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研究背景：

為此研究人員該研究設(shè)計(jì)了一種名為PRIZE的P53修復(fù)納米系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于病毒模擬納米結(jié)構(gòu)，用于將p53 mRNA和Zn（II）遞送至腫瘤細(xì)胞，通過恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)P53水平來馴化腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)其免疫原性。PRIZE確保精確遞送至腫瘤部位，利用其生物礦物化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定p53 mRNA，并延長(zhǎng)P53的半衰期。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)，PRIZE可以有效地修復(fù)4T1（P53缺陷型）和MC38（P53突變型）細(xì)胞中的P53異常，隨后上調(diào)腫瘤細(xì)胞上主要組織相容性復(fù)合物（MHC）I類分子和表面共刺激分子CD80的表達(dá)，增強(qiáng)抗原呈遞，并將腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為原位抗原庫(kù)。共同遞送的Photothermal劑（ICG）在激光照射下可以觸發(fā)免疫原性細(xì)胞死亡，有效釋放腫瘤相關(guān)抗原，并誘導(dǎo)原位癌癥疫苗（ISCVs）的形成。重要的是，在P53異常腫瘤小鼠模型中，誘導(dǎo)的ISCVs啟動(dòng)癌癥免疫循環(huán)（CIC），表現(xiàn)出卓越的腫瘤殺傷免疫力和有效阻止腫瘤轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)，這為推進(jìn)個(gè)性化癌癥免疫治療提供了寶貴見解。該文章于2025年2月18日以《Restoring Tumor Cell Immunogenicity Through Ion-Assisted p53 mRNA Domestication for Enhanced In Situ Cancer Vaccination Effect》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202500825）。

研究示意圖

（1）P53修復(fù)納米系統(tǒng)的合成與表征

為了有效修復(fù)P53異常，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種基于病毒模擬納米結(jié)構(gòu)的P53恢復(fù)納米系統(tǒng)PRIZE。該系統(tǒng)的核心由負(fù)載p53 mRNA和ICG的ZIF-90納米顆粒組成，稱為Z@R@I，其尺寸為177.6±14.7 nm，zeta電位為-6.5±1.9 mV，具有與ZIF-90相同的菱形十二面體結(jié)構(gòu)（圖1a, b）。透射電子顯微鏡（TEM）映射分析證實(shí)了Z@R@I中N、O、Zn和P元素的存在，驗(yàn)證了mRNA的有效負(fù)載（圖1c）。紫外-可見光譜在784 nm處的吸收峰證實(shí)了ICG的成功封裝（圖1d）。此外，ZIF-90通過其仿生礦化功能顯著延長(zhǎng)了p53 mRNA的穩(wěn)定性至7天（圖1e）。在5 mM ATP作用下，Z@R@I納米顆粒能夠完全分解，mRNA釋放率為96%，Zn（II）釋放率為97.5%，ICG釋放率為98%，證實(shí)了其良好的ATP響應(yīng)性及藥物釋放效率（圖1f）。隨后，通過紅細(xì)胞膜（RBCM）涂覆，形成RBCM-Z@R@I，其粒徑增加到203.6±15.2 nm，zeta電位顯著降低到-23.4±2.3 mV（圖1b）。進(jìn)一步通過脂質(zhì)插入法將腫瘤靶向肽cRGD和溶酶體逃逸肽L17E引入，形成PRIZE，其粒徑達(dá)到212.6±12.6 nm，zeta電位為-16.8±0.9 mV，且TEM顯示PRIZE具有明顯的膜結(jié)構(gòu)（圖1a）。最后，通過測(cè)量在808 nm近紅外激光照射下的溫度變化，評(píng)估了PRIZE的光熱轉(zhuǎn)換能力及其誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的潛力，結(jié)果表明PRIZE具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換性能（圖1j）。

