CS-GMA的成功合成，接枝率為36%。FT-IR顯示了氫鍵的存在和結(jié)構(gòu)變化。流變測試顯示，CGM水凝膠在0–300秒內(nèi)保持穩(wěn)定的儲能模量（G'）和損耗模量（G"），展現(xiàn)出優(yōu)異的剪切稀化行為，適合腹腔鏡手術(shù)。步進應(yīng)變掃描測試證實了水凝膠的自愈性能，特別是CGM-2水凝膠表現(xiàn)出更優(yōu)的機械性能。通過添加尿素和氯化鈉，進一步確認了水凝膠中的氫鍵和靜電相互作用。頻率掃描和時間掃描測試表明，CGM水凝膠在60 Hz以下表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性，并在50至100秒間完成溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。

圖2 CGM水凝膠的制備與表征

（2）CGM水凝膠的抗污能力

在腹腔植入過程中，非特異性蛋白質(zhì)吸附和細胞附著是水凝膠面臨的主要挑戰(zhàn)。為評估CGM水凝膠的抗污能力，實驗將L929和RAW264.7細胞與CGM水凝膠和TCPS共同孵育23小時，結(jié)果顯示TCPS表面有大量細胞附著，而CGM水凝膠表面幾乎沒有細胞附著。這是因為CGM水凝膠表面的MPC形成了致密的水合層，阻礙了帶電蛋白質(zhì)和細胞的附著。進一步的蛋白吸附測試使用牛血清白蛋白（BSA）和纖維蛋白原進行。結(jié)果顯示，CGM水凝膠相比純硫酸軟骨素（PCS）水凝膠顯著減少了BSA和纖維蛋白原的吸附，尤其是CGM-2水凝膠表現(xiàn)出更強的抗吸附能力。此外，CGM水凝膠對紅細胞的附著能力也較低，CGM-2和CGM-1水凝膠的表面顏色明顯淺于PCS和CGM-3。這些結(jié)果表明CGM水凝膠在防止非特異性蛋白質(zhì)吸附和細胞附著方面表現(xiàn)優(yōu)異，CGM-2水凝膠在各項測試中表現(xiàn)最佳，因此被選為后續(xù)實驗的主要研究對象。

圖3 CGM水凝膠的防污能力

（3）CGM水凝膠的生物相容性

CGM水凝膠的生物相容性是其應(yīng)用于體內(nèi)的關(guān)鍵因素。MTT測試結(jié)果顯示，L929和HMrSV5細胞在不同濃度的CGM-2水凝膠中培養(yǎng)后，細胞活力均保持在80%以上，表明CGM-2水凝膠具有良好的生物相容性。活/死細胞熒光染色的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像進一步證實了這一點，兩種細胞在CGM-2水凝膠中均顯示出綠色熒光（活細胞），且與TCPS培養(yǎng)的細胞相比，未見明顯的形態(tài)和數(shù)量差異。此外，CGM-2水凝膠的溶血實驗結(jié)果顯示，紅細胞懸液的溶血率低于5%，表明其在術(shù)后應(yīng)用中的潛力。通過對SD大鼠主要器官的H&E染色和Masson三色染色分析，結(jié)果顯示CGM水凝膠組與正常組相比，無明顯的生理差異。心肌細胞排列整齊，無炎癥跡象，肝竇無肥大或充血，脾組織正常，肺組織無肺泡擴張或塌陷，腎組織中正常腎小管和腎小球清晰可見。這些結(jié)果表明CGM水凝膠具有優(yōu)異的體內(nèi)生物相容性，且其成分及其降解產(chǎn)物在體內(nèi)不會對細胞和器官產(chǎn)生毒性。

