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基于上述問(wèn)題，浙江大學(xué)林愛(ài)福團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種光控、溫度響應(yīng)的混合仿生納米載體，用于靶向遞送PD-L1抑制肽PTPR。該系統(tǒng)具有由1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DPPC）和吲哚菁綠（ICG）組成的熱敏脂質(zhì)體核心，可實(shí)現(xiàn)近紅外（NIR）觸發(fā)的藥物釋放。氟化PTPR增強(qiáng)了PD-L1抑制效果，而外部仿生血小板膜涂層形成混合囊泡，延長(zhǎng)了體循環(huán)并主動(dòng)靶向腫瘤。在近紅外（NIR）照射下，該系統(tǒng)在DPPC核心中誘導(dǎo)可調(diào)相變，觸發(fā)肽釋放并實(shí)現(xiàn)溫和的光熱療法介導(dǎo)的ICD。在三陰性乳腺癌模型（包括原位、遠(yuǎn)端和轉(zhuǎn)移性模型）中，該系統(tǒng)增強(qiáng)了T細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)了樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，刺激了全身免疫反應(yīng)，并有效下調(diào)了PD-L1表達(dá)，從而抑制了腫瘤進(jìn)展。值得注意的是，它還在侵襲性腫瘤模型中誘導(dǎo)了持久的免疫記憶反應(yīng)?？偠灾?，我們的研究提出了一個(gè)集成納米平臺(tái)，將精準(zhǔn)的腫瘤靶向性和藥物控制釋放相結(jié)合，為改善基于肽的癌癥免疫療法的療效提供了一種有前景的策略。該文章于2025年8月11日以《PD-L1-Targeting Biomimetic Photoresponsive Thermosensitive Liposomes for Triple-Negative Breast Cancer》為題發(fā)表于《Advanced Science》上（DOI: 10.1002/advs.202506841）。

研究示意圖

（1）PGFP的制備與表征

如圖1A所示。該肽可破壞PD-L1與TMUB1之間的相互作用，并促進(jìn)E3泛素連接酶HUWE1與PD-L1結(jié)合，從而誘導(dǎo)PD-L1泛素化降解，降低其細(xì)胞內(nèi)水平（圖1B、C）。此外，PTPR還顯著增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，并上調(diào)T細(xì)胞中TNF-α和IFN-γ的表達(dá)（圖1D–G），顯示出恢復(fù)抗腫瘤免疫反應(yīng)的潛力。為推進(jìn)PTPR的治療應(yīng)用，我們構(gòu)建了一種仿生、光響應(yīng)及溫敏的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)PGFP。該系統(tǒng)通過(guò)微流控技術(shù)將光敏劑ICG與氟化修飾的PTPR（PTPRF）共同包封于DPPC溫敏脂質(zhì)體中，實(shí)現(xiàn)藥物的可控裝載與釋放。透射電鏡圖像顯示，經(jīng)血小板膜偽裝的PGFP呈現(xiàn)典型核殼結(jié)構(gòu)，表明膜融合成功（圖1H）。其粒徑約120 nm，分布均勻，適于腫瘤積聚與藥物滯留（圖1I）。Zeta電位表明脂質(zhì)體或血小板膜有效屏蔽了納米顆粒表面電荷（圖1J）。紫外吸收光譜顯示PGFP在785 nm處有特征吸收峰，證明ICG光熱性能得以保持（圖1K）。蛋白電泳與免疫印跡結(jié)果表明，PGFP保留了血小板膜的關(guān)鍵蛋白成分（如CD41、CD61），證實(shí)其仿生特性（圖1L、M）。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，PGFP及氟化PEIF1800處理組細(xì)胞存活率高，而PEI2500和PEI1800則顯著降低細(xì)胞活力（圖1N–Q）。不同濃度PGFP即便無(wú)激光照射也表現(xiàn)出良好生物安全性（圖1R、S）。綜上，PGFP具備低細(xì)胞毒性、高載藥效率、膜衍生靶向能力及免疫調(diào)節(jié)功能，為靶向與刺激響應(yīng)型遞送提供了理想平臺(tái)。