圖1 P53修復(fù)納米系統(tǒng)的合成與表征。（a）Z@R@I和PRIZE的TEM圖像；（b）RBCM、Z@R@I、RBCM-Z@R@I和PRIZE的尺寸和zeta電位（n=3）；（c）Z@R@I的TEM元素映射分析（Zn、O、N、P），比例尺50 nm；（d）游離ICG和Z@R@I的紫外可見吸收光譜；（e）4°C下Z@R@I中p53 mRNA的毛細(xì)管電泳穩(wěn)定性分析；（f）不同ATP濃度（0、2、5 mM）下Z@R@I的體外mRNA、Zn(II)和ICG釋放速率（n=3）；（g）PRIZE體內(nèi)示意圖；（h）尾靜脈注射不同配方的Cy5標(biāo)記p53 mRNA后，小鼠各器官（含腫瘤）的Cy5熒光定量（n=3）；（i）不同配方的Cy5標(biāo)記p53 mRNA在小鼠體內(nèi)的循環(huán)概況；（j）808 nm激光照射（2.0 W cm?2）下，鹽水或PRIZE處理的小鼠腫瘤溫度變化（n=3）；（k）PRIZE在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的示意圖；（l）PRIZE處理后4T1細(xì)胞中Zn(II)含量的ICP-MS分析（n=3）；（m）PRIZE或LNP@p53 mRNA處理4T1細(xì)胞4小時(shí)后，Western印跡分析WT P53表達(dá)（n=3）

（2）PRIZE通過馴化腫瘤細(xì)胞以恢復(fù)其免疫原性，將其轉(zhuǎn)化為原位抗原庫(kù)

WT P53通過MHC I途徑直接促進(jìn)抗原呈遞基因（B2M、Erap1、Tap1、H2-K1）和共刺激分子CD80的上調(diào)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性（圖2a）。實(shí)驗(yàn)中，通過qRT-PCR和免疫熒光分析驗(yàn)證了PRIZE處理后4T1細(xì)胞中這些基因的顯著上調(diào)（圖2b），以及CD80表達(dá)的顯著增加（圖2d）。此外，PRIZE處理的4T1-OVA細(xì)胞成功呈遞了異源MHC I結(jié)合肽SIINFEKL，而對(duì)照組未觀察到此現(xiàn)象（圖2c）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，PRIZE（luc）處理的4T1腫瘤荷瘤小鼠在腫瘤部位表現(xiàn)出更高的熒光素酶表達(dá)，證實(shí)了其高效的蛋白質(zhì)表達(dá)能力（圖2e-g）。進(jìn)一步的免疫熒光結(jié)果顯示，PRIZE處理組小鼠中P53、MHC I分子和CD80的表達(dá)顯著增加，而PD-L1表達(dá)降低（圖2h-k）。這些結(jié)果表明PRIZE通過修復(fù)P53異常，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的免疫原性，將其轉(zhuǎn)化為原位抗原庫(kù)，為T細(xì)胞識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。

圖2 通過PRIZE馴化恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的免疫原性。（a）WT P53將腫瘤細(xì)胞馴化為高免疫原性抗原庫(kù)的示意圖；（b，c）qRT-PCR顯示不同處理后4T1細(xì)胞中抗原呈遞基因的誘導(dǎo)；（c）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理后4T1-OVA細(xì)胞表面MHC-SIINFEKL的平均熒光強(qiáng)度（MFI，n=3）；（d）處理后4T1細(xì)胞的免疫熒光圖像及細(xì)胞表面CD80的免疫熒光染色定量分析；（e）4T1腫瘤小鼠靜脈注射PRIZE（Luc）后不同時(shí)間點(diǎn)的體內(nèi)生物發(fā)光成像及48小時(shí)后不同器官的生物發(fā)光圖像；（f）4T1腫瘤中不同時(shí)間點(diǎn)的生物發(fā)光定量（n=3）；（g）不同器官的生物發(fā)光定量（n=3）；（h-k）4T1腫瘤接受指定治療后，WT P53、MHC I、CD80和PD-L1表達(dá)的免疫熒光染色代表性圖像及定量分析

