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針對(duì)上述問(wèn)題，上海交通大學(xué)詹維偉團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了pDA-mBP@DAT復(fù)合支架，整合生物相容性、壓電響應(yīng)性和可控降解性，實(shí)現(xiàn)對(duì)LIPUS的多模態(tài)響應(yīng)。研究重點(diǎn)是LIPUS與支架的協(xié)同作用機(jī)制，包括LIPUS誘導(dǎo)的溫升和微電流對(duì)成骨分化的影響，以及Piezo1離子通道通過(guò)Ca2?/p-CaMKII通路調(diào)控成骨標(biāo)志物表達(dá)的分子機(jī)制。同時(shí)開(kāi)發(fā)了基于掌上超聲設(shè)備的無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)骨再生過(guò)程的動(dòng)態(tài)評(píng)估。最終目標(biāo)是建立“材料 - 物理刺激 - 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)”一體化的骨再生治療方案。該成果于2025年1月21日以《Low - Intensity Pulsed Ultrasound Responsive Scaffold Promotes Intramembranous and Endochondral Ossification via Ultrasonic, Thermal, and Electrical Stimulation》為題發(fā)表于《ACS NANO》。（DOI：10.1021/acsnano.4c13357)。

圖1 pDA - mBP@DAT支架設(shè)計(jì)及促進(jìn)LIPUS動(dòng)態(tài)刺激和掌上超聲診斷設(shè)備監(jiān)測(cè)的膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化的研究示意圖

（1）LIPUS響應(yīng)支架的合成與表征

mBP納米片的TEM圖像顯示其典型尺寸和0.33nm的晶格間距（圖2A、B），選區(qū)衍射圖證實(shí)其單晶格結(jié)構(gòu)（圖2C）。AFM圖像顯示mBP厚度約為10 - 15nm（圖2D、E）。EDS光譜表明C、N、O、P元素共存（圖2F）。FTIR光譜顯示PDA包覆后羥基的N - H/OH伸縮振動(dòng)特征譜帶（圖2G）。STEM - EDX和元素映射表明C、N、O、P元素在納米片上分布良好，證實(shí)pDA修飾成功（圖2H）。SEM圖像顯示DAT和pDA - mBP@DAT支架具有多孔結(jié)構(gòu)（圖2J）。酶促降解后，pDA - mBP@DAT支架的重量損失（82.5±5.4%）低于DAT支架（92.4±1.8%），表明其穩(wěn)定性更好（圖2K）。

圖2 mBP、pDA - mBP納米片和pDA - mBP@DAT支架的表征。（a）mBP納米片的TEM圖像和厚度；（b）mBP納米片的選區(qū)衍射；（c）mBP納米片的AFM圖像和高度；（d）pDA - mBP納米片的EDS光譜；（e）mBP和pDA - mBP納米片的FTIR光譜；（f）pDA - mBP納米片的STEM - EDX和元素映射表征；（g）不同濃度DAT和pDA - mBP@DAT支架的照片圖像；（h）DAT和pDA - mBP@DAT支架的SEM圖像；（i）DAT和pDA - mBP@DAT支架酶促降解后的重量損失百分比

pDA - mBP@DAT支架在LIPUS刺激下溫度升高（圖3A），溫度隨LIPUS強(qiáng)度和支架濃度增加而上升（圖3B、C）。100μg/mL的pDA - mBP@DAT支架在0.1、0.2和0.5W的LIPUS強(qiáng)度下溫升分別約為1.2、2.4和3.5°C（圖3B）；0.1W強(qiáng)度下，濃度為0和50 μg/mL的支架溫升較小，分別為0.3和0.5°C，而濃度為100、200和400 μg/mL時(shí)，最大溫升約為1°C（圖3C）。LIPUS可引起pDA - mBP@DAT支架輕微溫升，有助于骨缺損修復(fù)。壓電響應(yīng)力顯微鏡（PFM）證實(shí)了pDA - mBP的壓電效應(yīng)，其振幅和相位模式圖像顯示電壓隨尖端位移變化（圖3D、F、H、J），且在局部施加電場(chǎng)時(shí)呈現(xiàn)典型壓電振幅和相位曲線（圖3E、G、I、K），pDA - mBP@DAT的更高振幅蝶形環(huán)更顯著地證明了其壓電特性。

