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針對(duì)上述問(wèn)題，香港大學(xué)汪衛(wèi)平教授團(tuán)隊(duì)提設(shè)計(jì)了一種光敏型脂質(zhì)納米顆粒（LNP）制劑，用于聯(lián)合遞送FSP1 siRNA與光敏劑，以實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌免疫治療的協(xié)同效應(yīng)（圖1），維替泊芬與脂質(zhì)成分共組裝形成具有高siRNA載藥能力的LNP。通過(guò)引入陽(yáng)離子輔助脂質(zhì)DOTAP對(duì)表面特性進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)一步優(yōu)化了負(fù)載維替泊芬的光敏型LNP，從而提升其在結(jié)腸癌細(xì)胞中的siRNA轉(zhuǎn)染效率。光敏脂質(zhì)納米顆粒（FSP1/LNPs）通過(guò)沉默F(xiàn)SP1基因并產(chǎn)生活性氧（ROS），在結(jié)腸癌細(xì)胞中引發(fā)協(xié)同性鐵死亡效應(yīng)。這種機(jī)制進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫細(xì)胞死亡（ICD）和腫瘤抗原釋放，從而促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）成熟及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活化。該研究證實(shí)FSP1基因沉默與光動(dòng)力療法（PDT）在結(jié)腸癌細(xì)胞中具有顯著協(xié)同效應(yīng)，為光敏脂質(zhì)納米顆粒在癌癥治療中的臨床轉(zhuǎn)化開(kāi)辟了新途徑。該文章于2025年7月15日以《Living therapeutics of nonpathogenic bacteria as biosynthesis factory and active carriers for enhancing tumor-targeted therapy》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.5c06115）。

圖1. FSP1/LNPs的生物合成和抗腫瘤治療示意圖

（1）光敏脂質(zhì)納米粒子的篩選與優(yōu)化

為了制備光敏脂質(zhì)納米粒子（LNPs），將不同光響應(yīng)小分子（如卟啉、吲哚菁、BODIPY）以5mol%或10mol%的摩爾比摻入LNP配方（圖2A、B）。DLS結(jié)果顯示，這些分子可成功摻入LNPs，尺寸為125-175nm，PDI小于0.3（圖2D）。瓊脂糖凝膠電泳表明，僅卟啉類(lèi)分子（如Ce6、Verteporfin、Hemin）能與脂質(zhì)共組裝且不影響siRNA包載（圖2C）。最終，具有NIR光響應(yīng)性的FDA批準(zhǔn)光敏劑Verteporfin被選為制備光敏LNPs的材料，其摩爾比為5mol%。，陽(yáng)離子脂質(zhì)DOTAP能顯著提高LNPs的細(xì)胞內(nèi)化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸能力。CT26細(xì)胞與含0或5mol% DOTAP的光敏LNPs孵育，CLSM成像顯示，5mol% DOTAP組的siRNA與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)共定位水平低于0mol%組（圖2I）。因此，選擇了5mol% DOTAP和5mol% DSPC作為輔助脂質(zhì)，以?xún)?yōu)化LNP配方。鑒于MC3 LNPs在某些癌細(xì)胞中siRNA轉(zhuǎn)染效率有限，通過(guò)調(diào)節(jié)光敏LNPs的表面性質(zhì)，以?xún)?yōu)化其在結(jié)腸癌細(xì)胞中的siRNA遞送效率。隨著DOTAP摩爾比從0增加到10mol%，LNPs的尺寸從130nm增加到190nm，PDI略有下降（圖2E），Zeta電位從-16.2mV增加到3.5mV（圖2F）。5mol% DOTAP的LNPs在1小時(shí)和4小時(shí)后的細(xì)胞攝取水平分別比不含DOTAP的LNPs高出2.54倍和2.06倍（圖2H）。因此，選擇了5mol% DOTAP和5mol% DSPC作為輔助脂質(zhì)。

