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針對(duì)上述問題，東南大學(xué)張?zhí)熘淌趫F(tuán)隊(duì)開發(fā)了3DPF貼片，其核心材料為4arm-PLGA-GPO（4A-GPO），由GPO肽序列與4armPLGA偶聯(lián)合成，可增強(qiáng)生物活性和機(jī)械性能。貼片封裝bFGF刺激細(xì)胞增殖和遷移，抗菌層由大黃素和妥布霉素組成。體內(nèi)研究顯示，3DPF貼片減少纖維化和粘連，促進(jìn)血管生成和膠原蛋白沉積，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)加速組織修復(fù)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，貼片下調(diào)IL-17介導(dǎo)的炎癥途徑，上調(diào)細(xì)胞粘附分子相關(guān)途徑。分子對(duì)接研究表明，貼片與VEGF和COL3等關(guān)鍵分子相互作用，增強(qiáng)血管生成和基質(zhì)重塑。相關(guān)成果于2025年5月2日以《Collagen-Inspired 3D Printing Electrospinning Biomimetic Patch for Abdominal Wall Defect Regeneration》發(fā)表在《Advanced Fiber Materials》（DOI：10.1007/s42765-025-00547-4）。

研究示意圖

(1) 4A-GPO 的設(shè)計(jì)與表征

通過固相肽合成（SPPS）方法合成GPO三肽。圖1a展示了將GPO三肽共軛到4A聚合物上的合成路線。圖1b顯示GPO化學(xué)結(jié)構(gòu)由甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸組成。圖1c的圓二色性（CD）光譜在220 nm附近呈現(xiàn)負(fù)峰，表明存在β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。圖1d顯示不同濃度GPO的紫外-可見吸收光譜，吸光度隨濃度增加而上升。圖1e展示了4A-GPO的結(jié)構(gòu)，表明GPO成功共軛到4A上。圖1f的1H-NMR光譜和圖1g的FTIR光譜進(jìn)一步驗(yàn)證了4A-GPO的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖1h的熱重分析（TGA）顯示GPO在約200°C下穩(wěn)定，4A在約280°C下穩(wěn)定。圖1i和j的溶血試驗(yàn)顯示4A-GPO的溶血率低于5%，表明其生物相容性良好。

圖1 4A-GPO的合成與表征。（a）4A-GPO的設(shè)計(jì)；（b）GPO的分子結(jié)構(gòu)；（c）GPO的CD光譜；（d）GPO的紫外-可見光譜；（e）4A-GPO的分子結(jié)構(gòu)；（f）4A、GPO和4A-GPO的1H-NMR光譜；（g）4A、GPO和4A-GPO的FTIR光譜；（h）4A、GPO和4A-GPO的TGA光譜；（i）和（j）4A和4A-GPO的體外溶血實(shí)驗(yàn)

（2）乳液納米纖維支架的設(shè)計(jì)與表征

圖2a展示了bFGF@4A-GPO的制備過程，bFGF通過W/O乳液法封裝在4A-GPO中形成納米纖維支架。圖2b顯示4A-GPO組細(xì)胞密度高于對(duì)照組，表明其促進(jìn)細(xì)胞黏附，且bFGF@4A-GPO組細(xì)胞數(shù)量更多，定量分析也證實(shí)了這一點(diǎn)（圖2c），說明bFGF進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖。圖2d顯示bFGF@4A-GPO組細(xì)胞遷移能力最強(qiáng)，傷口閉合率約85%，顯著高于其他組。圖2f的活/死染色顯示4A-GPO和bFGF@4A-GPO組活細(xì)胞數(shù)量顯著增加。圖2g的DPPH清除結(jié)果表明4A-GPO中抗氧化成分中和了更多自由基，bFGF@4A-GPO活性最高，接近150%。圖2h顯示bFGF@4A-GPO組L929細(xì)胞存活率最高，顯著優(yōu)于其他組。

