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針對上述問題，南京大學醫(yī)學院盧光明教授團隊報道了一種多功能納米平臺SPIT探針，用于膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）的SERS引導切除、光熱治療和免疫治療。SPIT探針由AuNS核、拉曼報告層和源自巨噬細胞膜的基因過表達SIRPα變體組成，具有強大獨特的拉曼信號，可實現(xiàn)精準術中腫瘤切除。手術后，其光熱效應可消融殘留微小腫瘤灶，且巨噬細胞膜上SIRPα變體過表達能阻斷CD47-SIRPα通路，增強巨噬細胞介導的腫瘤細胞吞噬作用，結合光熱治療可放大抗腫瘤免疫反應。實驗結果表明，該聯(lián)合療法在原位膠質(zhì)母細胞瘤模型中實現(xiàn)了優(yōu)越的抗腫瘤效果，顯著抑制腫瘤復發(fā)，將小鼠中位生存期延長兩倍以上，為改善GBM治療結果和預防腫瘤復發(fā)帶來希望。該文章于2025年5月19日以《SERS-Guided Precision Resection Combined with Photothermal-Immunotherapy for Glioblastoma Recurrence Prevention》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202425168）。

研究示意圖

（1）SPIT探針的形態(tài)、拉曼和光熱特性

慢病毒載體將編碼突變型SIRPα變體（vSIRPα）的質(zhì)粒轉染入RAW 264.7細胞，增強細胞表面SIRPα蛋白表達。共聚焦成像顯示，RAW 264.7-vSIRPα對CD47的親和力高于野生型RAW 264.7細胞（圖1A）。流式細胞術驗證了RAW 264.7-vSIRPα細胞表面vSIRPα的功能（圖1B）。

40 - 42 AuNSs因尖銳尖端具有優(yōu)異SERS性能被選為SERS基底，MBN分子中的腈基（─C═N）提供獨特拉曼峰，減少樣品基質(zhì)干擾。44 MBN通過Au - S鍵組裝，AuNS/MBN在2228 cm?1處表現(xiàn)出最大峰強度。通過共擠壓工藝將AuNS/MBN包覆上RAW 264.7 - vSIRPα細胞膜，制備SPIT探針。透射電子顯微鏡（TEM）顯示，AuNS/MBN被厚度約4 - 5 nm的巨噬細胞膜成功包覆（圖1C）。AuNSs包覆上RAW 264.7 - vSIRPα細胞膜（SMM）后，zeta電位從 - 27.9 mV變?yōu)?- 28.4 mV，平均直徑從73.6 nm增加到91.1 nm（圖1D）。紫外 - 可見光譜顯示，SMM包覆后，代表縱向局域表面等離子體共振的峰值發(fā)生輕微紅移（4.9 nm）（圖1E）。AuNSs、MBN和SPIT探針的拉曼光譜如圖1H，AuNSs無信號，MBN粉末信號微弱，SPIT探針在相同MBN濃度下信號更強，顯示其作為拉曼成像SERS報告分子的潛力。SPIT探針的拉曼信號在細胞培養(yǎng)基中孵育72小時內(nèi)基本保持一致（圖1I），驗證了拉曼信號在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性。

圖1 SPIT探針的制備與表征。（A，B）免疫熒光分析和流式細胞術分析SIRPα在野生型RAW 264.7細胞和RAW 264.7-vSIRPα細胞中的CD47結合能力，標尺=25 μm；（C）SPIT探針的透射電子顯微鏡（TEM）圖像；（D）動態(tài)光散射分析測量的不同NPs的尺寸分布和zeta電位；（E）水溶液中AuNSs和SPIT探針的紫外-可見吸收光譜；（F）激光照射不同濃度SPIT探針后的溫度升高（PBS，50，100，150和200 μg mL?1）；（G）激光照射不同濃度SPIT探針后的熱圖像；（H）MBN、AuNSs和SPIT探針的拉曼光譜；（I）SPIT探針在血清中孵育72小時后拉曼信號的穩(wěn)定性及2217 cm?1峰強度變化（n=3，785 nm激光，150 mW，5×物鏡，0.5 s積分時間）