圖2.光敏型脂質(zhì)納米顆粒（LNP）制劑的篩選與優(yōu)化。(A)含有不同卟啉類(lèi)、吲哚菁類(lèi)或BODIPY基光響應(yīng)分子的溶液示意圖，分別采用高和低摩爾比配制。(B)不同卟啉類(lèi)、吲哚菁類(lèi)或BODIPY基光響應(yīng)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。(C)含10 mol %光響應(yīng)分子的siRNA負(fù)載型光敏LNP制劑瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。(D)含10 mol %光響應(yīng)分子的光敏LNP制劑粒徑與PDI值對(duì)比。(E)不同DOTAP摩爾比負(fù)載維替泊芬的光敏LNP粒徑與PDI值對(duì)比。(F)不同DOTAP摩爾比下負(fù)載維替泊芬的光敏脂質(zhì)納米顆粒（Zeta電位值，n=3）。(G)細(xì)胞孵育4小時(shí)后的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果。(H) CT26細(xì)胞經(jīng)不同DOTAP摩爾比負(fù)載維替泊芬的光敏脂質(zhì)納米顆粒在1或4小時(shí)后的細(xì)胞內(nèi)化水平。(I)不含DOTAP與含5 mol %DOTAP的光敏脂質(zhì)納米顆粒的內(nèi)體逃逸能力對(duì)比

（2）FSP1/LNPs的制備與表征

為了制備FSP1/LNPs，將FSP1 siRNA包裹在設(shè)計(jì)好的光敏LNPs中。FSP1/LNPs的尺寸為145.43±2.55nm，PDI值為0.11±0.05，表明制備后具有良好的尺寸分布（圖3A）。透射電子顯微鏡（TEM）成像顯示，納米粒子呈球形且分散良好，與尺寸分布結(jié)果一致。測(cè)量得到的Zeta電位為-2.75±0.51mV，負(fù)表面電荷可能有助于靜脈注射后延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間（圖3B）。此外，納米粒子在磷酸鹽緩沖液（PBS）或胎牛血清（FBS）中在生理?xiàng)l件下至少可穩(wěn)定96小時(shí)，尺寸約為150nm（圖3C）。為了研究合適的N/P比，進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明，當(dāng)N/P比超過(guò)3時(shí)，納米粒子展現(xiàn)出良好的siRNA包載能力（圖3D）。UV-vis吸收光譜分析表明，F(xiàn)SP1/LNPs在254nm（FSP1 siRNA的峰值）以及420和690nm（Verteporfin的峰值）處展現(xiàn)出顯著的吸收峰，表明成功包裹了這兩種藥物分子（圖3E）。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，CT26細(xì)胞在經(jīng)過(guò)不同濃度的Verteporfin和FSP1 siRNA處理后，其細(xì)胞活性在光照條件下顯著降低（圖3F）。通過(guò)SynergyFinder在線平臺(tái)計(jì)算得出的協(xié)同分?jǐn)?shù)表明，F(xiàn)SP1基因沉默和光動(dòng)力療法（PDT）之間存在顯著的協(xié)同效應(yīng)（圖3G）。這表明，F(xiàn)SP1 siRNA和Verteporfin可以被成功包載到工程化的LNP配方中，并且FSP1基因沉默與PDT在結(jié)腸癌細(xì)胞中具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。

圖3. FSP1/LNPs的制備與表征。(A) FSP1/LNPs粒徑分布及透射電鏡圖像（比例尺：200 nm)。(B)FSP1/LNPs的Zeta電位。(C) FSP1/LNPs在37°C PBS溶液中穩(wěn)定性測(cè)試（96小時(shí)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n = 3)。(D)不同N/P比的FSP1/LNPs瓊脂糖凝膠電泳分析。(E)FSP1 siRNA、Verteporfin及FSP1/LNPs的UV?vis吸收光譜。(F)CT26細(xì)胞經(jīng)Verteporfin和FSP1 siRNA處理后光照存活率。(G) CT26細(xì)胞經(jīng)光照處理后Verteporfin與FSP1 siRNA的協(xié)同效應(yīng)評(píng)分。(H)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示游離siRNA、Lipo3000-siRNA復(fù)合物及光敏脂質(zhì)納米顆粒的細(xì)胞攝取水平（n = 3）。(I) CT26細(xì)胞經(jīng)不同內(nèi)吞抑制劑處理后FSP1/LNPs的細(xì)胞內(nèi)化水平（n = 3）

