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適應(yīng)性T細胞療法（ACT）是一種通過改造T細胞以表達腫瘤特異性受體（如T細胞受體TCR或嵌合抗原受體CAR）的免疫療法，已在臨床前和臨床研究中展示出顯著潛力。雖然在治療B細胞惡性腫瘤方面取得了高達90%的完全緩解率，但對大多數(shù)實體瘤的療效仍然有限。實體瘤的獨特結(jié)構(gòu)和特征構(gòu)成了限制效應(yīng)T細胞（Teff細胞）療效的主要障礙。實體瘤周圍的物理屏障會降低Teff細胞的浸潤，如T細胞從內(nèi)皮細胞外滲到腫瘤所需的粘附分子表達下調(diào)，以及細胞外基質(zhì)的異常沉積導(dǎo)致的致密和纖維化環(huán)境，均限制了T細胞的遷移。此外，大量存在的免疫抑制細胞類型（如調(diào)節(jié)性T細胞Treg）會顯著抑制Teff細胞，導(dǎo)致免疫耐受。因此，通過突破物理屏障促進Teff細胞浸潤，同時調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境（TME）以克服免疫抑制，有望增強T細胞療法治療實體瘤的效果。

針對上述問題，浙江大學(xué)顧臻、張宇琪、郭雨剛、俞計成團隊開發(fā)了一種表面修飾了趨化因子CCL22的溝槽微針（MN）貼片，以促進TCR T細胞或CAR T細胞向?qū)嶓w瘤的局部滲透，并將Treg細胞從腫瘤微環(huán)境（TME）中分流，從而增強抗腫瘤療效。該團隊利用冰模板法制備了由聚苯乙烯組成的凹槽微針貼片，表面形成開放的凹槽，為T細胞的裝載提供了足夠的空間。插入腫瘤后，體溫會觸發(fā)T細胞從微針中釋放，并浸潤到實體瘤中。先前的研究表明，凋亡的Treg細胞能有效抑制T細胞的活化，甚至比活的Treg細胞更有效。該團隊在微針上裝飾了CCL22，以轉(zhuǎn)移Treg細胞，而不是直接誘導(dǎo)其凋亡。作為趨化因子CCL22的受體，CCR4在Treg細胞中高表達，并調(diào)節(jié)其向TME的遷移。CCL22修飾的微針貼片能有效吸引Treg細胞，產(chǎn)生的CCL22梯度提高了CD8+ T細胞/Treg細胞的比例，從而增強抗腫瘤免疫力。這種由微針介導(dǎo)的T細胞免疫治療局部策略有可能增強各種ACT療法，并將其全身副作用降至最低。相關(guān)研究在2024年4月21日以“Grooved Microneedle Patch Augments Adoptive T Cell Therapy Against Solid Tumors via Diverting Regulatory T Cells”為題發(fā)表于《Advanced Materials》 （DOI: 10.1002/adma.202401667）上。

（1）凹槽微針貼片的示意設(shè)計圖和表征

MNs由10%聚苯乙烯溶液（溶劑：對二甲苯）制成，采用冰模板法，通過冷凍鑄造控制冰晶成核和生長，并通過固液相分離獲得有序凹槽結(jié)構(gòu)。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，這些納米顆粒表面具有多個開放且排列有序的凹槽，有助于提高藥物遞送的有效性。隨后，研究團隊通過在表面聚合多巴胺來修飾MNs，提高其親水性和可修飾性，有利于細胞負載和細胞因子修飾。水接觸角測量結(jié)果顯示，聚多巴胺修飾后MNs的潤濕性顯著增加。此外，微針貼片具有良好的組織穿透機械強度。免疫熒光成像顯示，輕輕按壓貼片即可使MN徹底破壞實體腫瘤的物理屏障。

圖1 凹槽微針貼片的示意設(shè)計圖和表征

（2）CCL22修飾的MNs介導(dǎo)Treg細胞遷移

研究人員使用體外Transwell遷移試驗評估了CCL22修飾的微針（MNs-CCL22）對Treg細胞遷移的能力。流式細胞術(shù)（FACS）分析結(jié)果顯示，經(jīng)MNs-CCL22處理的活細胞中，Treg細胞（CD3+CD4+CD25+CD127-）數(shù)量在24小時后顯著減少（1.15±0.26%），相比于未經(jīng)修飾的MNs組（2.17±0.29%），而CD8+ T細胞數(shù)量差異不顯著。MNs-CCL22組的Treg/CD8+ T細胞比例（4.76±0.51%）顯著低于MNs組（11.53±1.74%），這對于增強抗腫瘤免疫力至關(guān)重要。在體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移能力實驗中，不同修飾比例的MNs-CCL22也顯著抑制了腫瘤生長，進一步證明了通過募集Treg細胞所做的貢獻。

