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針對上述問題，復(fù)旦大學(xué)黃錦海/周行濤教授團(tuán)隊(duì)合作設(shè)計并構(gòu)建了一種新型多功能上轉(zhuǎn)換納米復(fù)合材料（MCNs/Ln/GD/FR NPs）。該材料以具有良好藥物負(fù)載能力和近紅外吸收性能的介孔碳納米材料（MCNs）為核心，外層包覆稀土上轉(zhuǎn)換材料（Y?O?S:Yb3?, Er3?），可將980?nm長波激光轉(zhuǎn)換為可見光，拓展其光吸收范圍，從而顯著提升光熱轉(zhuǎn)換效率。在該基礎(chǔ)上，復(fù)合材料共載有兩種功能藥物：天然熱休克蛋白抑制劑藤黃酸（GA）和廣譜抗癌藥阿霉素（DOX），通過協(xié)同機(jī)制有效抑制腫瘤細(xì)胞的耐熱性并增強(qiáng)殺傷作用。同時，材料表面修飾溫敏水凝膠PNIPAM，實(shí)現(xiàn)藥物的控溫響應(yīng)釋放，提高治療的安全性與效率。為增強(qiáng)靶向性和細(xì)胞攝取效率，納米復(fù)合材料還進(jìn)一步接枝葉酸（FA）和細(xì)胞穿膜肽R8，提升其在腫瘤組織內(nèi)的富集能力和細(xì)胞穿透能力。研究中不僅對材料的形貌、結(jié)構(gòu)、光熱性能和藥物釋放行為進(jìn)行了系統(tǒng)表征，還建立皮下和眼內(nèi)黑色素瘤動物模型，綜合評價其體內(nèi)外的生物相容性和光熱協(xié)同治療效果。結(jié)果顯示，該復(fù)合材料具有優(yōu)異的腫瘤靶向性和治療效果，顯著抑制OCM-1細(xì)胞活性及黑色素瘤生長，為低溫光熱抗腫瘤、抗新生血管和抗菌治療提供了有前景的策略。該文章于2025年7月9日以《Synthetic carbon-based lanthanide upconversion nanoparticles for enhanced photothermal therapy》為題發(fā)表于《Nature Communications》上（DOI：10.1038/s41467-025-60454-5）。

圖1 示意圖 MCNs/Ln/GD/FR納米粒子的合成及其在黑色素瘤光熱協(xié)同治療中的應(yīng)用

（1）MCNs/Ln納米顆粒的材料表征

MCNs/Ln納米顆粒采用以MCNs為核心的合成策略（圖2A）。SEM圖像顯示包覆碳酸鑭殼層后粒徑由100?nm增至200?nm，焙燒后降至約130?nm，800?°C下顆粒完整性受損（圖2B）。TEM及HRTEM證實(shí)Y?O?S:Yb3?,Er3?包覆成功，且表面存在0.293?nm晶面間距，對應(yīng)其六方晶面（圖2C）。XRD圖譜顯示，MCNs及其前驅(qū)體無明顯衍射峰，而MCNs/Ln NPs具明顯晶體特征，匹配JCPDS#24-1424（圖2D）。氮?dú)馕建C脫附等溫線分析顯示MCNs比表面積為523.31?m2/g，包覆殼層后降至184.55?m2/g，孔徑仍約3?nm（圖2E），保留良好載藥潛力。熒光測試顯示Y?O?S:Yb3?,Er3?在980?nm激發(fā)下產(chǎn)生550、690和840?nm發(fā)射光，包覆MCNs后可見光發(fā)射減弱，近紅外發(fā)射增強(qiáng)（圖2F），表明MCNs吸收了殼層發(fā)射光。0.75?mmol為最佳包覆量，超過則發(fā)光效率下降（圖2F）。在980?nm激光照射下，0.75?mmol包覆組溫升最顯著，從29?°C上升至65?°C，優(yōu)于MCNs組（51.5?°C）（圖2G）。700?°C焙燒樣品的光熱轉(zhuǎn)化性能最優(yōu)；光照功率、濃度與照射時間均正相關(guān)地影響溫度升高（圖2H）。熱轉(zhuǎn)換效率測定表明，MCNs/Ln NPs（0.75?mmol）效率為82.86%，顯著高于MCNs（59.48%）和Y?O?S:Yb3?,Er3?（19.8%）（圖2I）。機(jī)制圖展示了在980?nm照射下，Yb3?–Er3?能量轉(zhuǎn)移后發(fā)出的多波長光被MCNs進(jìn)一步吸收，從而拓寬吸收帶寬并增強(qiáng)光熱效率（圖2J）。