圖3 pDA - mBP@DAT支架的壓電性能及LIPUS誘導(dǎo)的溫升。（a）不同強(qiáng)度LIPUS刺激下支架的溫升；（b）濃度固定時(shí)不同強(qiáng)度LIPUS刺激下支架的溫升；（c）不同濃度支架在固定LIPUS刺激下的溫升；（d）pDA - mBP納米片的PFM振幅；（e）pDA - mBP納米片的壓電響應(yīng)振幅曲線；（f）pDA - mBP納米片的相位像；（g）pDA - mBP納米片的壓電響應(yīng)相位曲線；（h）pDA - mBP@DAT支架的PFM振幅；（i）pDA - mBP@DAT支架的壓電響應(yīng)振幅曲線；（j）pDA - mBP@DAT支架的相位圖像；（k）pDA - mBP@DAT支架的壓電響應(yīng)相位曲線

（2）LIPUS響應(yīng)支架的生物相容性、生物降解性和成骨潛力

CCK - 8試劑盒評(píng)估細(xì)胞在不同濃度支架上的增殖情況，第1天各組細(xì)胞增殖率一致，第3、5、7天0.2 μg/mL pDA - mBP@DAT支架細(xì)胞增殖率降低，0.1 μg/mL pDA - mBP@DAT支架細(xì)胞增殖率略有升高，0.2 μg/mL pDA - mBP@DAT存在細(xì)胞毒性（圖4A），0.1 μg/mL pDA - mBP@DAT組細(xì)胞相容性更好?；罴?xì)胞和死細(xì)胞染色顯示第1、3、5天細(xì)胞數(shù)量增加，未發(fā)現(xiàn)明顯死細(xì)胞（圖4B），pDA - mBP@DATLIPUS組活細(xì)胞數(shù)量最多，無(wú)細(xì)胞毒性，LIPUS可能促進(jìn)細(xì)胞增殖。LIPUS實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：強(qiáng)度0.1W/cm2，頻率1MHz，占空比50%，37℃，10min/d。Transwell板實(shí)驗(yàn)顯示pDA - mBP@DAT組遷移細(xì)胞數(shù)量略高于對(duì)照組和DAT組，pDA - mBP@DATLIPUS組遷移數(shù)量最高（圖4C、D）。掃描電鏡觀察到LIPUS刺激下BMSCs在支架上附著牢固且鋪展良好（圖4F）。茜素紅染色顯示pDA - mBP@DATLIPUS組礦化程度最高（圖4E），礦物質(zhì)沉積明顯高于其他組。免疫熒光染色檢測(cè)RunX2和OPN的表達(dá)，LIPUS刺激后pDA - mBP@DATLIPUS組在第14和第21天RunX2和OPN表達(dá)水平最高（圖4G），其表達(dá)升高與BMSCs的遷移、黏附和成骨分化相關(guān)，LIPUS刺激下的pDA - mBP@DAT支架可促進(jìn)BMSCs的這些過(guò)程。

圖4 在LIPUS刺激下，pDA - mBP@DAT支架促進(jìn)細(xì)胞遷移、附著和成骨分化。（a）不同濃度支架上BMSCs的CCK8定量分析；（b）共培養(yǎng)后活/死染色；（c）Transwell實(shí)驗(yàn)中遷移BMSCs的結(jié)晶紫染色圖像；（d）遷移細(xì)胞數(shù)量定量分析；（e）共培養(yǎng)后茜素紅染色及統(tǒng)計(jì)分析；（f）BMSCs在支架上的附著情況和形態(tài)；（g）第14天和第21天的免疫熒光染色

（3）通過(guò)超聲成像動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)LIPUS響應(yīng)支架的體內(nèi)成骨作用