圖1 PTPR 和 PGFP 的制備和表征。（A）PTPR肽的結(jié)構(gòu)示意圖；（B、C）免疫印跡和共沉淀實(shí)驗(yàn)；（D、E）RT-qPCR顯示經(jīng)PTPR處理的細(xì)胞中IFN-γ和TNF-α的mRNA水平；（F、G）4T1 細(xì)胞與活化的 T 細(xì)胞共培養(yǎng)染色實(shí)驗(yàn);（H）TEM圖像；（I）動(dòng)態(tài)光散射；（J）Zeta電位；（K）吸收光譜；（L, M）SDS-PAGE和免疫印跡；（N，O）鈣黃綠素 AM/PI 染色圖像；（P, Q）CCK-8檢測(cè)；（R, S）經(jīng)不同濃度 PGFP 處理的 MDA-MB-231 細(xì)胞的 Calcein AM 和 PI 染色圖像及熒光統(tǒng)計(jì)分析

（2）PGFP的體外細(xì)胞攝取和免疫治療效果

采用FITC-PGFP體系評(píng)估PTPR體外胞質(zhì)遞送。PGFP以時(shí)間依賴(lài)性方式促進(jìn)PTPR轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞質(zhì)。在孵育的第一個(gè)小時(shí)內(nèi)，大部分內(nèi)化的PGFP與LysoTracker Red共定位，表明其定位于胞質(zhì)體（圖 2 A,B）。在無(wú)激光照射的情況下孵育3-6 h后，一小部分PGFP成功從胞質(zhì)體中逸出并釋放到胞質(zhì)中（圖 2C,D）。8 h后，未觀察到額外的胞質(zhì)逸出，表明PGFP已完成胞質(zhì)釋放（圖 2E）。用 FITC-PGFP 處理的 4T1 細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，PTPR 呈劑量依賴(lài)性增加（范圍從 10 到 50 μM），與用 50 μM 游離 FITC-PTPR 處理的細(xì)胞相比，PGFP 處理的細(xì)胞的攝取量明顯更高（圖 2F、G）。這些結(jié)果證實(shí) PGFP 顯著增強(qiáng)了 PTPR 的遞送和細(xì)胞攝取。與 GP 和 GFP 相比，涂有血小板膜的 PGFP 納米粒子被 MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)化率明顯提高。這種增強(qiáng)的攝取可能歸因于血小板膜的仿生特性。具體來(lái)說(shuō)，血小板衍生的粘附分子，如 P 選擇素、整合素 α6β1 和整合素 αIIbβ3，可能與腫瘤相關(guān)受體（如 PSGL-1、CD44、ADAM9 和整合素 αvβ3）結(jié)合，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞主動(dòng)內(nèi)化。免疫印跡分析表明，PGFP 和 PTPRF 在濃度為 10 μ M時(shí)即可有效抑制 PD-L1 表達(dá)，而游離 FITC-PTPR 則需要更高的 20 μM 劑量才能達(dá)到相當(dāng)?shù)囊种菩Ч▓D 2H）。此外，與單獨(dú)使用PTPR治療相比，PGFP顯著上調(diào)了T細(xì)胞中TNF-α和IFN-γ的表達(dá)（圖 2I、J），凸顯了其增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的潛力。這些結(jié)果表明，PGFP不僅改善了PTPR的細(xì)胞內(nèi)遞送，還通過(guò)有效下調(diào)PD-L1并促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用來(lái)增強(qiáng)其免疫治療效果。

圖2 PGFP的細(xì)胞攝取和體外免疫因素。（A-E）4T1細(xì)胞與FITC標(biāo)記的PGFP孵育1、3、6和8小時(shí)的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像。內(nèi)體用LysoTracker Red染色，細(xì)胞核用Hoechst 33342復(fù)染。（F，G）流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞攝?。℉）免疫印跡分析（I，J）使用 RT-qPCR 分析 PTPR 或 PGFP 處理后 T 細(xì)胞中 IFN-γ (I) 和 TNF-α (J) 的表達(dá)

（3）PGFP的光熱效應(yīng)及光熱激活評(píng)價(jià)