圖4 CGM水凝膠的生物相容性

（4）CGM水凝膠預(yù)防術(shù)后粘連的效果

為了評估CGM-2水凝膠在預(yù)防術(shù)后粘連中的效果，建立了大鼠體內(nèi)腹腔粘連模型和復(fù)發(fā)性腹腔粘連模型。在模型中，通過在受損區(qū)域直接涂抹CGM-2水凝膠以預(yù)防粘連。研究發(fā)現(xiàn)，CGM組在第5天的粘連評分為0.5，顯示出較少的粘連形成，而對照組的粘連評分達到9.8，第10天更為嚴(yán)重。相比之下，使用HA水凝膠的組在第5天的粘連評分為3.8，但仍有部分粘連殘留。在復(fù)發(fā)性粘連模型中，對比復(fù)發(fā)性粘連和初次粘連，復(fù)發(fā)性粘連通常更加廣泛和堅固。研究表明，未接受任何干預(yù)的對照組在黏連松解后第5天的粘連評分為10.0，表明復(fù)發(fā)性粘連幾乎不可避免。而HA組的平均粘連評分為5.0，CGM水凝膠組幾乎沒有粘連。此外，由于CGM-2水凝膠可在10天內(nèi)完全降解，進一步研究了其在完全降解后的防粘連效果。第14天時，CGM組的平均粘連評分為1.5，顯示出較少的粘連形成。血液分析結(jié)果進一步證明了CGM水凝膠的體內(nèi)生物相容性和血液相容性?？傮w結(jié)果表明，CGM水凝膠可以有效預(yù)防初次和復(fù)發(fā)性腹腔粘連。

圖5 CGM水凝膠在體內(nèi)預(yù)防腹腔形成的效果

（5）CGM水凝膠的病理分析

粘連組織H&E和Masson染色的病理結(jié)果顯示，第5天，模型組顯示出廣泛的粘連組織，盲腸肌肉與腹膜緊密粘連，伴有肉芽組織增生、大量新生血管和纖維結(jié)締組織的生長。H&E和Masson染色檢測到大量炎性細胞、空泡樣結(jié)構(gòu)和膠原沉積。第10天，模型組的膠原和纖維結(jié)締組織變得更厚、更廣泛，顯示出不可逆的粘連形成。相比之下，HA組在第5天的粘連顯著減少，但間皮細胞排列仍然紊亂。第10天，受損的腹膜和盲腸之間仍有部分結(jié)締組織和膠原沉積，表明HA水凝膠在抑制粘連形成方面的效果有限。CGM組的結(jié)果顯示，腹膜和盲腸在第5天和第10天完全分離，且再生組織類似于正常組，炎性細胞浸潤和膠原沉積最少。這些發(fā)現(xiàn)表明CGM水凝膠能有效防止初次粘連的形成并促進組織再生。在經(jīng)歷粘連松解手術(shù)的大鼠中，觀察到更廣泛的粘連，伴有纖維結(jié)締組織和新生血管的形成。HA組顯示持續(xù)的纖維增生反應(yīng)和炎性細胞積聚，證明商業(yè)HA水凝膠缺乏預(yù)防復(fù)發(fā)性粘連的能力。而CGM水凝膠組中，盲腸的間皮細胞層和肌肉與正常組相似，無明顯的炎性細胞積聚和膠原沉積。

圖6 粘連組織在粘連松解后第5天、第10天和第5天經(jīng)不同處理后的代表性H&E和Masson三色染色。CE：盲腸粘膜；AW：腹壁。比例尺：300 μm

（6）CGM水凝膠防止粘連的潛在機制

為深入探討CGM水凝膠防止粘連的潛在機制，進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析。主成分分析（PCA）顯示，正常組與模型組有明顯差異。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定的14144個基因中，11963個基因在所有組中表達，而模型組和CGM組中分別有425和371個特異性表達基因。熱圖和火山圖揭示了一些與粘連形成密切相關(guān)的基因，包括TGF-βR1，它可以通過經(jīng)典的Smad信號通路參與和調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和纖維化過程。蛋白質(zhì)組學(xué)分析進一步證實了這一點，模型組與CGM組和正常組的蛋白表達譜存在顯著差異?；鹕綀D顯示，模型組中CCL2、CCR2、VIM和FN1等基因表達顯著上調(diào)，而CGM水凝膠顯著下調(diào)了CCL2和CCR2的表達。CCL2與其受體CCR2的結(jié)合可促進細胞遷移，包括巨噬細胞、成纖維細胞等，這是粘連形成的關(guān)鍵因素。

圖7 使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析分析差異基因表達（n = 3）

免疫熒光染色結(jié)果顯示，模型組中CCL2和CCR2的表達顯著增加，而CGM水凝膠處理組顯著減少。此外，Western-blot和RT-PCR結(jié)果顯示，CGM水凝膠顯著抑制了CD68和波形蛋白的表達，這表明其有效地抑制了巨噬細胞和成纖維細胞的遷移。

