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骨肉瘤是最常見的兒童和青少年惡性骨腫瘤，常規(guī)治療方法包括手術(shù)切除、新輔助化療、放療和免疫治療。這些治療盡管能控制腫瘤的進(jìn)展，但對骨組織的再生卻有負(fù)面影響，導(dǎo)致患者長期的骨健康風(fēng)險(xiǎn)增加。靶向免疫治療，如免疫檢查點(diǎn)抑制劑、單克隆抗體、癌癥疫苗和嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）免疫治療，在血液惡性腫瘤中顯示出潛力，但在固體腫瘤如骨肉瘤中，因靶向效率低和局部藥物濃度不足而面臨挑戰(zhàn)。因此，局部遞送免疫治療藥物，如抗PD-L1抗體（αPD-L1），被視為增強(qiáng)骨肉瘤治療效果的有前景方法。此外，hedgehog信號通路的活性已在臨床試驗(yàn)（如NCT03282344試驗(yàn)）中得到驗(yàn)證，hedgehog通路抑制劑vismodegib可能成為骨肉瘤治療的潛在藥物，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

針對上述問題，華南理工大學(xué)邊黎明團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種結(jié)合αPD-L1、vismodegib和鎂離子的生物活性納米復(fù)合水凝膠，以增強(qiáng)骨肉瘤術(shù)后的免疫治療和骨再生。該水凝膠注射到原發(fā)腫瘤切除后的骨缺損部位，能夠持續(xù)釋放αPD-L1和vismodegib，有效調(diào)節(jié)哨點(diǎn)淋巴結(jié)中的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)被腫瘤細(xì)胞抑制的CD8+ T細(xì)胞活性。同時(shí)，釋放的鎂離子在體外實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的成骨分化，進(jìn)一步促進(jìn)術(shù)后骨缺損的修復(fù)。該納米復(fù)合水凝膠具有清除殘余腫瘤細(xì)胞和促進(jìn)骨愈合的雙重功能，為骨肉瘤的保肢治療提供了一種新方案。相關(guān)研究于2024年7月27日以《Bioactive nanocomposite hydrogel enhances postoperative immunotherapy and bone reconstruction for osteosarcoma treatment》為題發(fā)表于《Biomaterials》（DOI: 10.1016/j.biomaterials.2024.122714）。

圖1 研究示意圖

（1）HA-BP-Mg生物活性納米復(fù)合水凝膠的制備與表征

本研究設(shè)計(jì)了以透明質(zhì)酸（HA）為基質(zhì)，通過巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)將巰基化雙膦酸鹽（巰基-BP）與甲基丙烯酸化HA（MeHA）結(jié)合，并添加氯化鎂（MgCl2）以形成納米復(fù)合水凝膠。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示水凝膠內(nèi)部含有Mg-BP納米顆粒，結(jié)構(gòu)致密。隨著BP和Mg2+濃度的增加，水凝膠的楊氏模量和儲(chǔ)能模量均顯著提高，使用50 mM BP和Mg2+制備的水凝膠的楊氏模量為6.88 ± 0.28 kPa，具備良好的注射性和可塑性。此外，該水凝膠表現(xiàn)出剪切稀化和快速應(yīng)力松弛特性（τ1/2 = 35.9 ± 9.7 s），其動(dòng)態(tài)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)有利于細(xì)胞的滲透和生長。

圖2 生物活性納米復(fù)合水凝膠的形成和機(jī)械性能

（2）HA-BP-Mg生物活性納米復(fù)合水凝膠實(shí)現(xiàn)αPD-L1、維莫德吉和Mg2+的持續(xù)共遞送

HA-BP-Mg水凝膠用于共遞送αPD-L1、維莫德吉（vismodegib）和Mg2+。水凝膠由20 mg/mL HA-BP、50 mM BP和50 mM Mg2+組成，并封裝了0.43 mg/mL αPD-L1和1.075 mg/mL維莫德吉。水凝膠能通過注射適應(yīng)不同形狀，并在2周內(nèi)持續(xù)釋放αPD-L1和維莫德吉，Mg2+的釋放時(shí)間超過3周。第三周內(nèi)，αPD-L1和維莫德吉的釋放分別為3%和2.6%。這些藥物的順序釋放有助于增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞活性，提高腫瘤免疫治療效果。細(xì)胞存活測定顯示，3T3和K7M2細(xì)胞在水凝膠浸提液中具有良好存活率，分別為87.3%和100.6%。體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)表明，水凝膠逐漸降解，無明顯炎癥反應(yīng)或主要器官病變。綜合結(jié)果表明，HA-BP-Mg水凝膠具有良好的生物相容性和可控的降解性能。