ICG 因其優(yōu)異的生物相容性和強(qiáng)大的近紅外熒光特性，被廣泛應(yīng)用于血液循環(huán)監(jiān)測(cè)、肝功能評(píng)估、腫瘤檢測(cè)和淋巴結(jié)成像等醫(yī)療應(yīng)用。為評(píng)價(jià)仿生 PGFP 納米載體的光熱效應(yīng)和藥物釋放行為，監(jiān)測(cè)了不同 PGFP 濃度在近紅外輻照下的溫度變化。在 808 nm 激光輻照（1.0 W/cm²）下PGFP 表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性溫度升高，在 60 μM 濃度下 2 分鐘內(nèi)溫度飆升超過(guò) 30 ℃。相反，PBS 在相同條件下顯示出最小的溫度變化（圖 3A、B）。此外，PGFP（ICG 80 μM）在連續(xù)五次開(kāi)啟/關(guān)閉輻照循環(huán)中表現(xiàn)出很強(qiáng)的光熱穩(wěn)定性，在重復(fù)暴露后加熱效率僅略有降低，同時(shí)將溫度保持在 60 ℃ 以上（圖 3C）。為了評(píng)估其在溫和輻照條件下的光熱性能，測(cè)量了不同功率密度下 PGFP（60 μM）的溫度變化。隨后，在 4T1 和 MDA-MB-231 細(xì)胞中評(píng)估了光活化 PGFP 的細(xì)胞毒性。PGFP 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有劑量和激光依賴(lài)性，濃度升高、照射時(shí)間延長(zhǎng)和功率密度更高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降幅度更大（圖 3D-G）。使用標(biāo)記有DID或FITC-PTPR的PGFP納米粒子，結(jié)合溶酶體標(biāo)記物L(fēng)ysoTracker Green或Red，評(píng)估了PGFP在近紅外照射下的溶酶體逃逸能力。孵育3小時(shí)后，與未照射的對(duì)照組相比，激光照射的PGFP納米粒子表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的逃逸溶酶體的能力（圖 3H-J）。激光引起的溫度升高（≈42℃）促進(jìn)了PTPR從PGFP納米粒子中釋放，破壞了PD-L1的翻譯后修飾，導(dǎo)致其表達(dá)降低（圖 3K-M）。）。此類(lèi)結(jié)果強(qiáng)調(diào)了PGFP促進(jìn)精確激光觸發(fā)藥物釋放的潛力，從而提高PD-L1免疫檢查點(diǎn)阻斷的治療效果。通過(guò)將PGFP注射到小鼠尾靜脈，然后在8 h循環(huán)期后用近紅外光照射腫瘤來(lái)評(píng)估體內(nèi)光熱性能。在初始激光功率為2.0 W/cm ²的情況下，PGFP處理小鼠的腫瘤表現(xiàn)出快速的溫度升高，并且通過(guò)調(diào)節(jié)激光功率成功地將腫瘤溫度維持在≈42 ℃（圖 3N）。相反，PBS，閃爍脂質(zhì)體或GFP處理小鼠的腫瘤表現(xiàn)出較慢的溫度升高和較低的最高溫度。雖然GFP處理的腫瘤顯示出溫度的快速升高，但它們未達(dá)到與PGFP組相同的腫瘤溫度。PGFP增強(qiáng)的光熱性能可能歸因于仿生血小板膜涂層，其提高了腫瘤的積累和光熱轉(zhuǎn)換效率。這些結(jié)果表明PGFP是一種高效且可控的光熱劑，具有明顯的腫瘤靶向性和治療潛力。

圖3 體外和體內(nèi) PGFP 光熱激活評(píng)估。（A） 在 1 W/cm ²近紅外激光輻照下，不同 ICG 濃度的 PGFP 溫升曲線。（B） 在 1 W/cm² 激光輻照下，不同 ICG 濃度的 PGFP 的紅外熱圖像。（C） 在 1 W/ cm ²下連續(xù)五個(gè)開(kāi)/關(guān)輻照周期內(nèi) PGFP 的溫度波動(dòng)。（D，E）在不同功率密度的激光輻照下用 PGFP 處理的 MDA-MB-231 或 4T1 細(xì)胞的細(xì)胞活力。（F，G） 在 1 W/cm ² 激光輻照下，用不同 ICG 濃度的 PGFP 處理的 MDA-MB-231 和 4T1 細(xì)胞的細(xì)胞活力。 （H-J）共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLSM) 圖像和定位分析曲線。（K）在不同溫度下 PGFP 處理后 PD-L1 蛋白表達(dá)的免疫印跡分析。（L，M）在有和沒(méi)有近紅外照明的條件下，流式細(xì)胞術(shù)分析 PGFP 對(duì) PD-L1 蛋白的抑制情況。（N）小鼠的紅外熱圖像