（2）SPIT探針的BBB跨越機制和靶向能力

已有研究表明巨噬細胞膜上整合素α4與Mac - 1及內(nèi)皮細胞上ICAM - 1或VCAM - 1相互作用，會觸發(fā)細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應，導致緊密連接（TJ）破壞和肌動蛋白細胞骨架重組，增加BBB通透性，還可激活CAM介導的內(nèi)吞作用。Western blot分析檢測SPIT探針上相關分子存在情況（圖2A），證實整合素α4和Mac - 1在巨噬細胞膜上表達且在SPIT探針上保存完好。使用Transwell系統(tǒng)中體外BBB模型研究SPIT探針跨越BBB能力（圖2B），bEnd.3細胞在上室培養(yǎng)形成完整單層，TEER值超過200Ω·cm2才有效，模型中緊密單層TEER值達300Ω·cm2（圖2C）。通過免疫熒光染色檢測bEnd.3細胞中ZO - 1表達評估SPIT探針引入后TJ破壞情況（圖2D），ZO - 1是與TJ相關蛋白，SPIT組中ZO - 1表達分散且較PBS、AuNS和AuNS/MBN@MM組分別降低2.3、2.1和1.7倍（圖2E），表明SPIT探針降低TJ緊密度，促進其穿過血腦屏障。通過測量治療后12小時下層腔室Au濃度量化SPIT探針穿透效率（圖2F），SPIT探針血腦屏障通透性最高，與PBS、AuNS和AuNS/MBN@MM組相比，穿透效率分別高約211.4、2.6和1.7倍。基于下層腔室中GL261細胞攝取評估SPIT探針腫瘤靶向能力，共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）（圖2G）和流式細胞術分析（圖2H）均顯示，ICG標記的SPIT探針腫瘤細胞靶向效率顯著高于游離ICG、ICG標記的AuNS和ICG標記的AuNS/MBN@MM，這種增強靶向效率可能由vSIRPα過表達介導，與GL261細胞上CD47相互作用。此外，評估SPIT探針在活細胞中SERS成像能力，用SPIT探針孵育4小時后，細胞可通過SERS成像清晰可視化（圖2I），表明其可用于活細胞輪廓可視化。

圖2 SPIT探針的跨血腦屏障（BBB）和靶向能力。（A）Western blot分析顯示RAW 264.7細胞、RAW 264.7-vSIRPα細胞、SMM、AuNS/MBN@MM和SPIT探針中整合素（Integrinα4和Mac-1）的表達；（B）體外血腦屏障模型的示意圖；（C）上室中培養(yǎng)的bEnd.3細胞的CLSM圖像，標尺：100μm；（D）經(jīng)PBS、AuNSs、AuNS/MBN@MM和SPIT探針處理后的bEnd.3細胞的代表性免疫熒光圖像和（E）ZO-1熒光強度的定量，ZO-1呈紅色，細胞核呈藍色，標尺=25μm；（F）與PBS、AuNSs、AuNS/MBN@MM和SPIT探針孵育12小時后，下室中Au的含量；（G）經(jīng)BBB滲透后，GL261細胞中游離ICG、ICG標記的AuNS、ICG標記的AuNS/MBN@MM和ICG標記的SPIT探針積累的代表性CLSM圖像和（H）流式細胞術分析；（I）與SPIT探針孵育12小時后，GL261細胞的明場和SERS圖像