利用超聲（圖5）和顯微CT成像（圖6）評(píng)估pDA - mBP@DAT支架在LIPUS下的體內(nèi)成骨效果。顱骨缺損的SD大鼠分為對(duì)照組、DAT組、pDA - mBP@DAT組和pDA - mBP@DATLIPUS組，LIPUS刺激參數(shù)為：頻率1MHz，強(qiáng)度0.1W/cm2，占空比50%，每天20min，持續(xù)8周。掌上超聲診斷設(shè)備每周動(dòng)態(tài)評(píng)估骨缺損距離，持續(xù)12周（圖5A）。DAT和pDA - mBP@DAT支架可完全填充大鼠顱骨缺損（圖5B）。超聲成像顯示各組缺損區(qū)域最大距離每周縮?。▓D5C）。8周時(shí)，對(duì)照組顱骨缺損縮短距離較小，其他三組缺損間隙明顯縮小，pDA - mBP@DATLIPUS組修復(fù)短距離骨效果最佳（圖5C、D）。

圖5 動(dòng)態(tài)LIPUS刺激和超聲成像監(jiān)測(cè)pDA-mBP@DAT支架促進(jìn)體內(nèi)骨再生。（A）LIPUS刺激和體內(nèi)動(dòng)態(tài)超聲成像流程示意圖；（B）對(duì)照組和pDA-mBP@DAT植入組的手術(shù)圖像；（C）在預(yù)定周數(shù)通過(guò)掌上超聲診斷設(shè)備動(dòng)態(tài)評(píng)估的骨缺損距離（G1：對(duì)照組；G2：DAT組；G3：pDA-mBP@DAT組；G4：pDA-mBP@DATLIPUS組）；（D）對(duì)掌上超聲診斷設(shè)備評(píng)估的骨缺損距離進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

在預(yù)定間隔取樣后進(jìn)行了micro-CT成像評(píng)估，其三維重建（圖6A）證實(shí)pDA-mBP@DATLIPUS組成骨誘導(dǎo)效果最佳，且其冠狀切面顯示超聲成像監(jiān)測(cè)可替代micro-CT掃描（圖6A）。四組間差異可通過(guò)未修復(fù)骨區(qū)域示意圖清晰顯示（圖6B）。定量參數(shù)分析（圖6C-E）表明，pDA-mBP@DATLIPUS組骨體積（BV）最高（圖6D），第12周時(shí)DAT負(fù)載組的骨體積/總體積（BV/TV）分別為35.67%±7.02%、67.67%±5.51%、83.33%±5.13%（圖6E）。結(jié)果表明pDA-mBP、DAT和LIPUS協(xié)同促進(jìn)骨再生，其中LIPUS是關(guān)鍵因素，可直接作用于細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，也能通過(guò)刺激pDA-mBP@DAT支架間接產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。

圖6 顯微CT成像評(píng)估pDA-mBP@DATLIPUS促進(jìn)骨再生的效果。（A）顯微CT圖像的三維重建（上圖）和冠狀切面（下圖）顯示了預(yù)定周數(shù)的骨缺損情況；（B）四個(gè)不同組別的骨未修復(fù)區(qū)域示意圖；（C-E）顯微CT參數(shù)的定量分析，包括（C）骨礦物質(zhì)密度（BMD）、（D）骨體積（BV）和（E）骨體積/總體積（BV/TV）

（4）Piezo1在促進(jìn)LIPUS響應(yīng)支架誘導(dǎo)的骨再生中的重要作用

H&E染色（圖7A）和Masson三色染色（圖7B）結(jié)果表明，pDA-mBP@DATLIPUS組膠原蛋白和新骨形成量較多，且所有支架均在8周后完全降解。定量分析H&E染色陽(yáng)性面積百分比、膠原蛋白面積百分比、Masson三色染色新骨面積百分比（圖7C-E）顯示，pDA-mBP@DATLIPUS組骨修復(fù)促進(jìn)率最高，表明在LIPUS刺激下，pDA-mBP@DAT支架能夠促進(jìn)骨修復(fù)。

圖7 pDA-mBP@DATLIPUS加速骨再生的效果評(píng)價(jià)。（A）4、8、12周取樣后骨缺損的H&E染色；（B）8、12周取樣后骨缺損的Masson三色染色；（C-E）定量分析，包括（C）H&E染色陽(yáng)性面積/總面積、（D）膠原面積/總面積和（E）Masson三色染色新骨面積/總面積