（4）CD62p/CD44介導(dǎo)的PGFP納米載體體內(nèi)腫瘤靶向性

將熒光標(biāo)記的納米載體（PTPR-FITC、GFP-FITC 或 PGFP-FITC）靜脈注射到 4T1 荷瘤 BALB/c 小鼠體內(nèi)，以評(píng)估其循環(huán)動(dòng)力學(xué)和生物分布。尾靜脈注射后 24 小時(shí)對(duì)腫瘤和主要器官進(jìn)行成像，結(jié)果顯示 PGFP-FITC 和 GFP-FITC 在腫瘤組織中的蓄積量高于 PTPR-FITC，而 PTPR-FITC 的熒光相對(duì)較弱。值得注意的是，用仿生血小板膜修飾的 PGFP-FITC 表現(xiàn)出比 GFP-FITC 更強(qiáng)的腫瘤蓄積量（圖 4 A、B）。這種增強(qiáng)作用歸因于混合血小板膜蛋白 CD62p 與腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的 CD44 受體的特異性結(jié)合。這些研究結(jié)果表明， CD62p/CD44 相互作用可有效介導(dǎo) PGFP 主動(dòng)靶向腫瘤微環(huán)境。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)采集的血液樣本進(jìn)行熒光成像分析顯示，與PTPR-FITC相比，GFP-FITC和PGFP-FITC顯著延長(zhǎng)了血漿循環(huán)時(shí)間（圖 4C、D）。在測(cè)試的制劑中，PGFP-FITC的循環(huán)時(shí)間最長(zhǎng)，約為48小時(shí)（圖 4D）。這些結(jié)果表明，血小板膜修飾顯著延長(zhǎng)了納米載體在血液中的循環(huán)時(shí)間，從而可能增強(qiáng)其治療效果。進(jìn)行體內(nèi)成像以評(píng)估小鼠體內(nèi)的DID-PGFP生物分布。注射后12小時(shí)，DID-PGFP信號(hào)主要定位于肝臟和乳腺區(qū)域附近的皮下腫瘤結(jié)節(jié)（圖 4E，F(xiàn)）。相反，未封裝的DID表現(xiàn)出較低的腫瘤定位和快速的全身清除（圖 4G-I）。對(duì)注射FITC-PGFP 12小時(shí)后收集的主要器官（心臟，肺，腎，肝臟和脾臟）的冷凍切片進(jìn)行熒光分析證實(shí)了脫靶積累減少和腫瘤特異性定位增加（圖 4J，K）。這些結(jié)果表明，血小板膜修飾的PGFP納米系統(tǒng)具有顯著延長(zhǎng)的血漿半衰期和增強(qiáng)的腫瘤蓄積，支持其作為靶向癌癥治療的有效平臺(tái)的潛力。

圖4 PGFP的體內(nèi)腫瘤靶向作用。（A，B）在靜脈注射FITC-PTPR、GFP-FITC或PGFP-FITC 24小時(shí)后，進(jìn)行離體熒光成像和定量分析，以評(píng)估4T1腫瘤小鼠腫瘤和主要器官中FITC-PTPR的積累情況。（C，D）在靜脈注射游離FITC-PTPR或PGFP-FITC后，測(cè)量小鼠血清中FITC-PTPR的時(shí)間依賴(lài)性熒光強(qiáng)度。（E）在尾靜脈注射游離DID或DID標(biāo)記的PGFP（n=3）后12小時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行體內(nèi)熒光成像。（F，G）在 4T1 荷瘤小鼠的腫瘤和主要器官中進(jìn)行離體熒光成像和 DID 蓄積定量分析。（H，I）在小鼠靜脈注射游離 DID 或 DID-PGFP 12 小時(shí)后，進(jìn)行熒光成像和定量分析小鼠血清中的 DID 熒光強(qiáng)度。（J，K）冷凍腫瘤切片和主要器官的代表性熒光圖像和熒光強(qiáng)度定量分析