（3）體外抗腫瘤治療效果

CCK - 8法評估SPIT探針在GL261和bEnd.3細胞中的細胞毒性，結果表明其在兩種細胞系中均表現(xiàn)出劑量依賴性的低細胞毒性（圖3A），具有良好的生物相容性。Calcein - AM/PI染色評估經(jīng)SPIT探針和激光照射（SPIT + laser）處理的GL261細胞活力，CLSM成像顯示SPIT + laser組呈現(xiàn)強烈紅色熒光信號，細胞大量死亡，而PBS、僅激光和僅SPIT組主要呈現(xiàn)綠色熒光，細胞活力較高（圖3B）。流式細胞術分析凋亡結果相似（圖3C）。Western blot結果顯示，SPIT + laser組凋亡相關蛋白Bcl - 2下調(diào)，Bax和cleaved Caspase - 3上調(diào)（圖3D），與凋亡流式細胞術分析結果一致，證明SPIT + laser組能顯著誘導腫瘤細胞凋亡，且在激光照射下，GL261細胞的殺傷作用呈劑量依賴性，SPIT探針劑量增加，細胞活力顯著下降（圖3A）。光熱療法（PTT）可誘導腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞死亡（ICD），釋放TAAs和DAMPs。免疫熒光分析和ELISA評估SPIT探針介導的PTT處理后GL261細胞中CRT暴露及HMGB1和ATP分泌情況，結果顯示SPIT + 激光處理顯著上調(diào)CRT表達并增強HMGB1和ATP釋放（圖3E），表明SPIT探針介導的PTT能有效誘導ICD。共培養(yǎng)RAW 264.7細胞和GL261細胞，評估高親和力vSIRPα增強巨噬細胞吞噬功能的能力，CLSM和流式細胞術均顯示高親和力vSIRPα蛋白導致巨噬細胞吞噬能力顯著增加（圖3F）。

圖3 體外治療效力和免疫效力評估。（A）不同濃度下使用SPIT探針處理GL261細胞的相對活力，有或無激光照射，通過CCK - 8測定法確定，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（n=5）；（B）用PBS、激光、SPIT和SPIT + 激光處理的GL261細胞的活/死染色圖像，死細胞用PI染成紅色，活細胞用Calcein - AM染成綠色，標尺=100μm；（C）流式細胞術分析不同處理24小時后的GL261細胞凋亡情況，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（n=3），****p<0.0001；（D）不同處理后GL261細胞中Bax、cleaved Caspase - 3和Bcl - 2表達的Western blot分析；（E）不同處理后GL261細胞中CRT表達的熒光圖像，標尺=25μm；（F）流式細胞術分析（左）和相對定量（右）不同處理后RAW 264.7巨噬細胞對GL261細胞的吞噬情況

（4）靶向效率、SERS 特性及光熱療法在原位膠質(zhì)母細胞瘤異種移植模型中的表現(xiàn)

為評估SPIT探針在體內(nèi)的腫瘤靶向效率，建立了GL261原位膠質(zhì)母細胞瘤小鼠模型。靜脈注射游離ICG、ICG標記的金納米顆粒（AuNSs）和ICG標記的SPIT探針后，在不同時間點進行體內(nèi)熒光成像。結果顯示，游離ICG組在腫瘤部位未檢測到可識別的熒光信號，AuNSs組顯示微弱熒光信號，而SPIT組在腫瘤區(qū)域表現(xiàn)出強烈熒光強度，注射后12小時達到峰值（圖4A）。為分析SPIT探針的生物分布，在小鼠注射后12小時處死，取出大腦和其他主要器官進行離體熒光成像，SPIT組在原位腦腫瘤中顯示出最強熒光信號（圖4B，C），且SPIT探針也在肝臟和脾臟中積聚。這些結果表明SPIT探針具有高腫瘤蓄積性。隨后，在注射后24小時收獲主要器官和腫瘤，通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP - AES）對其Au含量進行定量。