圖2. MCNs/Ln NPs的表征。（A）MCNs/Ln NPs的合成示意圖；（B）不同階段樣品的SEM圖像；（C）MCNs及MCNs/Ln NPs的TEM與HRTEM圖像；（D）不同條件下樣品的XRD圖譜；（E）MCNs與MCNs/Ln NPs的BET曲線；（F）980?nm激光下不同樣品的發(fā)射光譜；（G）不同鑭系硝酸鹽用量對光熱性能的影響；（H）不同濃度和照射時間下的光熱成像圖；（I）三種樣品的光熱轉(zhuǎn)換效率比較；（J）MCNs/Ln NPs光熱效率提升的機(jī)制示意圖

（2）MCNs/Ln/GD/FR納米顆粒的材料特性

如圖3A所示，具優(yōu)異光熱轉(zhuǎn)換性能的親水性MCNs/Ln NPs被用作載體，依次通過負(fù)載GA（MCNs/Ln/G）、包覆溫度與GSH響應(yīng)性PNIPAM水凝膠（MCNs/Ln/G/pNIPAM）、包載DOX（MCNs/Ln/GD）及共價修飾FA與R8（MCNs/Ln/GD/FR）形成多功能納米顆粒。Zeta電位從初始16.4?mV降至2.7?mV（負(fù)載GA），再降至?17.3?mV（包覆PNIPAM），加入DOX后升至8.2?mV，修飾FA與R8后變?yōu)?2.9?mV。TEM圖像顯示殼層外包覆非晶態(tài)PNIPAM水凝膠（圖3A）。DOX的包封效率與載藥率高于GA，48小時內(nèi)GA釋放率約58%。DOX釋放受溫度與GSH刺激調(diào)控，GSH濃度越高，釋放量越大（圖3B）。加熱促進(jìn)水凝膠崩解，DOX釋放時間由無加熱時的緩慢釋放縮短為約1分鐘（圖3C）。熒光顯微鏡進(jìn)一步驗(yàn)證了光熱響應(yīng)下DOX的可控釋放（圖3D），示意圖說明納米顆?？稍隗w內(nèi)安全遞送，避免早期釋放（圖3E）。ARPE-19細(xì)胞在50–200?μg/mL濃度下存活率超80%，表現(xiàn)出良好生物相容性。在hRMEC、293T和L929細(xì)胞中，MCNs/Ln/GD/FR濃度高達(dá)400?μg/mL時，除hRMEC略降至約70%，其余細(xì)胞存活率仍高于80%，證實(shí)該納米材料具有明顯的生物相容性。

（3）MCNs/Ln/GD/FR納米粒的體外協(xié)同治療

在評估納米復(fù)合材料的光熱聯(lián)合治療（PTT）效果前，首先測試了980?nm激光對OCM-1細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)激光功率密度升至280?mW?cm?2時，細(xì)胞存活率為85%，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用280?mW/?cm²作為照射功率密度。在此條件下，納米復(fù)合材料對OCM-1細(xì)胞的PTT效應(yīng)與濃度呈正相關(guān)（圖3F）。在100?μg?mL?1下，僅負(fù)載MCNs的細(xì)胞存活率為60%，而包覆Y?O?S:Yb3?,Er3?后的MCNs/Ln組下降至20%；進(jìn)一步加載GA與DOX、修飾FA與R8后（MCNs/Ln/GD/FR），細(xì)胞存活率降至13%，濃度增至200?μg?mL?1后進(jìn)一步下降至6%，表明修飾顯著增強(qiáng)PTT協(xié)同效應(yīng)。Calcein-AM/PI雙染結(jié)果顯示，MCNs/Ln/GD/FR組中綠色活細(xì)胞顯著減少，紅色死亡細(xì)胞明顯增多（圖3G），驗(yàn)證其光熱殺傷效果隨功能化程度增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步顯示，200?μg?mL?1納米材料照射10?min后，MCNs組細(xì)胞活性為21.1%，而MCNs/Ln組降至8.14%，MCNs/Ln/GD/FR組降至5.9%，晚期凋亡細(xì)胞顯著增加（圖3H），反映其增強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)和腫瘤靶向能力。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示，MCNs/Ln/GD/FR聯(lián)合激光處理可顯著下調(diào)OCM-1細(xì)胞中HSP70水平（由1.37降至0.65），說明GA有效抑制熱休克蛋白表達(dá)，減弱腫瘤細(xì)胞耐熱性，增強(qiáng)熱誘導(dǎo)凋亡（圖3I, J）。