圖2 bFGF@4A-GPO的制備及表征。（a）bFGF@4A-GPO的制備及乳液納米纖維支架的制造流程；（b）貼片上培養(yǎng)的L929細(xì)胞的光學(xué)圖像；（c）細(xì)胞數(shù)量定量結(jié)果；（d）劃痕試驗(yàn)的熒光染色圖像；（e）傷口閉合百分比；（f）貼片上培養(yǎng)24小時(shí)的L929細(xì)胞的活/死染色分析；（g）DPPH的紫外-可見光譜；（h）與貼片共培養(yǎng)不同時(shí)間后L929細(xì)胞的存活率

（3）3DPF 貼片的制備與表征

圖3a展示了仿生3DPF貼片的制備流程：先用PCL和Lys通過3D打印構(gòu)建宏觀支架結(jié)構(gòu)，再通過乳液靜電紡絲技術(shù)在支架上制備含bFGF@4A-GPO的修復(fù)層，最后涂覆包含大黃素和妥布霉素的抗菌層。圖3b為3D打印層的SEM圖像，顯示纖維直徑分布均勻。圖3c統(tǒng)計(jì)顯示，3D打印層平均纖維直徑約625.9μm，多在500–700μm范圍內(nèi)，有助于維持結(jié)構(gòu)完整性和生物學(xué)功能，促進(jìn)細(xì)胞滲透并提供機(jī)械支撐。修復(fù)層水接觸角為67.8°（圖3d），親水性利于液體滲透、GPO/bFGF釋放及細(xì)胞黏附增殖，其平均纖維直徑209.3nm（圖3e），纖細(xì)結(jié)構(gòu)及高表面積體積比利于細(xì)胞附著?？咕鷮铀佑|角128.8°（圖3f），疏水性可保護(hù)結(jié)構(gòu)免受水分侵蝕，避免抗菌效能下降，平均纖維直徑416.9nm（圖3g）。圖3h對(duì)比P貼片與3DPF貼片的力學(xué)性能應(yīng)力-應(yīng)變曲線：P貼片延展性好，可承受高達(dá)700%的應(yīng)變，應(yīng)力峰值約3.5MPa；3DPF貼片在應(yīng)變約160%時(shí)應(yīng)力達(dá)9MPa左右，延展性和強(qiáng)度均優(yōu)于P貼片，多層結(jié)構(gòu)提升了力學(xué)性能，滿足強(qiáng)度與柔韌性的平衡需求。圖3i的光學(xué)圖像顯示3DPF貼片宏觀形態(tài)均勻，彎曲不斷裂，兼具微觀結(jié)構(gòu)功能性與宏觀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，對(duì)生物應(yīng)用中的實(shí)際效能至關(guān)重要。

圖3 3DPF貼片的制備與表征。（a）通過3D打印和靜電紡絲技術(shù)制備3DPF貼片的示意圖；（b）頂層（3D打印層）的SEM圖像及水接觸角觀測(cè)；（c）頂層纖維直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果；（d）層（抗菌層）的SEM圖像及水接觸角觀測(cè)；（g）底層纖維直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果；（h）P貼片與3DPF貼片的力學(xué)性能對(duì)比；（i）3DPF貼片的柔韌性展示

（4）3DPF 貼片的體外生物相容性與抗菌性能

圖4a展示了3DPF貼片與細(xì)胞共培養(yǎng)的示意圖。圖4b為3DPF貼片與細(xì)胞共培養(yǎng)的光學(xué)顯微鏡圖像。3D打印層構(gòu)建了支架的整體形態(tài)和多孔結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸至關(guān)重要。納入具有特定生物活性的納米纖維（如bFGF@4A-GPO）可模擬細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），增強(qiáng)細(xì)胞黏附、遷移和分化。圖4c通過分子對(duì)接分析揭示了3DPF材料與整合素之間的相互作用機(jī)制。圖4d、e和f展示了3DPF在不同時(shí)間點(diǎn)（24小時(shí)和72小時(shí)）對(duì)細(xì)胞增殖的影響，與對(duì)照組相比，3DPF顯著提高了細(xì)胞存活率和增殖率?；?死染色結(jié)果顯示，3DPF組細(xì)胞密度和形態(tài)更均勻，活細(xì)胞活性的綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。圖4g展示了3DPF對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果，其通過釋放EMO和妥布霉素以及疏水性表面結(jié)構(gòu)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。圖4h的瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3DPF在瓊脂平板上形成了明顯的抗菌區(qū)。圖4i的抗菌活性平板計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)3DPF處理后細(xì)菌菌落數(shù)量顯著減少，兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)均被完全抑制。