為驗證SPIT探針的腫瘤特異性，在注射后24小時采集腦組織，使用蘇木精和伊紅（H&E）染色及熒光顯微鏡進行分析，結果表明SPIT探針主要定位于GBM腫瘤區(qū)域（圖4D），證明其具有穿過血腦屏障的能力和腫瘤選擇性積累，其在GBM部位的穩(wěn)定SERS信號和高積累效率，凸顯了在手術導航方面的巨大潛力。為驗證基于SPIT探針的圖像引導腫瘤切除術的可行性，使用正立共聚焦拉曼顯微鏡光譜儀收集SERS信號。通過拉曼成像觀察整個完整腫瘤，并在手術切除過程中采用SERS對腫瘤組織去除進行實時監(jiān)測（圖4E，F(xiàn)），發(fā)現(xiàn)手術后強SERS信號的像素數(shù)量逐漸減少。在原發(fā)腫瘤最大切除后，使用SERS掃描手術區(qū)域以檢查殘留的微腫瘤，拉曼成像成功揭示了顯微鏡下無法檢測到的額外殘留微腫瘤信號，對這些殘留微腫瘤病灶的手術切除持續(xù)進行，直到檢測不到拉曼信號，以確保最大程度腫瘤切除。這些結果表明，使用SERS進行圖像引導的手術切除術有助于界定腫瘤邊緣，促進原發(fā)腫瘤切除，并識別術后殘留的微腫瘤。為進一步研究腫瘤邊緣，對切除的組織進行拉曼光譜映射和蘇木精 - 伊紅染色，SERS成像精確地勾勒出了腫瘤與正常組織之間的邊界（圖4G），且透射電子顯微鏡（TEM）證實腫瘤組織中存在大量SPIT探針，而在鄰近的正常組織中未觀察到探針（圖4H），表明拉曼成像策略可有效應用于圖像引導的腫瘤切除術。

最終評估了SPIT探針在體內(nèi)的光熱性能。在治療后12小時，對GL261原位腫瘤小鼠用808 nm激光（0.5 W cm?2）照射5分鐘，結果顯示SPIT探針對腫瘤床產(chǎn)生了良好的光熱效應，照射5分鐘后使其溫度從28.9℃升高到45.0℃（圖4I，J），而對照組在相同條件下僅表現(xiàn)出輕微的溫度升高。

圖4 體內(nèi)SPIT探針的腫瘤蓄積、SERS引導手術和光熱治療。（A）注射游離ICG、ICG標記的AuNS和ICG標記的SPIT探針后，不同時間點GL261膠質(zhì)母細胞瘤小鼠原位腫瘤的實時生物發(fā)光圖像；（B）治療后腫瘤小鼠主要器官（心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和大腦）的熒光圖像；（C）不同主要器官體外熒光成像的半定量結果；（D）包含腫瘤的全腦切片的蘇木精 - 伊紅染色及相應腫瘤切片的熒光圖像，SPIT探針標記ICG（紅色），標尺=1毫米；（E）GBM手術中SERS引導的順序切除示意圖；（F）根據(jù)拉曼信號位置識別腫瘤，依次切除腫瘤，所有腫瘤在肉眼判斷完全切除后，組織中仍檢測到幾個小的拉曼信號焦點（橙色虛線方框所示），繼續(xù)切除直至未檢測到進一步拉曼信號，相應的代表性拉曼光譜（星號符號）展示了SERS引導的GBM切除的連續(xù)階段；（G）一例GBM邊緣的H&E染色和拉曼光譜圖像，虛線表示腫瘤邊緣，比例尺=50μm；（H）GL261原位腫瘤小鼠GBM組織和對側正常腦組織的代表性TEM圖像，顯示腫瘤組織中存在SPIT探針（紅色箭頭），比例尺=50μm；（I）808 nm激光照射后殘留腫瘤腔內(nèi)的紅外熱圖像，顯示溫度變化；（J）照射區(qū)域的相應溫度曲線