（3）FSP1/LNP的細(xì)胞毒性和FSP1基因沉默效應(yīng)

由于FSP1 siRNA和Verteporfin已成功包裹進(jìn)光敏脂質(zhì)納米粒子（LNPs）中，接下來(lái)研究了它們?cè)诮Y(jié)腸癌細(xì)胞中的內(nèi)化行為。與Lipofectamine 3000（Lipo3000）相比，納米粒子在將siRNA遞送至CT26細(xì)胞方面表現(xiàn)出略微更好的轉(zhuǎn)染能力（圖3H）。同時(shí)，F(xiàn)SP1/LNPs也能促進(jìn)Verteporfin的細(xì)胞內(nèi)遞送，表明其能夠共同遞送疏水性藥物分子和基因治療藥物用于癌癥治療（圖S8）。為了探索光敏LNPs的內(nèi)吞途徑，CT26細(xì)胞在FSP1/LNPs處理前預(yù)先用各種內(nèi)吞抑制劑處理。結(jié)果表明，M-β-CD、氯丙嗪和基因斯坦能顯著降低細(xì)胞攝取水平，表明FSP1/LNPs主要通過(guò)脂筏、網(wǎng)格蛋白和洞穴體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞（圖3I）。為了探索納米粒子的抗腫瘤性能，CT26細(xì)胞暴露于FSP1/LNPs或陰性對(duì)照siRNA包裹的光敏LNPs（NC/LNPs）中，有或沒(méi)有光照。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與不同濃度的對(duì)照組相比，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖（圖4A）。此外，結(jié)果表明，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組能促進(jìn)乳酸脫氫酶（LDH）釋放，表明該處理破壞了CT26細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性，并誘導(dǎo)了細(xì)胞膜孔的形成（圖4B）。

為了確定結(jié)腸癌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激情況，采用DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，NC/LNPs（+）和FSP1/LNPs（-）組均能增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，這可能分別源于PDT效應(yīng)和FSP1抑制誘導(dǎo)的鐵死亡（圖4C）。特別是，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組與其它組相比展現(xiàn)出最高的ROS生成水平，表明PDT與鐵死亡之間的協(xié)同作用增強(qiáng)了氧化應(yīng)激。此外，F(xiàn)SP1/LNPs能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，在NIR光照射后，與NC/LNPs（+）組相比，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組的晚期凋亡水平高出1.71倍（圖4D、E）。此外，活死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)也顯示出類(lèi)似的趨勢(shì)，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組的細(xì)胞死亡水平最高（圖4F）。為了探索FSP1基因沉默效果，qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SP1/LNPs能顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞中FSP1 mRNA表達(dá)水平（圖4G）。此外，Western blot實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組的FSP1蛋白表達(dá)水平降低了57%（圖4H）。這些結(jié)果驗(yàn)證了FSP1/LNPs在結(jié)腸癌細(xì)胞中有效沉默F(xiàn)SP1基因的能力。鑒于FSP1在保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡中的關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平的降低可能會(huì)破壞這種平衡，并進(jìn)一步促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡?？傊現(xiàn)SP1 siRNA和Verteporfin可以借助光敏LNP配方高效共遞送至CT26細(xì)胞中，以降低FSP1基因表達(dá)，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖4. FSP1脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性及FSP1基因沉默效果。(A) CT26細(xì)胞經(jīng)不同制劑處理后的存活率。(B)經(jīng)不同處理的CT26細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）釋放量。(C)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CT26細(xì)胞活性氧生成。(D)不同制劑處理的CT26細(xì)胞凋亡水平。(E)凋亡程度定量分析。(F)不同處理組CT26細(xì)胞活死染色結(jié)果。(G)不同處理后CT26細(xì)胞FSP1 mRNA表達(dá)水平。(H)不同處理后CT26細(xì)胞FSP1與GAPDH表達(dá)水平的Western blot檢測(cè)