（3）光熱觸發(fā)的ISCVs形成

非侵入性光療法（包括PTT和光動(dòng)力療法）為開發(fā)穩(wěn)健的原位疫苗（ISCVs）提供了機(jī)會(huì)（圖3a）。實(shí)驗(yàn)中，通過與PRIZE共遞送ICG到腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過NIR照射（43°C，5分鐘）后細(xì)胞存活率僅為13.6%，顯示出優(yōu)異的免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）療效（圖3b）。ICD與損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的釋放相關(guān)，可刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)并觸發(fā)ISCVs形成。體外實(shí)驗(yàn)表明，PRIZE+NIR顯著誘導(dǎo)4T1細(xì)胞發(fā)生ICD并釋放DAMPs，如CRT暴露、HMGB1和ATP釋放（圖3c, d）。此外，將BMDCs與PRIZE+NIR預(yù)處理的4T1細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著提高DCs的成熟度（圖3e, f）。

細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的核心效應(yīng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中，將CD8+ T細(xì)胞與由PRIZE+NIR處理的4T1細(xì)胞成熟的BMDCs共培養(yǎng)，顯著增加了CD8+GZMB+細(xì)胞的百分比（43.3%），并顯著提高了TNF-α和IL-12p70的水平，表明CD8+ T細(xì)胞功能的激活（圖3g, h, i）。形態(tài)學(xué)檢查顯示，PRIZE+NIR組中許多細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞焦亡形態(tài)（圖3j），表明PTT成功觸發(fā)了PRIZE預(yù)處理腫瘤細(xì)胞中抗原的釋放，形成ISCVs，并誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

PTT可能通過增加血氧水平和破壞物理屏障來增強(qiáng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。激光血流成像顯示NIR照射增加了小鼠的血流速度，光聲成像表明4T1腫瘤組織中的血氧含量升高（圖3k, l）。此外，H&E染色證實(shí)NIR治療后腫瘤組織內(nèi)松散區(qū)域的擴(kuò)張（圖3m），表明PTT對(duì)物理屏障的破壞作用。這些發(fā)現(xiàn)為通過PRIZE+NIR在體內(nèi)有效激活免疫反應(yīng)和實(shí)現(xiàn)強(qiáng)大的抗腫瘤效果奠定了基礎(chǔ)。

圖3 PRIZE+NIR引發(fā)ISCV的形成。（a）NIR加速ISCV形成示意圖；（b）PZE、PRZE、PRIZE和PRIZE+NIR（43°C，5分鐘）處理4T1細(xì)胞24小時(shí)后的細(xì)胞相對(duì)活力；（c）不同處理后4T1細(xì)胞中CRT和HMGB1的免疫熒光圖像；（d）不同處理后4T1細(xì)胞的細(xì)胞外ATP濃度（n=3）；（e）BMDC成熟和CD8+ T細(xì)胞活化示意圖；（f）4T1細(xì)胞與BMDC共培養(yǎng)24小時(shí)后成熟BMDC的流式細(xì)胞術(shù)定量（n=3）；（g）與上述BMDC共培養(yǎng)后活化CD8+ T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)定量（n=3）；（h，i）T細(xì)胞與成熟BMDC（CD80+ CD86+）共培養(yǎng)24小時(shí)后，通過ELISA檢測(cè)TNF-α（h）和IL-12p70（i）的產(chǎn)生（n=3）；（j）Cell Tracker? DiI標(biāo)記的活化CD8+ T細(xì)胞攻擊4T1細(xì)胞的代表性圖像（n=3）；（k）NIR照射前后小鼠腫瘤部位的血液灌注圖像及定量（n=3）；（l）NIR前后4T1腫瘤的PA成像及平均sO?的量化（n=3）；（m）NIR前后4T1腫瘤的H&E染色