圖3 可注射且生物相容性的納米復(fù)合水凝膠能夠持續(xù)共同遞送 αPD-L1、vismodegib 和 Mg2+

（3）生物活性納米復(fù)合水凝膠促進(jìn)體外hBMSCs的成骨分化

研究表明，鎂離子（Mg2+）能通過調(diào)節(jié)BMP-2和Wnt/β-catenin等信號通路，促進(jìn)MSC的成骨分化。為了驗(yàn)證Mg2+、αPD-L1和維莫德吉的協(xié)同作用，hBMSCs與含有這些成分的HA-BP-Mg水凝膠共培養(yǎng)（包括Gel、Vis-Gel、αPD-L1-Gel和Vis-αPD-L1-Gel），并進(jìn)行7天或21天的成骨誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，與不含Mg2+的對照組（Osteo-IM）相比，含Mg2+的水凝膠組表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨活性和礦物沉積，RT-qPCR分析也顯示成骨標(biāo)志基因表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明，HA-BP-Mg水凝膠中持續(xù)釋放的Mg2+在αPD-L1和維莫德吉的作用下，有效促進(jìn)了hBMSCs的成骨分化和骨再生。

圖4 生物活性納米復(fù)合水凝膠在體外增強(qiáng)hBMSCs的成骨分化

（4）局部共遞送αPD-L1和維莫德吉的水凝膠增強(qiáng)體內(nèi)抗骨肉瘤治療效果

首先在BALB/c小鼠背部皮下用K7M2細(xì)胞構(gòu)建異位骨肉瘤模型，隨后將腫瘤片段移植到脛骨部位。H&E染色證實(shí)了皮下和脛骨部位腫瘤細(xì)胞的同一性，沒有局部轉(zhuǎn)移跡象。接著，對小鼠進(jìn)行手術(shù)處理，僅去除90%的腫瘤組織，以模擬術(shù)后殘留腫瘤的情況。小鼠被隨機(jī)分為五組（PBS、Gel、Vis-Gel、αPD-L1-Gel和Vis-αPD-L1-Gel組），并在骨缺損處注射水凝膠。結(jié)果顯示，與PBS或Gel組相比，Vis-Gel或αPD-L1-Gel組（分別釋放維莫德吉或αPD-L1）顯著抑制了骨肉瘤的生長，腫瘤生長抑制率分別為49.4%和76.2%。特別是Vis-αPD-L1-Gel組（同時(shí)釋放維莫德吉和αPD-L1）表現(xiàn)出協(xié)同的抗骨肉瘤效果，腫瘤生長抑制率達(dá)到90.2%。治療結(jié)束時(shí)，Vis-αPD-L1-Gel組的小鼠腫瘤重量僅為PBS組的35.5%，顯著優(yōu)于Vis-Gel（75%）和αPD-L1-Gel（59.2%）組。此外，與PBS組相比，Vis-Gel或αPD-L1-Gel治療顯著延長了骨肉瘤小鼠的總生存期，Vis-αPD-L1-Gel組的小鼠生存期更長，中位生存時(shí)間（MST）為42天，遠(yuǎn)高于Vis-Gel（32天）和αPD-L1-Gel（37天）組。Vis-αPD-L1-Gel在治療過程中沒有觀察到體重下降，證明了其良好的耐受性和安全性。以上結(jié)果表明，通過HA-BP-Mg水凝膠局部共遞送αPD-L1和維莫德吉能有效增強(qiáng)抗骨肉瘤的治療效果。