（5）原位膠質(zhì)母細胞瘤小鼠模型的治療效果和生物相容性

確定SPIT探針在腫瘤組織中的保留時間和光熱效應后，提出了一種結合SERS圖像引導手術、PTT和免疫治療的多模式腫瘤治療方案（圖5A）。利用表達熒光素酶的GL261腫瘤細胞建立生物發(fā)光原位膠質(zhì)母細胞瘤小鼠模型，腫瘤植入后一周，將小鼠隨機分為六組（每組8只）：G1（對照組）未治療；G2（手術組）無圖像引導的腫瘤切除術；G3（SERS引導手術組）SERS引導手術；G4（SERS引導手術+PTT組）SERS引導手術+PTT；G5（SERS引導手術+免疫治療組）SERS引導手術+免疫治療；G6（SERS引導手術+PTT+免疫治療組）SERS引導手術+PTT+免疫治療。G3和G4組中封裝AuNS/MBN的巨噬細胞膜來自野生型RAW 264.7細胞。G3組手術前12小時接受SPIT探針處理，隨后進行SERS引導的腫瘤切除術；G4組接受相同處理，但在手術期間額外進行808 nm激光照射用于PTT。生物發(fā)光成像監(jiān)測腫瘤生長，結果顯示，對照組腫瘤漸進性生長，手術組最初腫瘤縮小后快速復發(fā)，兩組腫瘤復發(fā)率均為100%（圖5B、C）。與手術組相比，S-surg組因SERS檢測到微觀殘留腫瘤而延遲腫瘤復發(fā)，S-surg+PTT組和S-surg+IT組進一步增強腫瘤抑制效果，分別有50%和37.5%的小鼠觀察到腫瘤復發(fā)，而S-surg+PTT+IT組僅12.5%的小鼠出現(xiàn)腫瘤復發(fā)（圖5D），其總生存期（OS）中位數(shù)超過70天，顯著長于其他組（圖5E）。組織學分析顯示，H&E染色、Ki67免疫熒光和TUNEL檢測表明S-surg+PTT+IT治療最有效地抑制GBM增殖并誘導細胞凋亡（圖5F - H）。PBS組和協(xié)同治療組在白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細胞比容（HCT）、血小板（PLT）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、尿素氮（BUN）或肌酐（Cr）水平方面未觀察到顯著差異，表明無血液學、肝毒性或腎毒性。

圖5 體內(nèi)治療效果。（A）示意圖說明評估不同方案抗復發(fā)療效的治療方案時間線，GL261 - Luc細胞原位接種到C57小鼠腦內(nèi)，第9天生物發(fā)光強度相似的小鼠隨機分配到六個治療組，靜脈注射納米顆粒（NPs），注射后12小時進行膠質(zhì)母細胞瘤切除，手術結束后立即對腫瘤腔進行808 nm激光照射（5分鐘），第12天到第21天每3天進行一次額外的納米顆粒注射和光熱治療；（B）不同治療方案下GL261原位膠質(zhì)母細胞瘤小鼠腫瘤進展的代表性生物發(fā)光圖像，灰色框表示死亡小鼠；（C）原位膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤的定量生物發(fā)光水平，數(shù)據(jù)表示為均值±標準差（n=3），**p<0.01；（D）腫瘤復發(fā)率和（E）Kaplan - Meier生存曲線顯示不同組小鼠的生存情況，數(shù)據(jù)表示為均值±標準差（n=8），**p<0.01；（F）H&E（標尺=2 mm），（G）Ki67（標尺=100μm），和（H）TUNEL（標尺=100μm）染色為不同治療后腫瘤小鼠腦組織切片

（6）體內(nèi)免疫反應研究

治療三周后收集殘余復發(fā)腫瘤組織進行流式細胞術分析，S-surg+PTT+IT組腫瘤部位的DC細胞（CD11c、CD80+和CD86+）數(shù)量高于其他組（圖6A），原因是PTT消融后腫瘤細胞釋放的TAA能募集更多DC細胞，且CD47阻斷增強了巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用并激活先天免疫系統(tǒng)，成熟DC細胞作為APC促進了后續(xù)免疫反應。該組腫瘤部位的CD8+T細胞和CD4+T細胞浸潤顯著增加（圖6B，C），Treg（CD25+、Foxp3+T細胞）百分比下降（圖6D），免疫熒光染色也證實了聯(lián)合治療后CD4+T細胞和CD8+T細胞向腫瘤組織的浸潤增加（圖6E）。此外，ELISA檢測顯示S-surg+PTT+IT組腫瘤組織中IL - 6、TNF - α、IFN - γ和IL - 12分泌顯著增加，而IL - 10分泌減少（圖6F - J），表明該策略在增強腫瘤內(nèi)抗腫瘤淋巴細胞浸潤和減少免疫抑制性淋巴細胞浸潤方面表現(xiàn)出色，實現(xiàn)了強大的抗腫瘤免疫效應，且全身抗腫瘤免疫被激活。