（5）808nm激光照射對(duì)PGFP的抗腫瘤作用

使用 4T1 荷瘤 BALB/c 小鼠模型評(píng)估 PGFP 聯(lián)合溫和光熱療法的抗腫瘤效果，重點(diǎn)關(guān)注實(shí)體腫瘤中的 PD-L1 破壞和 ICD。NIR 激光治療組在注射后 8 小時(shí)接受單次激光照射（808 nm，42 ℃，15 分鐘）（圖 5 A）。與鹽水、PTPR 和 PGF+（用血小板膜包裹并共負(fù)載 ICG 和 PEIF 的脂質(zhì)納米顆粒；“+”表示近紅外激光照射）治療相比，PTPR 聯(lián)合納米載體介導(dǎo)的光熱療法（PGFP+）表現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果（圖 5B-E）。此外，我們分析了脾臟、淋巴結(jié)和腫瘤中的免疫細(xì)胞活性，以及關(guān)鍵免疫細(xì)胞因子的血清水平。與鹽水組相比，PTPR 組的腫瘤組織中 CD8? T 細(xì)胞浸潤(rùn)增加，PD-L1 蛋白表達(dá)降低。同樣，溫和的光熱療法導(dǎo)致 PD-L1 蛋白表達(dá)上調(diào)、CD8? T 細(xì)胞浸潤(rùn)增加，表明 ICD 增強(qiáng)和潛在的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。值得注意的是，PGFP+ 組的腫瘤組織中 PD-L1 蛋白表達(dá)低于 PGF+ 組，CD8? T 細(xì)胞浸潤(rùn)高于 PGF+ 組（圖 5F）。此外，與 PGF+ 和 PTPR 組相比，PGFP+ 治療小鼠的血清 TNF-α 和 IFN-γ 水平顯著升高（圖 5G、H），表明免疫激活強(qiáng)勁。此外，成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（圖 5I、J）和 CD8? 細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞（圖 5K、L）的比例在 PGFP+ 組中顯著較高，而調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Tregs) 的比例顯著較低（圖 5M、N）。與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的這些改變相對(duì)應(yīng)，PGFP+ 治療顯著抑制了腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)了腫瘤組織內(nèi)的壞死和凋亡，并顯著延長(zhǎng)了生存期（圖 5O、P）。這些結(jié)果表明，我們的輸送系統(tǒng)成功地將溫和熱療與 PD-L1 抑制相結(jié)合，大大降低了腫瘤相關(guān)的免疫抑制并增強(qiáng)了抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖5 溫和光熱療法聯(lián)合免疫療法有效抑制原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)。（A）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。（B）4T1腫瘤BALB/c小鼠各治療組治療后腫瘤圖像。（C）不同治療組小鼠腫瘤重量統(tǒng)計(jì)（D）治療后小鼠腫瘤體積統(tǒng)計(jì)。（E）4T1荷瘤BALB/c小鼠模型中，不同治療方案后各小鼠原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)曲線。（F）治療后BALB/c小鼠腫瘤組織中CD8⁺ T細(xì)胞的免疫熒光圖像和PD-L1的免疫組化圖像。（G,H）用ELISA法測(cè)定治療后小鼠血漿中TNF-α和IFN-γ的水平。（I,J）4T1荷瘤小鼠模型中PGFP+策略誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）成熟分析（以CD11c⁺ DC細(xì)胞為門(mén)控）。治療后收集淋巴結(jié)細(xì)胞，并使用流式細(xì)胞術(shù)分析 CD11c、CD80 和 CD86 標(biāo)記物。（K,L）小鼠脾臟 CD4⁺和 CD8⁺ T 細(xì)胞 的流式細(xì)胞術(shù)分析。（M,N）治療后小鼠脾臟中 Treg 細(xì)胞頻率的流式細(xì)胞術(shù)分析。（O,P）腫瘤組織切片的共聚焦圖像

（6）PGFP策略抑制遠(yuǎn)端腫瘤生長(zhǎng)

為評(píng)估PGFP誘導(dǎo)的主動(dòng)免疫反應(yīng)對(duì)未經(jīng)治療遠(yuǎn)處腫瘤的抑制作用，我們建立了雙側(cè)4T1腫瘤模型（圖6A），僅原發(fā)瘤接受光照，遠(yuǎn)處瘤不進(jìn)行治療。結(jié)果顯示，PGFP+治療不僅有效抑制原發(fā)瘤生長(zhǎng)（圖6B–F），還顯著延緩了遠(yuǎn)處腫瘤進(jìn)展，其效果優(yōu)于PGF+，表明溫和光熱療法與PD-L1抑制在逆轉(zhuǎn)“冷”腫瘤微環(huán)境中具有協(xié)同作用。PGFP+處理組小鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平顯著高于PTPR及PGF+組（圖6G,H），提示全身免疫應(yīng)答增強(qiáng)。同時(shí)，該組CD8? T細(xì)胞比例上升、Treg比例下降（圖6I–M），樹(shù)突狀細(xì)胞成熟程度也顯著提高，表明PGFP+可有效誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫及免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）。在未經(jīng)照射的遠(yuǎn)處瘤內(nèi)，PGFP+組也觀察到細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和活化增加（圖6N,O），PD-L1蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡（TUNEL?）增多，增殖指標(biāo)（Ki67?）減少，說(shuō)明其腫瘤微環(huán)境免疫應(yīng)答顯著增強(qiáng)。所有治療組小鼠體重穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)PGFP策略具有良好的生物相容性和安全性。