（4）ISCVs在雙側(cè)4T1腫瘤模型中的治療功效

通過雙側(cè)BALB/C腫瘤模型評(píng)估了ISCVs的抗腫瘤效果。當(dāng)原發(fā)腫瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)，小鼠分為四組（每組8只），分別接受生理鹽水、PIZE+NIR、PRIZE或PRIZE+NIR處理，每三天靜脈注射一次，共五次。對(duì)于PIZE+NIR或PRIZE+NIR組，在注射后24小時(shí)對(duì)右側(cè)（原發(fā)）腫瘤進(jìn)行額外的激光照射（43°C，5分鐘）（圖4a）。結(jié)果顯示，PRIZE治療或PIZE+NIR治療單獨(dú)抑制了4T1腫瘤的雙側(cè)生長(zhǎng)，但PRIZE+NIR治療效果更優(yōu)，從個(gè)體生長(zhǎng)曲線和平均腫瘤體積中可以看出（圖4b）。接受聯(lián)合治療的小鼠中約75%存活，而其他組小鼠在60天內(nèi)死亡（圖4c）。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了修復(fù)P53異常以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性的重要性。

PRIZE+NIR顯著促進(jìn)了DC成熟，增加了原發(fā)和遠(yuǎn)處腫瘤中CD3+CD8+ T細(xì)胞和CD8+GZMB+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖4d, e）。此外，PRIZE+NIR處理組在遠(yuǎn)端腫瘤、淋巴結(jié)、脾臟和周圍血液中產(chǎn)生更高比例的CD3+CD8+ T細(xì)胞（圖4f）。RNA測(cè)序顯示，PRIZE+NIR治療的腫瘤組織中p53和免疫激活相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，免疫細(xì)胞類型發(fā)生改變，包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞和活化DCs（圖4g）。與TAMs（M1和M2）、MDSCs和Tregs相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化，重塑了免疫抑制的TME。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，PRIZE+NIR組中MDSCs和Tregs比例顯著降低，M1/M2比率增加（圖S24b）。體內(nèi)結(jié)果表明，PRIZE+NIR通過激發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)TME，顯著增強(qiáng)了ISCVs的療效（圖4h）。

圖4 ISCVs在雙側(cè)4T1腫瘤模型中的治療效果。（a）雙側(cè)BALB/c腫瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖；（b）原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處腫瘤的個(gè)體腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)（每3天記錄一次）；（c）各組生存曲線（n=8）；（d）不同組小鼠原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處腫瘤中CD3+ CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)百分比（n=3）；（e）原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處腫瘤中CD8+ GZMB+ T細(xì)胞的免疫熒光分析；（f）不同組小鼠淋巴結(jié)、血液和脾臟中CD3+ CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)百分比（n=3）；（g）小鼠原發(fā)性腫瘤組織經(jīng)生理鹽水、PRIZE+NIR處理后，免疫細(xì)胞類型相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組分析差異基因聚類熱圖（n=3）；（h）PTT與PRIZE馴化協(xié)同激活CIC并增強(qiáng)ISCV療效的示意圖

（5）通過PRIZE+NIR抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)

為了評(píng)估PRIZE+NIR在治療腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)方面的潛力，研究者建立了相關(guān)模型并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在4T1腫瘤攜帶小鼠中，PRIZE+NIR顯著減少了肺部轉(zhuǎn)移腫瘤負(fù)荷，肺重量接近正常水平（圖5a, b），且H&E染色顯示PRIZE+NIR組肺部轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)量減少了約60%（圖5c, d）。此外，PRIZE+NIR處理的血清中IFN-γ和TNF-α水平最高（圖5e, f），表明其優(yōu)化的抗腫瘤免疫反應(yīng)。通過IVIS Lumina II成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)PRIZE+NIR顯著增加了外周血和脾臟中效應(yīng)記憶T細(xì)胞（T EM）和中央記憶T細(xì)胞（T CM）的比例（圖5g-j），小鼠存活率顯著提高至70%（圖5k），突出了其在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和延長(zhǎng)生存時(shí)間方面的潛力。