（4）FSP1/LNP引起的鐵死亡和氧化損傷

由于光敏脂質(zhì)納米粒子（LNPs）能夠促進(jìn)活性氧（ROS）的生成并實(shí)現(xiàn)FSP1基因沉默，接下來(lái)研究了它們?cè)诮Y(jié)腸癌細(xì)胞中引起的鐵死亡和氧化損傷。首先，通過(guò)BODIPY-C11探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平，該探針在正常情況下呈現(xiàn)紅色熒光，與脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)后會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒光。共聚焦成像結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NC/LNPs（+）和FSP1/LNPs（?）組顯示出更高的綠色熒光，表明光動(dòng)力療法（PDT）和FSP1基因沉默均能觸發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化（圖5A）。然而，經(jīng)過(guò)光照處理的FSP1/LNPs組展現(xiàn)出更強(qiáng)的組合效應(yīng)，其脂質(zhì)過(guò)氧化水平顯著高于其他組（圖5B）。FSP1是保護(hù)癌細(xì)胞免受鐵死亡的關(guān)鍵蛋白，通過(guò)將輔酶Q10（CoQ10）轉(zhuǎn)化為泛醇（CoQ10H2）發(fā)揮作用。因此，采用ELISA試劑盒測(cè)定了細(xì)胞內(nèi)CoQ10含量，結(jié)果表明，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組顯著提高了CoQ10水平，這表明經(jīng)過(guò)納米粒子和光照處理后，F(xiàn)SP1蛋白的生物活性降低（圖5C）。為了證實(shí)鐵死亡的成功誘導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑如谷胱甘肽（GSH）保護(hù)癌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和鐵死亡的影響。采用檢測(cè)試劑盒測(cè)定了細(xì)胞內(nèi)GSH水平，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)光照處理的兩種LNPs均能降低GSH水平，這可能是由于光動(dòng)力療法產(chǎn)生的ROS以及隨后的氧化損傷導(dǎo)致GSH消耗（圖5D）。通過(guò)利用光動(dòng)力療法產(chǎn)生ROS并清除還原劑，可能使FSP1 siRNA誘導(dǎo)的鐵死亡更加敏感，并增強(qiáng)下游的氧化損傷。

據(jù)報(bào)道，鐵死亡會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累，這些過(guò)氧化物可能會(huì)影響細(xì)胞器膜中的脂質(zhì)，并擴(kuò)散到細(xì)胞核中與DNA形成加合物，從而導(dǎo)致細(xì)胞器和細(xì)胞核損傷。因此，首先采用γ-H2AX免疫熒光實(shí)驗(yàn)評(píng)估核損傷水平。共聚焦成像結(jié)果顯示，與FSP1/LNPs（+）組相比，其他組的綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明經(jīng)過(guò)光照處理的FSP1/LNPs組顯著增強(qiáng)了γ-H2AX水平（圖5E、F）。此外，DAPI染色顯示，F(xiàn)SP1/LNPs處理會(huì)影響細(xì)胞核形態(tài)，使其變得圓潤(rùn)且萎縮。這些結(jié)果共同表明，DNA雙鏈斷裂和細(xì)胞核損傷嚴(yán)重。除了DNA氧化損傷外，線粒體功能也可能因脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累而受到損害。采用JC-1實(shí)驗(yàn)評(píng)估FSP1/LNPs對(duì)線粒體膜電位的影響。在正常線粒體中，JC-1形成聚合物并呈現(xiàn)紅色熒光，而在受損線粒體中，它會(huì)變成單體并呈現(xiàn)綠色熒光。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，NC/LNPs（+）和FSP1/LNPs（?）組均能降低線粒體膜電位并導(dǎo)致線粒體功能障礙，其紅綠比值較低（圖S11）。重要的是，經(jīng)過(guò)光照處理的FSP1/LNPs組顯示出鐵死亡和光動(dòng)力療法對(duì)線粒體損傷的協(xié)同效應(yīng)（圖5G）。此外，采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察經(jīng)過(guò)FSP1/LNPs和光照處理后的CT26細(xì)胞的線粒體形態(tài)。成像結(jié)果顯示，F(xiàn)SP1/LNPs誘導(dǎo)線粒體嵴結(jié)構(gòu)喪失并導(dǎo)致線粒體碎裂（圖5H）。由于線粒體在能量產(chǎn)生和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，線粒體損傷可能會(huì)進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激并促進(jìn)促凋亡因子的釋放。