圖2 CCL22修飾的MN介導(dǎo)Treg細胞遷移

（3）T細胞的局部遞送和控釋

除了充當(dāng)招募免疫抑制性Treg細胞的陷阱外，凹槽微針（MN）還可作為細胞遞送裝置，將T細胞局部輸送到實體腫瘤中。為了進行體外研究，研究人員從OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠中分離出CD8+ T細胞，并通過在真空條件下將微針浸入高濃度T細胞的培養(yǎng)基中，將T細胞加載到微針中。此外，還研究了T細胞在37oC下的釋放行為。結(jié)果表明，微針貼片可以有效地將T細胞局部送入實體瘤。聚多巴胺改性的微針提高了T細胞的裝載效率，并通過熱響應(yīng)性明膠凝膠實現(xiàn)T細胞的控釋。

圖3 使用微針貼片進行T細胞的體內(nèi)輸送和分布

（4）凹槽MN貼片增強TCR T細胞治療

為了驗證上述微針（MNs）在TCR T細胞療法中的抗腫瘤效果，研究人員利用小鼠黑色素瘤模型進行了體內(nèi)實驗。結(jié)果顯示，裸露微針貼片治療組的小鼠腫瘤生長與未治療組相似，而MNs-CCL22或TCRT@MNs治療組顯示出中等抗腫瘤效果。當(dāng)用TCRT@MNs-CCL22治療時，腫瘤生長顯著抑制，40%的小鼠存活至少60天，而未治療組和MNs治療組的小鼠無一存活。H&E染色圖像顯示，治療組的細胞核收縮和減少，尤其在裝載TCR T細胞的MNs-CCL22組中，MNs的變化可以忽略不計。TUNEL測定法進一步揭示該組中凋亡信號最多，TUNEL陽性細胞為95.17±0.25%，證實了凋亡介導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷機制。免疫熒光結(jié)果表明，MNs-CCL22具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強細胞毒性T細胞的抗腫瘤免疫力。

圖4 微針介導(dǎo)的T細胞療法在小鼠黑色素瘤模型中的治療效果評價

（5）凹槽MN貼片增強CAR - T細胞治療

研究人員還探索了微針貼片對CAR T細胞療法的增強效果。通過使用靶向黑色素瘤相關(guān)抗原的CAR T細胞，研究人員發(fā)現(xiàn)，與未處理的對照組相比，經(jīng)微針貼片處理的小鼠腫瘤生長得到了有效控制，生存時間延長。此外，微針貼片制劑進行局部治療不僅能消除局部實體瘤，還能誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫記憶。

圖5 微針治療后Teff/Treg比例和抗腫瘤反應(yīng)的分析

（6）Treg細胞轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的免疫治療機制研究

為了證實Treg細胞轉(zhuǎn)移在CAR-T細胞治療增強中的關(guān)鍵作用，研究人員使用Treg細胞缺失的小鼠進一步評估了CAR T@MNs-CCL22微針的抗腫瘤功效。外周血樣本的FACS分析結(jié)果顯示，CD25抗體處理可誘導(dǎo)Treg耗損(CD3+CD4+CD25+ T細胞)為0.62±0.14%，而未處理的小鼠為7.94±1.14%。用CAR T@MNs和CAR T@MNs-CCL22制劑處理的小鼠具有相似的腫瘤生長特征和生存時間，進一步證實了用MNs-CCL22轉(zhuǎn)移Treg細胞以增強ACT的重要性。此外，各組在治療期間體重變化無顯著差異。

圖6 微針介導(dǎo)的CAR T細胞分散接種增強實體瘤的抗癌功效

小結(jié)：

針對T細胞浸潤不足和免疫抑制微環(huán)境的問題，該團隊設(shè)計了一種帶凹槽的微針（MN）貼片，能夠?qū)細胞局部輸送到腫瘤部位，并選擇性地將Treg細胞轉(zhuǎn)移到微針上。與化療或單克隆抗體治療相比，這種帶凹槽的MN貼片作為局部微環(huán)境，不僅能增強效應(yīng)T細胞（Teff細胞）在實體瘤中的浸潤，還能通過非凋亡途徑消除Treg細胞。該裝置的制備采用了基于相分離過程的冰模板法，形成垂直通道，用于細胞遞送或細胞轉(zhuǎn)運。此外，團隊選擇了模型趨化因子CCL22，通過溫和的化學(xué)偶聯(lián)錨定在微針上，以招募遠離腫瘤微環(huán)境（TME）的Treg細胞，將微針貼片從體內(nèi)取出即可清除TME中的Treg細胞。在小鼠黑色素瘤模型中，這些改良的MN貼片展示了在增強TCR T細胞和CAR T細胞療法方面的治療潛力。在小鼠體內(nèi)清除Treg細胞后，雖然未提高CAR-T細胞療法的效果，但這進一步證明了Treg細胞遷移可增強抗腫瘤效果。這種策略還可用于增強細胞或藥物制劑的輸送，以治療各種疾病，如自身免疫性疾病。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adma.202401667