圖6 PGFP+策略對(duì)遠(yuǎn)處腫瘤的治療效果。（A）小鼠遠(yuǎn)處腫瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。（B）4T1腫瘤BALB/c小鼠模型的原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處腫瘤組織的體外圖像。（C，D）4T1腫瘤BALB/c小鼠模型中原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)曲線。（E,F）接受不同治療的小鼠原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處腫瘤的腫瘤重量。（G，H）不同治療后小鼠血清中TNF-α和IFN-γ的水平。（I-K）對(duì)接受不同治療的小鼠脾臟中的CD4 ⁺和CD8 ⁺ T細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。（L，M）各種治療后小鼠脾臟組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的頻率。（N，O）原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處腫瘤組織切片中CD8 ⁺效應(yīng)T細(xì)胞和TUNEL染色 的圖像。腫瘤組織切片中PDL1和Ki67蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)圖像

（7）光激活PGFP系統(tǒng)的抗轉(zhuǎn)移性腫瘤活性

采用肺轉(zhuǎn)移性4T1腫瘤再刺激模型評(píng)估PGFP+治療誘導(dǎo)的長(zhǎng)期免疫記憶效應(yīng)（圖7A）。在該模型中，預(yù)先治療兩周的小鼠經(jīng)尾靜脈注射熒光素酶標(biāo)記的4T1細(xì)胞，僅原發(fā)瘤接受照射。結(jié)果表明，PGFP+聯(lián)合溫和光熱治療與抗PD-L1肽遞送顯著抑制了原發(fā)瘤生長(zhǎng)（圖7B），并激活系統(tǒng)性抗腫瘤免疫。經(jīng)生物發(fā)光成像及H&E染色評(píng)估，PGFP+預(yù)處理組小鼠未見(jiàn)明顯肺轉(zhuǎn)移，而鹽水或載體組在14天內(nèi)出現(xiàn)顯著轉(zhuǎn)移（圖7C–E）。流式細(xì)胞術(shù)顯示，PGFP+、PGF+及PTPR處理組小鼠脾臟中CD8? T細(xì)胞比例增高（圖7F–H），記憶T細(xì)胞群（包括中樞記憶與效應(yīng)記憶T細(xì)胞）也顯著擴(kuò)增（圖7I、J），表明免疫記憶成功建立。免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)，上述組別中轉(zhuǎn)移性肺瘤內(nèi)CD8? T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加（圖7K、L）。ELISA檢測(cè)顯示PGFP+組血清TNF-α和IFN-γ水平上升，印證免疫系統(tǒng)強(qiáng)效激活。綜上，PGFP+療法可系統(tǒng)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、促進(jìn)免疫記憶形成、增強(qiáng)T細(xì)胞浸潤(rùn)及樹(shù)突細(xì)胞成熟，且所有治療組未引起明顯體重下降，顯示出良好的生物相容性與治療潛力。

圖7 PGFP+ 誘導(dǎo)的長(zhǎng)期免疫效應(yīng)對(duì)小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防。（A） PGFP+ 介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。（B） 統(tǒng)計(jì)小鼠接受生理鹽水、載體、PTPR、PGF+、PGFP+ 治療后分離的原發(fā)性腫瘤體積。（C） 接受指定治療后 4T1 腫瘤肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的生物發(fā)光成像。（D） 接受指定治療后 4T1 腫瘤肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的 H&E 染色。（D） 肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的定量分析。（F-H）治療后小鼠脾臟中CD4⁺和 CD8⁺  T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。（I，J） 小鼠在接受指定治療后，效應(yīng)記憶T 細(xì)胞 (CD3⁺ CD8⁺ CD44⁺ CD62L^? ) 和中央記憶T 細(xì)胞 (CD3? CD8? CD44? CD62L?) 的代表性流式細(xì)胞術(shù)圖像和定量分析。（K，L）4T1肺轉(zhuǎn)移性腫瘤組織切片中CD4 ⁺（綠色）和CD8⁺（紅色）T細(xì)胞的代表性免疫熒光圖像及定量分析