圖5. 鐵死亡與FSP1/LNPs引發(fā)的氧化損傷。(A)共聚焦激光掃描顯微鏡圖像顯示不同處理?xiàng)l件下CT26細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化水平。(B) BODIPY-C11綠色熒光定量分析顯示氧化損傷程度。(C)不同制劑處理CT26細(xì)胞后的細(xì)胞內(nèi)輔酶Q10水平。(D) CT26細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平。(E)共聚焦顯微鏡圖像顯示CT26細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)水平。(F) γ-H2AX水平定量分析。(G) JC-1單體標(biāo)記的CT26細(xì)胞比例。(H)正常細(xì)胞與FSP1/LNPs（+）處理組CT26細(xì)胞的橫截面透射電鏡圖像。(I) NC siRNA與FSP1 siRNA處理對(duì)NIH 3T3細(xì)胞活力的影響評(píng)估。(J)使用NC siRNA或FSP1 siRNA處理后對(duì)CT26細(xì)胞活力的評(píng)估。(K)未進(jìn)行光照射時(shí)對(duì)NC/LNPs和FSP1/LNPs孵育的NIH 3T3細(xì)胞活力的評(píng)估

（5）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析

為了探究FSP1基因沉默和光動(dòng)力療法（PDT）對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的聯(lián)合效應(yīng)，對(duì)正?；蚪?jīng)FSP1/LNPs處理的CT26細(xì)胞的總RNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。在分析的56,691個(gè)基因中，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組有1,290個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，1,437個(gè)基因表達(dá)上調(diào)（圖6A）?；蚣患治觯℅SEA）顯示，差異表達(dá)基因（DEGs）在脂質(zhì)代謝（脂質(zhì)過(guò)氧化）、DNA損傷、表觀遺傳調(diào)控（細(xì)胞核損傷）和p53信號(hào)通路（促凋亡效應(yīng)）中顯著富集（圖S12）。此外，基因本體（GO）富集分析顯示，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組對(duì)DNA結(jié)合、細(xì)胞器膜、粘附和遷移、細(xì)胞增殖以及膽固醇穩(wěn)態(tài)等生化途徑產(chǎn)生了顯著影響（圖S13）。此外，京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）分析表明，膽固醇代謝、IL-17、凋亡和PI3K-Akt等信號(hào)通路在FSP1/LNPs處理后受到顯著影響。這些通路涉及結(jié)腸癌細(xì)胞中的脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞氧化還原平衡和細(xì)胞增殖。具體到差異表達(dá)基因，Egr1、Txnip、Btg2和Rnd1基因在鐵穩(wěn)態(tài)、氧化還原平衡和抗氧化防御中起關(guān)鍵作用，這些基因在FSP1/LNPs（+）處理后顯著上調(diào)（圖6B）。相反，Cp、Scd1和Sema5a基因可能促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化物的清除并降低對(duì)鐵死亡的敏感性，這些基因在FSP1/LNPs（+）處理后顯著下調(diào)。此外，Gadd45g基因的上調(diào)表達(dá)與DNA損傷調(diào)控相關(guān)，表明FSP1/LNPs處理后細(xì)胞核損傷顯著。Rhbdd1基因的下調(diào)表達(dá)表明線粒體功能障礙和促存活信號(hào)通路的中斷。最后，四個(gè)與遷移相關(guān)的基因，包括Nrp2、Grem1、Fn1和Slit3，在FSP1/LNPs（+）處理后顯著下調(diào)，表明FSP1/LNPs可能抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移并降低侵襲性。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析表明，F(xiàn)SP1/LNPs在光照條件下能夠影響與鐵死亡和氧化應(yīng)激相關(guān)的基因表達(dá)，從而促進(jìn)FSP1基因沉默和PDT的協(xié)同效應(yīng)。