圖3. MCNs/Ln/GD/FR NPs的表征與治療效果評估。（A）納米顆粒的合成示意圖及TEM圖像；（B）不同GSH濃度對DOX釋放的影響；（C）GSH與光照對DOX釋放的協(xié)同作用；（D）有無激光照射條件下的熒光圖像；（E）溫度與GSH響應(yīng)性釋放示意圖；（F）不同納米顆粒對OCM-1細(xì)胞活性的PTT協(xié)同治療效果；（G）Calcein-AM/PI雙染觀察細(xì)胞死亡情況；（H）不同處理組的流式細(xì)胞凋亡分析；（I）不同條件下HSP70蛋白表達(dá)水平變化；（J）MCNs/Ln/GD/FR NPs各組分的治療作用分析

（4）體外和體內(nèi)MCNs/Ln/GD/FR納米粒攝取增加

為評估MCNs/Ln/GD/FR NPs的腫瘤（腫瘤細(xì)胞）靶向能力，分別在體外及體內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于OCM-1細(xì)胞富含葉酸受體，相較于ARPE-19細(xì)胞，其更易攝取FA修飾的納米顆粒（圖4A、B）。將200?μg?mL?1的MCNs/Ln/D/FR NPs與OCM-1和ARPE-19細(xì)胞共孵育6小時后，觀察到OCM-1細(xì)胞內(nèi)DOX紅色熒光明顯增強(qiáng)，表明攝取量更高（圖4C）。熒光強(qiáng)度定量分析也證實(shí)OCM-1細(xì)胞內(nèi)DOX濃度更高（圖4D）。在小鼠皮下黑色素瘤模型中，通過靜脈注射不同處理組（PBS、Laser、MCNs/Ln/GD、MCNs/Ln/GD/FR）并于4小時后觀察腫瘤部位，MCNs/Ln/GD/FR組腫瘤區(qū)域顏色明顯加深（），熱成像顯示其腫瘤溫度顯著高于其他組（圖4F、G），說明納米顆粒富集程度更高。ICP分析顯示MCNs/Ln/GD/FR組腫瘤組織中Y元素含量更高（圖4H）。HE染色結(jié)果顯示，該組腫瘤組織中黑色顆粒更多，伴隨明顯壞死及炎性細(xì)胞浸潤（圖4I），進(jìn)一步驗(yàn)證納米顆粒在腫瘤內(nèi)的富集與治療反應(yīng)。熱成像及ICP分析進(jìn)一步證實(shí)，MCNs/Ln/GD/FR組小鼠的腫瘤溫度遠(yuǎn)高于其余組織及其他組的腫瘤組織（圖4J），且Y元素主要分布于腫瘤組織中，其他臟器攝取較少，提示MCNs/Ln/GD/FR NPs具有良好的腫瘤靶向性與組織安全性（圖4K）。

（5）MCNs/Ln/GD/FR納米粒增強(qiáng)體內(nèi)抗皮下腫瘤的作用

為評估MCNs/Ln/GD/FR NPs在體內(nèi)的腫瘤協(xié)同治療效果，建立皮下和眼內(nèi)兩種黑色素瘤模型。皮下瘤治療過程中，小鼠體重始終保持穩(wěn)定，表明該納米復(fù)合物具有良好生物相容性。不同處理組腫瘤體積變化顯著：PBS、Laser、DOX及MCNs/Ln/GD組腫瘤持續(xù)增長，而MCNs/Ln/GD/FR組腫瘤體積逐漸縮小，部分小鼠21天內(nèi)腫瘤完全消退（圖4L, M）。治療期間及剝離后的腫瘤照片進(jìn)一步印證了其顯著抑瘤效果（圖4L, N）。