圖5 生物活性納米復(fù)合水凝膠抑制K7M2骨肉瘤術(shù)后復(fù)發(fā)

（5）水凝膠局部共遞送αPD-L1和維莫德吉增強(qiáng)骨肉瘤和前哨淋巴結(jié)中CD8+ T細(xì)胞的活性

研究團(tuán)隊(duì)通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化（IHC）分析了Vis-αPD-L1-Gel的治療效果。在前哨淋巴結(jié)（SLN）中，Vis-αPD-L1-Gel組的CD8+ T細(xì)胞比例增加至22.8%，顯著高于其他組。此外，該組的CD8+/CD4+ T細(xì)胞比例顯著提高至0.33，顯示出αPD-L1和維莫德吉的協(xié)同作用。然而，脾臟中的CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞比例變化不明顯。進(jìn)一步的解剖組化分析顯示，Vis-αPD-L1-Gel和αPD-L1-Gel組的腫瘤中CD8+ T細(xì)胞浸潤增加，H&E染色顯示這兩組的癌細(xì)胞死亡顯著增多。Ki67和TUNEL檢測也驗(yàn)證了這些結(jié)果，表明局部注射Vis-αPD-L1-Gel顯著增強(qiáng)了腫瘤中CD8+ T細(xì)胞的活性，提高了治療效果。

圖6 生物活性納米復(fù)合水凝膠增強(qiáng)骨肉瘤和SLN中CD8+T細(xì)胞的活化

（6）生物活性納米復(fù)合水凝膠促進(jìn)脛骨骨肉瘤引起的骨缺損再生

該團(tuán)隊(duì)評估了藥物負(fù)載的生物活性水凝膠在骨再生中的效果。X光觀察顯示，PBS組和Gel組的脛骨嚴(yán)重受到腫瘤侵蝕（黃色箭頭），而αPD-L1-Gel和Vis-αPD-L1-Gel組表現(xiàn)出較好的治療效果，骨腫瘤侵蝕較少。Micro-CT觀察、3D重建和橫截面圖像顯示，Vis-αPD-L1-Gel組的骨礦密度（BMD）和骨礦含量（BMC）顯著增加，表明該生物活性納米復(fù)合水凝膠促進(jìn)了骨再生并抑制了殘余腫瘤組織。此外，Vis-αPD-L1-Gel組的骨體積（BV）顯著高于PBS和Gel組，但與Vis-Gel和αPD-L1-Gel組沒有顯著差異。H&E染色顯示，PBS、Gel和Vis-Gel組的骨結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重侵蝕，而αPD-L1-Gel和Vis-αPD-L1-Gel組則表現(xiàn)出相對正常的骨結(jié)構(gòu)，證明αPD-L1和維莫德吉的聯(lián)合遞送具有顯著的治療效果。

圖7 植入生物活性納米復(fù)合水凝膠促進(jìn)骨肉瘤引起骨缺損的修復(fù)

小結(jié)：

本研究開發(fā)了一種具有雙重功能的生物活性納米復(fù)合水凝膠，用于骨肉瘤手術(shù)后的殘留腫瘤細(xì)胞消除和骨組織再生。該水凝膠通過聯(lián)合遞送αPD-L1、維莫德吉和鎂離子（Mg2+），在小鼠脛骨骨肉瘤模型中顯著增強(qiáng)了腫瘤特異性CTLs的活性，并促進(jìn)了分化和浸潤。鎂離子不僅增強(qiáng)了CD8+ T細(xì)胞的活性，還通過提高ALP表達(dá)和促進(jìn)MSC的成骨分化，促進(jìn)了骨組織的再生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種局部應(yīng)用的水凝膠有效提高了癌癥治療的效果，促進(jìn)了骨組織的修復(fù)，并延長了動(dòng)物的生存期。這些發(fā)現(xiàn)展示了該水凝膠在骨肉瘤治療中的潛力，同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了進(jìn)一步研究其長期療效和安全性的必要性，以及優(yōu)化藥物負(fù)載策略的潛在價(jià)值。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961224002485#sec3