Col-I是骨基質(zhì)主要蛋白，可激活ERK1/2信號(hào)通路等促進(jìn)成骨分化。LIPUS刺激和基于BP的水凝膠能改善Col-I表達(dá)，Col-II是軟骨ECM主要成分，參與調(diào)節(jié)BMSCs成骨作用。骨膜素在骨重塑和修復(fù)中起關(guān)鍵作用，特異性表達(dá)于骨膜且對(duì)機(jī)械應(yīng)力敏感。免疫組織化學(xué)染色顯示，第4和第8周，pDA-mBP@DATLIPUS組Col-I（圖8A）和Col-II表達(dá)較多，表明其軟骨內(nèi)骨化水平高；第4周，對(duì)照組有骨膜素表達(dá)，DAT和pDA-mBP@DAT支架中表達(dá)較多但程度不一，pDA-mBP@DATLIPUS組表達(dá)最高，第8周，該組新骨邊緣骨膜素表達(dá)最明顯，且其膜內(nèi)骨化更明顯（圖8B）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，第8和第12周，pDA-mBP@DATLIPUS組OCN和OPN表達(dá)最高（圖8C），證實(shí)pDA-mBP@DAT在LIPUS刺激下促進(jìn)骨愈合。pDA-mBP@DATLIPUS組Col-I、骨膜素、OCN、OPN和Col-II高表達(dá)（圖7D-F），有力證明pDA-mBP@DAT和LIPUS在促進(jìn)骨再生方面的作用，且膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨均參與骨修復(fù)過(guò)程（圖7G）。

圖8 pDA-mBP@DATLIPUS強(qiáng)化膜內(nèi)和軟骨內(nèi)成骨作用的免疫組化和免疫熒光染色評(píng)價(jià)。（A）4、8、12周取樣后不同組Col-I的表達(dá)情況，粗箭頭表示新生骨中Col-Ihigh的細(xì)胞，細(xì)箭頭表示再生邊緣中Col-Ihigh的細(xì)胞；（B）4、8周取樣后不同組骨膜蛋白的表達(dá)情況；（C）8、12周不同組OCN表達(dá)情況的免疫熒光染色；（D~F）4組Col-I、骨膜蛋白和OCN相對(duì)表達(dá)量的定量分析

Piezo1能將LIPUS引起的機(jī)械信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)鈣離子，引發(fā)MC3T3-E1細(xì)胞增殖。免疫熒光分析顯示，pDA-mBP@DATLIPUS組支架與新骨邊緣Piezo1表達(dá)高于其他組（圖9A、E），提示Piezo1在pDA-mBP@DAT或LIPUS刺激的骨再生中發(fā)揮作用。Piezo1激活后，鈣離子流入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致下游p-CaMKII顯著上調(diào)，pDA-mBP@DATLIPUS組中p-CaMKII表達(dá)增加，RunX2和CD31免疫熒光增強(qiáng)（圖9B、C、F、G），表明p-CaMKII激活促進(jìn)成骨和血管生成。CD31和α-SMA陽(yáng)性染色共定位表明缺損區(qū)有成熟血管發(fā)育，且pDA-mBP@DATLIPUS組中CD31和α-SMA高表達(dá)（圖9D），說(shuō)明pDA-mBP@DAT支架在LIPUS刺激下促進(jìn)缺損區(qū)血管生成。因此，pDA-mBP@DATLIPUS支架可能通過(guò)激活Piezo1/p-CaMKII通路促進(jìn)血管化骨再生，未來(lái)還需探索其他潛在分子機(jī)制。

圖9 Piezo1、RunX2、p-CaMKII、CD31和α-SMA表達(dá)的免疫熒光染色。（A）第4周和第8周取樣后不同組Piezo1的表達(dá)情況（N：新骨區(qū)域；M：邊緣區(qū)域；S：支架區(qū)域）；（B）第8周p-CaMKII和RunX2表達(dá)的共染色；（C）第8周p-CaMKII和CD31表達(dá)的共染色；（D）第12周α-SMA和CD31表達(dá)的共染色；（E-G）定量分析，E為Piezo1表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度，（F）p-CaMKII表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度，（G）CD31表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度