（6）免疫原性細(xì)胞死亡與樹(shù)突狀細(xì)胞成熟

為了探索抗腫瘤免疫反應(yīng)，通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高遷移率族蛋白1（HMGB1）和鈣網(wǎng)蛋白（CRT）的細(xì)胞內(nèi)水平。成像結(jié)果顯示，與FSP1/LNPs（+）組相比，其他組的細(xì)胞核中HMGB1水平顯著降低，熒光強(qiáng)度最低（圖6C、D）。從CT26細(xì)胞中釋放的HMGB1可能作為危險(xiǎn)信號(hào)以刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，在光照條件下，CRT在FSP1/LNPs組的細(xì)胞膜上的表達(dá)顯著上調(diào)，明顯高于NC/LNPs（+）和FSP1/LNPs（-）組，表明ROS產(chǎn)生和FSP1抑制的協(xié)同作用（圖6E、F）。CRT的暴露可能作為免疫原性信號(hào)，促進(jìn)免疫細(xì)胞吞噬垂死的癌細(xì)胞，從而增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）的成熟。三磷酸腺苷（ATP）是另一種DAMP信號(hào)，除了HMGB1和CRT之外。通過(guò)熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定經(jīng)各種處理后的細(xì)胞內(nèi)ATP水平。如圖6I所示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SP1/LNPs加光照處理使細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低了40%。將骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDCs）暴露于經(jīng)處理的CT26細(xì)胞的上清液中。流式細(xì)胞儀分析顯示，F(xiàn)SP1/LNPs（+）處理顯著增加了共刺激標(biāo)記物CD80和CD86的表達(dá)（圖6G）。此外，成熟DCs的CD80+CD86+雙陽(yáng)性細(xì)胞群從對(duì)照組的22.37%增加到FSP1/LNPs（+）組的52.93%（圖6H）。據(jù)報(bào)道，成熟DCs上的CD80和CD86能夠增強(qiáng)它們刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的能力，并促進(jìn)適應(yīng)性免疫活性?；谏鲜鼋Y(jié)果，推測(cè)FSP1/LNPs具有在NIR光照條件下促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、DAMPs釋放和DC成熟的潛力，以重塑免疫抑制性微環(huán)境并激發(fā)強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖6. FSP1/脂質(zhì)納米顆粒對(duì)免疫細(xì)胞樣漿細(xì)胞（ICD）和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）成熟的影響。(A)火山圖展示正常CT26細(xì)胞與經(jīng)FSP1/脂質(zhì)納米顆粒（+）處理的CT26細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因（DEGs）。(B)熱圖呈現(xiàn)正常細(xì)胞與FSP1/脂質(zhì)納米顆粒（+）處理細(xì)胞間的差異表達(dá)基因。(C)共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像顯示CT26細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)。(D) HMGB1表達(dá)定量分析結(jié)果。(E) CLSM圖像展示CT26細(xì)胞中環(huán)狀轉(zhuǎn)錄因子（CRT）表達(dá)。(F) CRT表達(dá)定量分析結(jié)果。(G)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CT26上清液培養(yǎng)后骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDCs）成熟情況。(H)成熟CD80+ CD86+ BMDCs數(shù)量統(tǒng)計(jì)。(I) CT26細(xì)胞內(nèi)ATP水平的評(píng)估

（7）活體成像和抑制腫瘤生長(zhǎng)

為探究光敏脂質(zhì)納米粒子（LNPs）的生物分布與抗腫瘤生長(zhǎng)效果，通過(guò)構(gòu)建了CT26腫瘤的BALB/c小鼠模型。經(jīng)尾靜脈注射后，通過(guò)活體成像系統(tǒng)（IVIS）在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)游離光敏劑與FSP1/LNPs的生物分布。結(jié)果顯示，F(xiàn)SP1/LNPs組腫瘤積累水平高于游離藥物組，約4小時(shí)達(dá)到峰值（圖7A）。小鼠于24小時(shí)后處死，收集腫瘤及主要器官進(jìn)行IVIS成像。結(jié)果表明，納米粒子主要在腫瘤和肝臟中積累，與之前關(guān)于LNPs分布的報(bào)道一致（圖7B）。定量分析顯示，納米粒子的腫瘤內(nèi)熒光強(qiáng)度是游離藥物的1.75倍，這可能歸因于更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間、優(yōu)化的表面性質(zhì)以及增強(qiáng)的滲透與滯留（EPR）效應(yīng)（圖7C）。這些數(shù)據(jù)表明，工程化的LNP配方在靜脈給藥后具有高效將藥物分子輸送至腫瘤組織的能力。因此，在腫瘤部位進(jìn)行NIR光照時(shí)，光敏LNPs將觸發(fā)氧化損傷和鐵死亡，以協(xié)同抑制腫瘤進(jìn)展。

