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【研究背景】

在多發(fā)性硬化癥等脫髓鞘疾病中，慢性病變中的炎癥組織環(huán)境阻止了祖細(xì)胞的有效募集，導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞再生和髓鞘再生失敗。雖然將高髓鞘形成性胎兒或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來源的人類少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞 (hOPC) 進(jìn)行移植是一種有效的方法，但供體細(xì)胞的低存活率和OPC命運(yùn)維持率低是臨床治療的主要障礙?，F(xiàn)有的細(xì)胞注射方法由于剪切應(yīng)力導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，移植后存活率僅為1%至32%，并加劇了局部炎癥，從而增加移植物失敗的可能性。剪切稀化水凝膠 (STH) 被認(rèn)為是減少細(xì)胞死亡的有希望的候選材料。此類水凝膠在剪切應(yīng)力下流動，并在應(yīng)力消除后恢復(fù)，使其適合用于細(xì)胞注射。

針對上述問題，布法羅大學(xué)Stelios T. Andreadis的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種創(chuàng)新的注射性剪切稀化水凝膠（STHs）。這些水凝膠具有可調(diào)節(jié)的粘彈性和生物活性，通過最小侵入性注射，將hOPCs注射到先天性低髓鞘病的小鼠模型中。這種小鼠模型模擬了人類的先天性低髓鞘疾病，如Pelizaeus-Merzbacher病，已成為評估髓鞘化細(xì)胞制劑的金標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果表明，使用STHs顯著提高了移植后hOPCs的存活率，支持其分化為形成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞，并增加了小鼠大腦的髓鞘化程度，展示了STHs作為hOPCs輸送有效載體在治療髓鞘疾病中的潛力。相關(guān)研究在2024年7月12日以“Injectable shear-thinning hydrogels promote oligodendrocyte progenitor cell survival and remyelination in the central nervous system”為題發(fā)表于《Science Advances》（DOI: 10.1126/sciadv.adk9918）。

（1）超分子STH的合成與表征

水凝膠的構(gòu)建單元包括透明質(zhì)酸硫醇（HA-SH）、肝素硫醇（Hep-SH）、β-環(huán)糊精馬來酰亞胺（βCD-Mal）和8臂聚乙二醇金剛烷（PEG-Ad）。水凝膠的開發(fā)涉及兩個關(guān)鍵步驟。首先，通過8臂PEG-Ad與單功能化的βCD-Mal在1:1的化學(xué)計(jì)量比下形成宿主-客體復(fù)合物，工程化多臂馬來酰亞胺終止的超分子聚合物（SMP-Mal）。其次，在pH=7.4下，8臂SMP-Mal與HA-SH之間進(jìn)行Michael加成反應(yīng)，形成三維網(wǎng)絡(luò)（圖1）。為了固定生存信號（HBD-RGD5融合肽和血小板源性生長因子），Hep-SH與肝素結(jié)合雙域肽和/或血小板源性生長因子（PDGF-AA）預(yù)混，并在與SMP-Mal交聯(lián)前添加到HA-SH中。

圖1 STH設(shè)計(jì)的示意圖和水凝膠前體的¹H NMR表征

（2）水凝膠的剪切稀化和自我修復(fù)特性

STHs通過透明質(zhì)酸硫醇（HA-SH）和肝素硫醇（Hep-SH）與SMP-Mal在pH=7.4下通過Michael加成反應(yīng)形成。根據(jù)HA-SH和SMP-Mal的不同配比，制備了不同硬度的水凝膠（STH-1、STH-2和STH-3）。這些超分子水凝膠由于宿主-客體動態(tài)鍵的可逆性，表現(xiàn)出剪切稀化和自我修復(fù)特性，使其適合于治療物的注射。流變學(xué)測量顯示，STHs在高剪切率下表現(xiàn)出較低的粘度，說明主-客體鍵的解離和更流體化的行為。在低剪切率下，水凝膠迅速恢復(fù)初始粘度，顯示出自我修復(fù)特性。這種快速從固態(tài)到流體態(tài)的轉(zhuǎn)變對于成功注射和細(xì)胞保護(hù)至關(guān)重要，因?yàn)樗棺⑸溥^程中水凝膠能夠耗散能量，并在注射后恢復(fù)儲存模量以穩(wěn)定注射部位的材料（圖2）。