進(jìn)一步的腫瘤復(fù)挑戰(zhàn)模型實(shí)驗(yàn)表明，PRIZE+NIR治療的小鼠在復(fù)挑戰(zhàn)后4T1腫瘤完全消退（圖5l, m），且外周血和脾臟中記憶T細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖5n, o），顯示出強(qiáng)大的長(zhǎng)期免疫記憶效應(yīng)，有效防止腫瘤復(fù)發(fā)。這些結(jié)果表明PRIZE+NIR在激活持久免疫記憶效應(yīng)方面的重要性。

圖5 預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的長(zhǎng)期記憶效應(yīng)。（a）4T1 轉(zhuǎn)移模型中 PRIZE+NIR 觸發(fā)癌癥免疫療法的示意圖；（b）研究結(jié)束時(shí)小鼠肺重量（n=5）；（c）肺組織 H&E 染色圖像；（d）肺轉(zhuǎn)移節(jié)點(diǎn)量化（n=5）；（e, f）ELISA 測(cè)定血清中 IFN-γ 和 TNF-α 水平（n=5）；（g, h）4T1 轉(zhuǎn)移模型小鼠血液和脾臟中 T EM 和 T CM 的流式細(xì)胞術(shù)分析（n=3）；（i, j）T EM 和 T CM 的百分比（n=3）；（k）4T1 肺轉(zhuǎn)移小鼠總生存率（n=8）；（l）PRIZE+NIR 介導(dǎo)的 4T1 腫瘤模型預(yù)防復(fù)發(fā)方案；（m）腫瘤生長(zhǎng)曲線；（n, o）不同治療后小鼠血液和脾臟中 T EM 和 T CM 的百分比（n=3）

（6）PRIZE+NIR對(duì)P53突變MC38結(jié)直腸癌腫瘤模型的抗腫瘤療效

在P53突變的MC38腫瘤C57BL/6小鼠模型中，PRIZE+NIR治療顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)并實(shí)現(xiàn)了腫瘤完全清除（圖6a, b）。免疫熒光驗(yàn)證了NIR誘導(dǎo)的I型細(xì)胞死亡（ICD），表現(xiàn)為顯著的CRT外化和HMGB1轉(zhuǎn)位（圖6c）。治療后，免疫熒光圖像顯示CD8+ T細(xì)胞的激活增強(qiáng)（圖6d），流式細(xì)胞術(shù)分析表明腫瘤組織中T細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著增加（圖6e, f），且CD8+GZMB+和CD8+IFN-γ+ T細(xì)胞群體顯著增加（圖6g, h），表明PRIZE+NIR增強(qiáng)了CD8+ T細(xì)胞的抗腫瘤活性。生存曲線分析顯示，PRIZE+NIR治療將MC38結(jié)直腸癌小鼠的存活率提高到60%（圖6i），突顯了其強(qiáng)大的抗腫瘤療效。這些結(jié)果表明P53修復(fù)策略在p53突變腫瘤模型中具有顯著的治療潛力。

圖6 PRIZE+NIR 對(duì) p53 突變腫瘤的抑制作用。（a）MC38 腫瘤模型中 PRIZE+NIR 引發(fā)的癌癥免疫療法示意圖；（b）腫瘤生長(zhǎng)曲線（n=8）；（c）代表性免疫熒光圖像，顯示不同處理后腫瘤中 CRT 和 HMGB1 的表達(dá)；（d）不同處理后腫瘤中 CD8?GZMB? T 細(xì)胞和 CD4?Foxp3? T 細(xì)胞的免疫熒光分析；（e, f）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理后腫瘤中浸潤(rùn)的 CD3?CD8? T 細(xì)胞和 CD3?CD4? T 細(xì)胞（n=3），并進(jìn)行定量分析；（g, h）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并量化不同處理后腫瘤中 CD8?GZMB? T 細(xì)胞和 CD8?IFN-γ? T 細(xì)胞的表達(dá)水平（n=3，代表性門控策略見圖S30）；（i）不同處理后 MC38 腫瘤 C57BL/6 小鼠的總生存率（n=8）