隨后，在小鼠腫瘤模型中測(cè)試了FSP1/LNPs的治療效果。小鼠隨機(jī)分為五組，分別接受指定治療（圖7D）。12天時(shí)收集腫瘤并拍照（圖7E）。腫瘤體積曲線顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SP1/LNPs（-）和NC/LNPs（+）組均能抑制腫瘤生長(zhǎng)，表明FSP1基因沉默和ROS生成對(duì)結(jié)腸癌治療具有潛在療效（圖7F）。然而，F(xiàn)SP1/LNPs加激光照射組展現(xiàn)出FSP1 siRNA和Verteporfin的協(xié)同效應(yīng)，具有最低的腫瘤重量和最佳的抗腫瘤效果（圖7G）。此外，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組的腫瘤壞死和凋亡水平升高，這通過(guò)H&E和TUNEL分析得以證實(shí)（圖7I）。為評(píng)估生物安全性，研究者測(cè)量了小鼠的體重，結(jié)果顯示各治療組間無(wú)顯著變化（圖7H）。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)SP1/LNPs聯(lián)合NIR激光照射能有效誘導(dǎo)鐵死亡和氧化損傷，抑制腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)具有良好的生物相容性和最小的副作用。

圖7. FSP1/脂質(zhì)納米顆粒的生物分布與腫瘤生長(zhǎng)抑制效果。(A)游離維替泊芬與FSP1/脂質(zhì)納米顆粒的生物分布特征評(píng)估。(B)治療后24小時(shí)腫瘤及器官的熒光成像。(C)器官與腫瘤熒光信號(hào)定量分析。(D)通過(guò)光敏脂質(zhì)納米顆粒協(xié)同F(xiàn)SP1基因沉默與活性氧（ROS）生成抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療方案。(E)第12天治療小鼠腫瘤影像。(F)不同治療組腫瘤體積評(píng)估。(G)各組第12天腫瘤重量對(duì)比。(H)小鼠在12天內(nèi)的體重變化。(I)通過(guò)蘇木精-伊紅染色、TUNEL檢測(cè)和CRT免疫熒光成像分析的腫瘤組織切片

（8）抗癌免疫反應(yīng)的評(píng)價(jià)

鑒于光敏脂質(zhì)納米粒子（LNPs）能夠誘導(dǎo)鐵死亡和氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）和樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）成熟，研究者假設(shè)這種治療效果可能通過(guò)重塑免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，在體內(nèi)發(fā)揮結(jié)腸癌免疫治療的作用。通過(guò)免疫熒光分析腫瘤組織切片發(fā)現(xiàn)，激光照射后的光動(dòng)力療法（PDT）效應(yīng)顯著增強(qiáng)了NC/LNPs（+）組的CRT表達(dá)水平，而FSP1/LNPs（+）組則展現(xiàn)出更強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)（圖8F）。已知釋放的損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）對(duì)于刺激對(duì)癌細(xì)胞的免疫攻擊至關(guān)重要。因此，研究者分離了腫瘤引流淋巴結(jié)，以探究其免疫活性。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，CD45+MHC-II+CD11c+組中成熟DCs的比例從對(duì)照組的10.51%增加到NC/LNPs（+）組的19.82%，進(jìn)一步增加到FSP1/LNPs（+）組的24.57%（圖8A、B）。由于成熟的DCs更有效地將腫瘤抗原呈遞給T細(xì)胞，研究者推測(cè)FSP1/LNPs聯(lián)合光照能夠顯著促進(jìn)DC成熟，從而促進(jìn)T細(xì)胞激活和分化，實(shí)現(xiàn)有效的免疫治療。