圖2 STH的粘彈性和流變性質(zhì)

（3）剪切應(yīng)力下STHs顯著提高h(yuǎn)OPCs的存活率

成功的細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病的一個主要障礙是供體細(xì)胞在微創(chuàng)注射時的低存活率。研究發(fā)現(xiàn)，超過95%的神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）在脊髓損傷（SCI）模型中移植后會死亡，這很可能是由于剪切應(yīng)力對細(xì)胞膜的作用。在研究中，通過細(xì)拉玻璃針（內(nèi)徑：100至200微米，相當(dāng)于28至32G針頭）注射時，測量了在有或沒有STHs的情況下細(xì)胞死亡率。結(jié)果表明，在鹽溶液中注射時，鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（CG-4細(xì)胞系）和人胎兒CD140a分選的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（hOPCs）的細(xì)胞死亡率分別為29.47± 3.15%和25.13±3.23%，而在無剪切應(yīng)力條件下分別僅為6.63±1.60%和6.57±0.71%。所有三種STH配方顯著降低了CG-4和hOPCs的細(xì)胞死亡率（圖3）。研究表明，STH-2在注射剪切應(yīng)力下對細(xì)胞死亡的保護(hù)效果最好。

圖3 注射 STH 后 hOPC 存活率的體外評估

（4）生物信號的評價促進(jìn)hOPCs的存活

研究團(tuán)隊(duì)假設(shè)STHs中固定的生物信號可能進(jìn)一步促進(jìn)移植后hOPCs的存活和增殖。無論是前體細(xì)胞還是成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞都高度表達(dá)αv/α6/α7和β1/β5/β8整合素，指導(dǎo)其存活、增殖和終末分化以髓鞘化神經(jīng)元軸突。通過RNA測序，研究團(tuán)隊(duì)確定了hOPCs中各種整合素的表達(dá)。設(shè)計(jì)了一種創(chuàng)新的雙域肽，肝素結(jié)合域（HBD）–RGD5，促進(jìn)細(xì)胞通過整合素α5β1、αvβ1或αvβ8結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HBD-RGD5顯著促進(jìn)了hOPCs的粘附和擴(kuò)展，相比對照組，細(xì)胞數(shù)量和增殖率顯著提高（圖4）。PDGF-AA通過血小板源性生長因子受體α促進(jìn)hOPCs的存活和增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDGF-AA以劑量依賴性方式顯著增加了hOPCs的增殖率。

圖4 hOPC 響應(yīng)生物信號而增殖

（5）STH內(nèi)hOPCs的存活、分化和遷移

研究團(tuán)隊(duì)評估了hOPCs在3D水凝膠環(huán)境中的存活情況。所有三種水凝膠都支持hOPCs的存活（細(xì)胞死亡率：STH-1：7.10±1.03%，STH-2：5.97±2.19%，STH-3：5.58±0.97%）。盡管總體存活率相似，但三種水凝膠中細(xì)胞的分布不同。STH-1和STH-3中的細(xì)胞聚集，而STH-2中的細(xì)胞分布更加均勻。在3D水凝膠中，STH-2和低硬度的STH-3支持hOPCs的分化，而STH-1則不支持。研究表明，STH-2在注射剪切應(yīng)力下對CG-4細(xì)胞和hOPCs提供了最高水平的保護(hù)，維持了更均勻的細(xì)胞分布，并支持少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化。為了研究移植后hOPCs的遷移，STH-2與不同濃度的HBD-RGD5結(jié)合，細(xì)胞通過水凝膠遷移，結(jié)果表明，HBD-RGD5固定的細(xì)胞遷移數(shù)量減少，表明細(xì)胞在3D水凝膠中的結(jié)合增加。