圖6 體內(nèi)免疫應答激活。流式細胞術分析顯示不同治療組腫瘤中（A）CD80+CD86+樹突狀細胞的百分比，（B）CD3+CD8+T細胞的百分比，（C）CD3+CD4+T細胞的百分比，以及（D）CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的百分比；（E）腫瘤組織中CD4+和CD8+T細胞的免疫熒光圖像，標尺=100μm；（F - J）不同治療后檢測到的血清IL - 6、TNF - α、IFN - γ、IL - 10和IL - 12水平，所有數(shù)據(jù)均表示為均值±標準差（n=3）

（7）抗腫瘤治療的機制探索

從接受PBS和S - surg+PTT+IT治療的小鼠體內(nèi)收集腫瘤組織進行轉錄組分析，兩組腫瘤的基因表達譜差異由圖7A中的Venn圖所示，共鑒定出869個差異表達基因，包括632個上調(diào)基因和237個下調(diào)基因（|log?FC|>1.0，P≤0.05）?；鹕綀D（圖7B）展示了DEGs的分布，顯著上調(diào)的基因以紅色表示，下調(diào)的基因以藍色表示。差異表達基因通過基因本體論（GO）分析被歸類為“生物過程”、“細胞組分”和“分子功能”模塊，在細胞粘附、細胞外空間、微絲馬達活性等過程中發(fā)揮關鍵作用。進一步篩選出20個與免疫相關的差異表達基因，包括抗原處理和呈遞相關的CD1B和CALR，細胞因子相關的ADM2、ANGPTL5和AMBN，趨化因子相關的CCL13和CAMP，這些基因在S - surg+PTT+IT組中顯著上調(diào)（圖7C），表明PTT聯(lián)合免疫治療能有效刺激腫瘤組織中的免疫反應。免疫相關基因的京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析顯示，免疫反應的激活主要依賴于細胞因子和炎癥反應、C型凝集素受體信號通路以及細胞色素P450的氧化作用，S - surg+PTT+IT治療有效激活了小鼠的免疫反應，調(diào)節(jié)了免疫抑制性微環(huán)境，增強了膠質(zhì)母細胞瘤免疫治療的療效。RNA - Seq數(shù)據(jù)的KEGG富集分析顯示，S - surg+PTT+IT治療改變了膠質(zhì)母細胞瘤中與HIF - 1α信號通路、MEK/ERK信號通路和PI3K - Akt信號通路等相關的基因表達（圖7D）。Western blot檢測顯示，在S - surg+PTT+IT組中p - MEK和p - ERK水平降低，而MEK、ERK、PI3K、P - AKT和HIF - 1α水平?jīng)]有顯著變化（圖7E），免疫熒光分析進一步證實了S - surg+PTT+IT組中P - MEK和P - ERK表達的顯著下調(diào)（圖7F），表明S - surg+PTT+IT治療抗GBM效應的可能機制之一是MEK/ERK信號通路的抑制。

圖7 轉錄組分析抗腫瘤機制。（A）顯示PBS組和S-surg+PTT+IT組腫瘤基因表達重疊的維恩圖；（B）PBS組和S-surg+PTT+IT組腫瘤中上調(diào)和下調(diào)基因的火山圖；（C）顯示差異表達免疫相關基因的熱圖；（D）PBS組和S-surg+PTT+IT組上調(diào)和下調(diào)基因簇的KEGG富集分析；（E）各組腫瘤組織中HIF - 1α、MEK、P - MEK、ERK、P - ERK、PI3K、AKT和P - AKT的表達的Western印跡；（F）GBM組織中P - MEK和P - ERK的免疫熒光染色，標尺=20μm