為探索光敏LNPs治療后的系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)，研究者構(gòu)建了CT26雙側(cè)腫瘤模型。經(jīng)系統(tǒng)給藥后，僅在右側(cè)腹側(cè)的原發(fā)部位進(jìn)行光照。遠(yuǎn)處腫瘤組織可以模擬結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，以評(píng)估LNPs引發(fā)的系統(tǒng)性免疫激活。在14天的觀察期內(nèi)，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組顯著抑制了原發(fā)和遠(yuǎn)處腫瘤組織的進(jìn)展（圖8D、E）。14天時(shí)收集并成像腫瘤（圖8F、G）。結(jié)果顯示，F(xiàn)SP1/LNPs（+）組的腫瘤抑制效果最佳，腫瘤重量最小，這與上述發(fā)現(xiàn)一致（圖8H）。值得注意的是，F(xiàn)SP1/LNPs在遠(yuǎn)處腫瘤組織中也顯示出顯著的抑制效果，表明治療后系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)增強(qiáng)（圖8I）。

為闡明介導(dǎo)系統(tǒng)性抗腫瘤免疫的潛在機(jī)制，研究者首先測(cè)量了原發(fā)腫瘤微環(huán)境中免疫抑制T細(xì)胞的比例。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NC/LNPs（+）組降低了CD45+CD3+CD4+組中FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，從13.45%降至6.6%。而FSP1/LNPs（+）組進(jìn)一步將其降低至2.6%，表明FSP1基因沉默和ROS生成的協(xié)同作用能夠重塑免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（圖8J、L）。此外，對(duì)脾細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析顯示，與NC/LNPs處理相比，F(xiàn)SP1/LNPs（+）處理使CD3+CD8+組中效應(yīng)記憶T細(xì)胞（CD44+CD62L?）的比例從9.98%增加到38.74%（圖8K、M）。效應(yīng)記憶T細(xì)胞在抗原識(shí)別后能夠迅速產(chǎn)生細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性分子，對(duì)腫瘤免疫反應(yīng)至關(guān)重要，可防止轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。最后，還通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了原發(fā)和遠(yuǎn)處腫瘤中腫瘤浸潤(rùn)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的激活狀態(tài)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SP1/LNPs（+）處理顯著增加了原發(fā)和遠(yuǎn)處腫瘤中CD45+CD3+組內(nèi)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的比例（圖8N、O）。由于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別并直接殺死癌細(xì)胞，F(xiàn)SP1/LNPs誘導(dǎo)的高效T細(xì)胞激活有助于更好的腫瘤抑制效果和抗腫瘤免疫。綜上所述，這些雙側(cè)腫瘤模型中的免疫表型結(jié)果表明，F(xiàn)SP1/LNPs能夠通過(guò)激活T細(xì)胞和協(xié)調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)，重塑免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，并實(shí)現(xiàn)持久的腫瘤抑制。

圖8. FSP1/光敏脂質(zhì)納米顆粒的抗癌免疫應(yīng)答與遠(yuǎn)端腫瘤抑制作用。(A)腫瘤引流淋巴結(jié)中樹(shù)突狀細(xì)胞成熟度評(píng)估。(B)CD80+CD86+成熟樹(shù)突狀細(xì)胞定量分析。(C)利用光敏脂質(zhì)納米顆粒刺激全身抗腫瘤免疫的治療方案。(D)小鼠原發(fā)腫瘤體積變化。(E)遠(yuǎn)端腫瘤體積變化。(F)第14天原發(fā)腫瘤影像圖。(G)遠(yuǎn)端腫瘤影像圖。(H)第14天原發(fā)腫瘤重量。(I)第14天遠(yuǎn)端腫瘤重量（。(J)原發(fā)腫瘤內(nèi)FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。(K)脾臟樣本中效應(yīng)記憶T細(xì)胞（CD44+CD62L?）分析。(L)FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的定量結(jié)果。(M)效應(yīng)記憶T細(xì)胞的定量分析。(N)原發(fā)腫瘤內(nèi)CD8+ T淋巴細(xì)胞的定量結(jié)果。(O)遠(yuǎn)端腫瘤內(nèi)CD8+ T淋巴細(xì)胞的定量結(jié)果