圖4 3DPF貼片的細(xì)胞培養(yǎng)與抗菌性能。（a）3DPF貼片引導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)的示意圖；（b）在3DPF貼片上培養(yǎng)的L929細(xì)胞的光學(xué)圖像；（c）基于能量最小化的整合素與GPO組裝的分子對(duì)接圖像；（d）在3DPF貼片上培養(yǎng)24小時(shí)和72小時(shí)的L929細(xì)胞的光學(xué)圖像；（e）在貼片上培養(yǎng)24小時(shí)和72小時(shí)的L929細(xì)胞的活/死染色分析；（f）與貼片共培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后L929細(xì)胞的存活率；（g）3DPF貼片抗菌性能的示意圖；（h）3DPF貼片的抗菌環(huán)試驗(yàn)；（i）用3DPF貼片處理的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌懸浮液的瓊脂平板照片

（5）3DPF 貼片在腹壁缺損模型中的治療效果

圖5a為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述，大鼠在D0接受腹壁缺損手術(shù)，切口長(zhǎng)度10mm，分別在D7、D14和D30收集組織樣本。圖5b展示了使用四種貼片（對(duì)照組、P貼片、3DP貼片和3DPF貼片）治療的大鼠腹壁修復(fù)愈合進(jìn)程。D7時(shí)，對(duì)照組修復(fù)程度最低且存在粘連，而其他三組未出現(xiàn)粘連，3DPF貼片組傷口部位血管生成增加。D14時(shí)，對(duì)照組仍存在粘連，其他三組表面光滑，3DPF貼片組修復(fù)平整且無粘連。D30時(shí)，對(duì)照組因過度修復(fù)形成粘連，其他三組愈合情況改善，3DPF貼片組形成新的光滑腹膜，且在任何時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)粘連。

圖5c顯示小鼠術(shù)后恢復(fù)期間體重逐漸增加，表明材料未引起顯著毒性或全身性不良反應(yīng)。圖5d為30天后貼片植入?yún)^(qū)域的粘連評(píng)分，對(duì)照組評(píng)分最高，P貼片組次之，3DP貼片和3DPF貼片組評(píng)分最低，3DPF貼片組在減少粘連方面顯著優(yōu)于其他組。

圖5e的H&E染色結(jié)果顯示，對(duì)照組存在粘連、大量中性粒細(xì)胞聚集和炎癥浸潤(rùn)，纖維分布松散不均勻；P貼片組有一定愈合潛力，但存在輕度炎癥；3DP貼片組組織愈合改善，炎癥減輕；3DPF貼片組組織愈合完全，炎癥反應(yīng)顯著減少，且有細(xì)胞增殖、膠原沉積和新生血管形成。

圖5f的Masson染色結(jié)果顯示，對(duì)照組膠原纖維排列紊亂、密度低；P貼片組纖維化和膠原沉積減少；3DP貼片組纖維結(jié)構(gòu)略有改善；3DPF貼片組膠原纖維排列規(guī)則、密度增加，定量結(jié)果表明其膠原密度最高。

圖5g的天狼星紅染色結(jié)果顯示，隨著時(shí)間推移，對(duì)照組和P貼片組中I型膠原占主導(dǎo)，P貼片組膠原表達(dá)高于對(duì)照組。圖5h的免疫熒光分析顯示，與對(duì)照組相比，P貼片組的CD31和Ki67表達(dá)增加；3DP貼片組CD31表達(dá)進(jìn)一步上升；3DPF貼片組CD31和Ki67表達(dá)最高，顯著促進(jìn)血管生成和細(xì)胞增殖。