圖4. MCNs/Ln/GD/FR NPs對皮下黑色素瘤的靶向性與抗腫瘤效果。（A）OCM-1與ARPE-19細(xì)胞中葉酸受體表達(dá)的Western Blot結(jié)果；（B）葉酸受體表達(dá)差異示意圖；（C）納米顆粒與ARPE-19和OCM-1細(xì)胞共孵育后的共聚焦圖像；（D）細(xì)胞攝取納米顆粒的熒光定量分析圖；（E）皮下瘤模型建立與干預(yù)流程圖；（F）不同處理組小鼠接受980?nm激光照射后的熱成像照片；（G）各組腫瘤部位溫度變化曲線；（H）各組腫瘤組織中的Y元素含量；（I）MCNs/Ln/GD與MCNs/Ln/GD/FR組腫瘤組織的H&E染色圖；（J）不同組織器官的溫度直方圖；（K）MCNs/Ln/GD/FR組不同組織中Y元素含量；（L）治療期間不同時點(diǎn)小鼠外觀圖像；（M）各組腫瘤體積變化曲線；（N）不同組切除腫瘤組織的照片及質(zhì)量比較

（6）MCNs/Ln/GD/FR納米粒對眼部原位黑色素瘤的抗腫瘤作用

為評估MCNs/Ln/GD/FR NPs對眼內(nèi)原位腫瘤的治療效果，通過視網(wǎng)膜下注射OCM-1-Luc細(xì)胞建立眼內(nèi)黑色素瘤模型（圖5A）。隨后比較尾靜脈注射（IV）與玻璃體內(nèi)注射（IVT）兩種方式?；铙w光學(xué)成像結(jié)果顯示，MCNs/Ln/GD/FR（IV）組腫瘤熒光信號顯著減弱，表明其抑瘤效果優(yōu)于其他組（圖5B）。治療期間熒光變化趨勢顯示，MCNs/Ln/GD/FR（IV）組的熒光強(qiáng)度接近初始值，抑瘤效果顯著（圖5C）。第21天眼球重量測定表明，僅MCNs/Ln/GD/FR（IV）和（IVT）兩組與健康眼無顯著差異，進(jìn)一步證實(shí)其協(xié)同治療作用（圖5D）。紅外熱成像結(jié)果顯示，MCNs/Ln/GD/FR（IV）組眼部溫度升高顯著（P = 0.0011），接近IVT組水平，說明FA與R8修飾增強(qiáng)了經(jīng)靜脈注射的腫瘤靶向性與治療效果（圖5E, F）。H&E染色顯示，PBS組眼球嚴(yán)重變形，DOX與MCNs/Ln/GD組腫瘤減小但仍明顯；MCNs/Ln/GD/FR組（IVT）雖腫瘤更小，但存在視網(wǎng)膜剝離及玻璃體縮小現(xiàn)象；相比之下，MCNs/Ln/GD/FR（IV）組幾乎無明顯視網(wǎng)膜損傷，提示其溫和治療方案更具安全性（圖5G, H）。

圖5. MCNs/Ln/GD/FR NPs在原位黑色素瘤模型中的協(xié)同治療效果。（A）原位黑色素瘤建模與干預(yù)流程示意圖；（B）不同處理組OCM-1-Luc荷瘤小鼠眼部的活體熒光成像圖；（C）各組相對腫瘤熒光強(qiáng)度變化曲線；（D）不同組小鼠眼球重量比較；（E）980?nm激光照射下不同處理組小鼠的眼部熱成像圖；（F）各組小鼠眼部溫度變化曲線；（G）各組眼組織的H&E染色圖；（H）兩種給藥方式下MCNs/Ln/GD/FR NPs在原位黑色素瘤中的作用機(jī)制示意圖