圖8 CGM水凝膠對CCL2/CCR2相互作用的影響

圖9 CGM 水凝膠對 CD68/Vimentin 表達的影響

進一步的分析顯示，CGM水凝膠處理組中TNF-α的表達顯著降低，而IL-10的表達增加，表明其具有良好的抗炎作用。模型組中觀察到較少的t-PA表達和大量的PAI-1表達，而CGM水凝膠組則相反。CGM水凝膠處理后，Col I的表達減少，MMP-9的表達增加。此外，CGM水凝膠還顯著降低了TGF-βR1的表達。這些結(jié)果表明，CGM水凝膠能夠調(diào)節(jié)ECM的降解和纖維蛋白溶解的平衡，從而有效防止腹腔粘連的形成。

圖10 水凝膠處理后粘連組織炎癥因子和受體的表達水平

圖11 CGM水凝膠對t-PA/PAI-1平衡的影響

圖12 CGM 水凝膠對膠原降解的影響

（7）CGM水凝膠的體內(nèi)滯留時間

抗粘連屏障的生物降解性是關(guān)鍵因素，滯留時間過短會降低效果，而過長則可能引發(fā)異物反應(yīng)。為了評估CGM-2水凝膠的體內(nèi)滯留時間，采用了體內(nèi)成像和磁共振成像（MRI）。在腹腔內(nèi)注射后，標(biāo)記有Cy7的CGM-2水凝膠在大鼠腹腔中顯示出強烈的熒光信號。結(jié)果顯示，CGM-2水凝膠在注射3天后殘留約37%，7天后殘留約24%，表明其在腹腔內(nèi)逐漸降解。到第10天，熒光信號減弱并幾乎消失。為進一步評估體內(nèi)降解情況，將CGM-2水凝膠植入皮下并進行T1加權(quán)信號的MRI評估。結(jié)果顯示，CGM-2水凝膠的信號從第0天到第7天可觀察到，10天時顯著減少，14天時幾乎不可見，表明CGM-2水凝膠在體內(nèi)的滯留時間約為10至14天，與活體成像結(jié)果一致。此外，還對CGM-3水凝膠的體內(nèi)成像進行了研究，以探索CGM水凝膠降解的可調(diào)性。如圖S16A所示，CGM-3水凝膠在腹腔內(nèi)注射后，3天時殘留約76%，7天時殘留約56%。第10天時，CGM-3水凝膠的熒光信號減弱到27%，14天時幾乎消失。這表明CGM-3水凝膠在體內(nèi)具有較長的降解時間，可能是由于其更致密的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。該結(jié)果顯示CGM水凝膠具有良好的降解時間可調(diào)性，為其在其他生物領(lǐng)域的應(yīng)用提供了廣闊的前景。

圖13 CGM-2 水凝膠的生物降解性

小結(jié)：

本研究設(shè)計并制備了一種由CS-GMA和MPC單體組成的可注射抗污CGM水凝膠，用于預(yù)防術(shù)后腹腔粘連和肝臟粘連。CGM水凝膠展示了優(yōu)異的抗污和自愈特性，這歸因于其可逆氫鍵和靜電相互作用網(wǎng)絡(luò)。此外，MPC的加入在CGM水凝膠周圍形成了致密的水合層，顯著防止了非特異性蛋白吸附和細胞附著。體外降解和細胞實驗證明了該水凝膠的優(yōu)異生物相容性和理想的降解時間。在腹腔和肝臟粘連模型中，CGM水凝膠有效防止了術(shù)后粘連的形成。機制研究表明，CCL2/CCR2的相互作用影響巨噬細胞和成纖維細胞的募集以及ECM的沉積，這些都與粘連的形成有關(guān)。CGM水凝膠顯著下調(diào)了CCL2/CCR2的表達，通過物理屏障和細胞因子調(diào)控的協(xié)同作用防止了腹腔粘連。這種創(chuàng)新的可注射水凝膠為術(shù)后粘連預(yù)防提供了一種可行且有前景的策略。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961224001959#appsec1