圖5i的免疫組織化學(xué)分析顯示，對(duì)照組TNF-α和IL-6信號(hào)較強(qiáng)，P貼片組信號(hào)減弱，3DP貼片組進(jìn)一步減弱，3DPF貼片組信號(hào)最弱，炎癥顯著減少。這些結(jié)果表明，3DPF貼片有效減少了粘連形成、膠原沉積、血管生成、細(xì)胞增殖和炎癥，且未對(duì)小鼠正常生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，是治療腹壁缺損的有前途的抗粘連材料。

圖5 腹壁缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（a）腹壁缺損實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖；（b）不同貼片治療的腹壁缺損照片；（c）修復(fù)后大鼠的體重變化；（d）粘連形成評(píng)估；（e）H&E染色的組織學(xué)圖像；（f）M&T染色及切片中膠原的定量分析；（g）天狼星紅染色圖像及膠原沉積定量分析；（h）免疫熒光染色評(píng)估（藍(lán)色：DAPI，紅色：CD31，綠色：Ki67）及定量分析；（i）IL-6和TNF-α免疫組化染色分析及定量分析

（6）3DPF 貼片組織修復(fù)的潛在機(jī)制

圖6a展示了各組中iNOS（M1型標(biāo)志物，綠色）和CD206（M2型標(biāo)志物，紅色）的表達(dá)情況，結(jié)果顯示3DP和3DPF組顯著向M2型極化，而對(duì)照組和P組含有更多M1型巨噬細(xì)胞。圖6b的統(tǒng)計(jì)分析表明，iNOS陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，CD206陽(yáng)性細(xì)胞增加，3DPF組最為明顯，說明3DPF可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。圖6c闡釋了巨噬細(xì)胞極化機(jī)制，M1型誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，M2型介導(dǎo)抗炎與修復(fù)功能，分子對(duì)接顯示GPO通過與CD206的特定位點(diǎn)形成氫鍵，增強(qiáng)M2型極化及其抗炎作用。

圖6d的火山圖顯示3DPF組中有853個(gè)基因上調(diào)、648個(gè)基因下調(diào)，表明其在基因水平上對(duì)組織修復(fù)相關(guān)過程進(jìn)行了廣泛調(diào)控。圖6e的熱圖突出顯示了3DPF誘導(dǎo)的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄組變化。圖6f的KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，3DPF顯著參與吞噬作用、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞黏附等通路。圖6g的GO富集分析進(jìn)一步將3DPF的作用與組織修復(fù)和再生相關(guān)功能聯(lián)系起來。

圖6h的GSEA分析顯示，IL-17信號(hào)通路的富集分?jǐn)?shù)為負(fù)值（NES=-2.18），表明該通路受到抑制，3DPF組的促炎環(huán)境得到改善；細(xì)胞黏附分子通路高度激活（NES=2.0053），提示細(xì)胞黏附、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)重塑能力增強(qiáng)。

圖6i通過分子對(duì)接分析展示了3DPF組與關(guān)鍵分子（包括COL3、肌動(dòng)蛋白和VEGF）的作用機(jī)制，表明3DPF可通過與這些分子結(jié)合來增強(qiáng)其生物活性或穩(wěn)定性，從而促進(jìn)組織修復(fù)的多種機(jī)制，尤其是在傷口愈合、軟組織修復(fù)和血管生成方面。

圖6 3DPF補(bǔ)片在組織修復(fù)中的潛在機(jī)制。（a）CD206、iNOS的免疫熒光染色及（b）定量分析；（c）巨噬細(xì)胞極化示意圖及基于能量最小化的CD206與GPO組裝的分子對(duì)接圖像；（d）差異表達(dá)基因火山圖；（e）層次聚類分析后表達(dá)水平熱圖；（f）KEGG通路富集分析；（g）3DPF組與對(duì)照組之間差異表達(dá)基因的功能注釋；（h）IL-17信號(hào)通路和細(xì)胞黏附分子的GSEA圖；（i）基于能量最小化的COL3、Actin和VEGF與GPO組裝的分子對(duì)接圖像