（7）MCNs/Ln/GD/FR納米粒的體內(nèi)安全性評價

為進(jìn)一步評估MCNs/Ln/GD/FR NPs在PTT治療后的潛在毒性，開展了溶血實(shí)驗(yàn)、組織H&E染色、ICP元素分析及血液生化檢測。結(jié)果顯示，紅細(xì)胞溶血率在納米顆粒濃度為200?μg?mL?1時約為1.33%，表明材料具良好的血液相容性（圖6A）。一系列器官的H&E染色未發(fā)現(xiàn)心、肝、脾、肺及腎的病理性損傷（圖6B）。ICP分析顯示，經(jīng)尾靜脈注射治療1個月后，組織中釔（Y）含量顯著下降，肝臟中Y含量由初始的20?mg?kg?1降至約2.4?mg?kg?1，提示該納米顆粒具有代謝能力（圖6C）。血液生化檢測于第15天和第30天分別進(jìn)行（n=5），PBS組為對照。結(jié)果顯示，除AST略高于對照組但仍在正常范圍外，其余肝腎功能指標(biāo)均無異常，未見明顯炎癥或毒性反應(yīng)（圖6D）。此外，通過TUNEL染色進(jìn)一步評估其在眼組織的安全性。圖6E顯示，兩組（MCNs/Ln/GD/FR(IV)與IVT）腫瘤區(qū)均有明顯凋亡陽性信號，說明材料具有效抗瘤能力。然而，IVT組在非腫瘤區(qū)域亦觀察到較強(qiáng)綠熒光，提示其在光熱治療中可能對視網(wǎng)膜等組織造成損傷。而IV組非腫瘤區(qū)域熒光信號較弱，結(jié)合HE染色結(jié)果，表明尾靜脈注射更利于材料靶向聚集于腫瘤區(qū)域，減少對健康眼組織的影響，安全性更佳。

圖6. PPT治療后體內(nèi)安全性評估。（A）不同濃度MCNs/Ln/GD/FR NPs的溶血實(shí)驗(yàn)；（B）不同處理周期小鼠主要器官的H&E染色圖；（C）治療一個月后各組織中Y元素的ICP分析結(jié)果；（D）注射后第0、15和30天小鼠血清生化指標(biāo)分析；（E）MCNs/Ln/GD/FR（IV）與（IVT）組眼組織的TUNEL染色圖（R：視網(wǎng)膜，T：腫瘤）

（8）MCNs/Ln/GD/FR納米?？赡艿目鼓[瘤機(jī)制

為探究MCNs/Ln/GD/FR NPs抑制黑色素瘤生長的機(jī)制，采用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）對MCNs/Ln/GD/FR組與PBS組小鼠來源的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分析。共收集PBS組9650個細(xì)胞，MCNs/Ln/GD/FR組7361個細(xì)胞（圖7A–C）。通過主成分分析，識別出8類腫瘤細(xì)胞亞群。熱圖顯示光熱治療激活了熱休克蛋白（HSP）相關(guān)通路，治療組中HSP表達(dá)顯著下調(diào)，提示GA發(fā)揮抑制熱耐受和促進(jìn)凋亡的作用（圖7D, E）。PHLDA1?腫瘤細(xì)胞在治療組比例增至21.3%（PBS組為5.3%）（圖7F），其基因表達(dá)軌跡中PHLDA1表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)（圖7G），提示其與抗藥性逆轉(zhuǎn)及療效提升相關(guān)。GO與KEGG富集分析顯示其參與“氧化應(yīng)激反應(yīng)”“TNF產(chǎn)生正調(diào)控”等，暗示通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、下調(diào)抑凋亡蛋白促進(jìn)凋亡與抗腫瘤活性。CIBERSORT結(jié)合TCGA-UVM數(shù)據(jù)庫結(jié)果進(jìn)一步表明，高PHLDA1表達(dá)與T分期、M分期降低和更佳預(yù)后相關(guān)（圖7I–N），表明PHLDA1?細(xì)胞比例升高有助于提升總生存率。綜上，MCNs/Ln/GD/FR NPs通過激活抑瘤信號通路、抑制增殖與分化相關(guān)基因，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化并提高對DOX的敏感性，發(fā)揮顯著抗腫瘤活性。

圖7. PBS組與MCNs/Ln/GD/FR組在黑色素瘤中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。（A–C）識別出的8個特征性細(xì)胞亞群；（D）熱休克蛋白相關(guān)編碼基因的表達(dá)；（E）不同細(xì)胞亞群中HSP相關(guān)蛋白的變化；（F）兩組間各細(xì)胞亞群占比；（G）PHLDA1陽性細(xì)胞富集水平及PHLDA1基因表達(dá)水平對生存率的影響；（H）MCNs/Ln/GD/FR組中PHLDA1?與PHLDA1?腫瘤細(xì)胞的差異表達(dá)前20位基因；（I–L）PHLDA1表達(dá)與臨床分期的關(guān)聯(lián)，包括T分期、N分期、M分期及整體分期分布；（M, N）不同PHLDA1表達(dá)組的Kaplan-Meier生存分析