圖5 雙結(jié)構(gòu)域融合肽HBD-RGD5上hOPC的分化

（6）體內(nèi)移植中STH顯著提高h(yuǎn)OPCs的存活率

為了評估體內(nèi)移植后hOPCs的存活率，研究團(tuán)隊(duì)使用了免疫缺陷的NSG小鼠。通過細(xì)拉玻璃針將hOPCs單側(cè)注射到2-3天齡的小鼠大腦中。每只小鼠接受0.5微升細(xì)胞（每微升100,000個細(xì)胞），分別使用HBSS、單獨(dú)的STH-2或含PDGF-AA和HBD-RGD5的STH-2進(jìn)行注射。結(jié)果顯示，與對照組（HBSS）相比，嵌入水凝膠的細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P < 0.0001）。PDGF-AA和HBD-RGD5的固定進(jìn)一步增加了小鼠大腦中hNA+細(xì)胞的數(shù)量（圖6）。研究表明，注射后6周內(nèi)觀察到注射的細(xì)胞在前后軸上擴(kuò)散并遷移了近1500微米，表明遷移速度約為30微米/天。與對照組相比，注射STH-2與PDGF-AA和HBD-RGD5組的細(xì)胞存活率提高了52%（圖6）。

圖6 移植STH-2和固定化生物線索后，NSG小鼠腦中的hOPCs存活率提高

（7）通過STHs輸送hOPCs改善小鼠大腦的髓鞘化

研究團(tuán)隊(duì)評估了通過STHs移植的hOPCs在shiverer/rag2小鼠（先天性低髓鞘疾病模型）中的髓鞘化潛力。將hOPCs（0.5 μL，100,000個細(xì)胞/μL）雙側(cè)注射到新生小鼠的大腦胼胝體中。12周后，腦切片的免疫染色顯示，與HBSS對照組相比，STH-2組的小鼠大腦中髓鞘形成顯著增強(qiáng)。注射含有PDGF-AA和HBD-RGD5的STH-2進(jìn)一步增加了髓鞘形成區(qū)域，并顯著提高了移植的hOPCs的存活率（圖3）。

圖7 在輸送添加了生物信號的STH-2的hOPCs后，shiverer/rag2小鼠大腦的髓鞘形成增加

研究小結(jié)：

通過移植到先天性低髓鞘和銅質(zhì)酮誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠大腦中，hOPCs傾向于遷移到白質(zhì)通道中并沿其遷移，導(dǎo)致宿主軸突的強(qiáng)勁髓鞘化。這種遷移特性和髓鞘化潛力使hOPCs成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）脫髓鞘疾病的有前途的細(xì)胞治療候選者。然而，臨床轉(zhuǎn)化受到供體細(xì)胞低存活率和維持OPC命運(yùn)的主要障礙的限制。之前的研究報(bào)告指出，注射到鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞只有不到5%的存活率。在本研究中，研究人員假設(shè)在剪切應(yīng)力作用下經(jīng)歷動態(tài)凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變的STH可以在注射過程中保護(hù)hOPCs，并允許移植的hOPCs從注射部位有效遷移，以重新髓鞘化整個胼胝體。為此，該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種基于STH的細(xì)胞輸送系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以消散剪切應(yīng)力，并作為固定生存生物信號的平臺，以增強(qiáng)注射后的細(xì)胞活力，并隨之增加髓鞘化程度。研究結(jié)果表明，STHs在促進(jìn)細(xì)胞存活和髓鞘化方面表現(xiàn)出極大的潛力，有望成為治療多發(fā)性硬化癥等脫髓鞘疾病的新方法。

原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adk9918